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문제 정의
- 따라서 본 실험에서는 이러한 중금속에 대한 식물의 적응기작을 이해하기 위한 기초자료를 제공하고자 담배의 캘러스를 재료로 카드뮴, p-fluorophenylalanine 을 단독, 조합처 리하여 형성된 각각의 저항성 세포주로부터 카드뮴이 고농도로 포함된 경화배지에서 경화시켰다. 경화 후 선발된 세포주로부터 식물체 재생을 유도하였으며, 유도된 식물체를 각 조직 (잎, 줄기, 뿌리)별로 분류한 후 단백질 유형을 비교 분석하였다.
제안 방법
- 저항성세포주 선발을 위한 선발배지로는 2.0mg/L2, 4-D와 0.1 mg/L BAP가 첨가된 MS배지를 pH 5.8로 맞춘 후 카드뮴은 0〜2, 000 M의 농도로 첨가하였으며, p-fluoropheny- lalanine은 0〜200 "M의 필요농도로 첨가한 후 pH를 조절하고 습열멸균을 실시하였다. 카드뮴과 p-fluorophenylala- nine 혼합 선발배지는 위와 동일방법을 사용하였으며 습열멸균 후에 1회용 페트리디쉬에 25 mL씩 분주한 후 low melting agarose (LMA)를 사용하여 2 mL씩 도말하였다.
- 5% AMPS, TEMED로 중합시킨 후 시료를 각각 5 채취하여 영동에 사용하였다. Gel calibration은 저분자 marker# 사용하였고 전기영동이 끝난 SDS-PAGE를 10% TCA로 20분간 단백질을 고정시킨 후은염색법으로 염색하였다(Figure. 1).
- 경화배지에서 경화시켰다. 경화 후 선발된 세포주로부터 식물체 재생을 유도하였으며, 유도된 식물체를 각 조직 (잎, 줄기, 뿌리)별로 분류한 후 단백질 유형을 비교 분석하였다.
- 8로 맞춘 배지에 치상하여 온도 25±1℃ 조도 1, 900 lux, 광주기는 16/8h의 조건에서 캘러스를 유도하였다. 그 후 형성된 캘러스를 식물체 재생에 미치는 2, 4-D의 영향을 감소시키고자 BAP와 kinetin을 조합처리 하여 계대배양을 실시하였으며, 현탁배양은 캘러스를 1, 000/an 망에 통과시켜 세포괴의 크기를 일정하게 한 후 생장조절물질은 계대배양과 같은 동일조건으로 처리하였다, 배양조건으로는, shaking incubator에서 25 rpm, 온도 25 ± 1℃로 배양하였다.
- 기내에서 증식된 반수체와 카드뮴 스트레스로부터 재생된 식물체를 잎, 줄기, 뿌리로 분리한 후 800 mg씩 넣고 액체질소로 동결시켜서 유발과 유봉으로 균질화 시킨 후 O'Farrell buffer (O'Farrell 1975)를 첨가하여 실온에서 30분간 방치하였다. 이것을 15, 000rpm으로 10분간 원심분리시켜 상등액을 취한 후 Bradford 방법 (1977)으로 단백질함량을 정량하였다.
- 담배 (Nicotiana tabacum cv. BY4)5] 약을 Nakata배지에 치상하여 반수체식물을 유도하였고, 반수체와 이배체 식물의 잎절편으로부터 0.5 mg/L 2, 4-D가 첨가된 MS 배지에서 캘러스를 유도하였다. 이배체와 반수체의 캘러스를 배양 4주 후 2.
- 이때의 캘러스의 색깔은 대체로 Cd" 500 의 경우에 있어서는 대체로 어두운 녹색으로 회색빛이 침적되는 경우를 볼 수 있었으나, Cd** 1, 000 첨가된 처리구에서는 연한 노란색으로 세포의 생장이 정지되는 경우를 볼 수 있었다. 반수체인 경우에 있어서 PFP50//M 에서 선발된 세포주를 카드뮴이 고농도인 500M에서 경화시킨 후 식물체재생 조건으로 옮겼고 Cd++ 200 /zM, PFP 50 M과 Cd++ 100 ;lM이 조합처리된 것을 같은 방법으로 실시하였다. 이때 카드뮴이 첨가된 처리구에서는 전혀 식물체 재생이 일어나지 않았지만 카드뮴이 첨가 되지 않은 BAP 0.
- 8), 1% SDS, 5% jS-mercap- toethanol)를 넣어서 3분간 100℃에서 SDS 처리하였다. 분리겔은 12% acrylamide 1.5 M Tris-Hcl (pH 8.8), 1% sodium dodecyl sulfate, 1.5% ammonium persulfate (AMPS), TEMED를 중합하여 만들었다. 농축겔은 4% acrylamide 80 mM Tris-HCl, 1% SDS, 1.
- 도말 배양 30일 후 형성된 저항성 세포주를 선발하여 경화시키기 위해 카드뮴을 500 M과 1, 000 qM 을 처리한 다음 500 M에서 세포주를 선발하였다. 선발된 세포주를 0.5, 1.5, 2.0 mg/L BAP 단독 및 500 과 1, 000 의 카드뮴이 첨가된 BAP와 auxin의 조합처리구에서 식물체 재생을 유도하였다. 이때 식물체 재생은 카드뮴이 첨가되지 않은 처리구에서 일어났으며, 이배체인 경우에는 카드뮴 단독처리시 선발된 세포주에서, 반수체인 경우에는 카드뮴과 PFP 조합처리시 선발된 세포주에서 식물체 재생이 일어났다.
- 이때 식물체 재생은 카드뮴이 첨가되지 않은 처리구에서 일어났으며, 이배체인 경우에는 카드뮴 단독처리시 선발된 세포주에서, 반수체인 경우에는 카드뮴과 PFP 조합처리시 선발된 세포주에서 식물체 재생이 일어났다. 세포의 생장이 왕성한 카드뮴 500 a/M의 것을 선발하여 식물체를 재생시켰고, 재생된 식물체의 잎, 줄기 및 뿌리의 단백질 유형을 분석하였다. 대조구로서는 스트레스를 받지 아니한 식물체를 사용하였다.
- 온실내에서 유지되고 있는 이배체와 식물체의 발달 정도가 다른 화아를 각각 선별하여 활성탄 (3 g/L)이 첨가된 Nakata 배지 (Nakata and Kurihara 1972)에 치상한 후, 온도 25± 1℃, 조도 1, 900 lux, 광주기는 16/8h의 조건에서 배양하였다. 약배양을 통해 유도된 반수체식물의 증식은 유리화현상을 제거하기 위해 1~3개의 소식물체로 나누어 발근배지로 옮겨주어 증식시켰다.
- 5 mg/L 2, 4-D가 첨가된 MS 배지에서 캘러스를 유도하였다. 이배체와 반수체의 캘러스를 배양 4주 후 2.0 mg/L 2, 4-D와 0.1 mg/L BAP, 2.0 mg/L Kinetin 이 조합처리된 MS기본배지에서 계대배양 및 현탁배양을 실시하였다. 현탁배양된 세포들을 100 “이와 65 “이의 나일론 망으로 걸러서 0.
- 이배체인 경우에 있어서 PFP100M에서 선발된 세포주를 카드뮴이 고농도인 500에서 경화시킨 후 식물체재생을 유도하였고, Cd++ 300 M, PFP 50 과 Cd++ 200 이 조합처리된 것을 같은 방법으로 실시하였다. 이때 카드뮴이 첨가된 처리구에서는 전혀 식물체재생이 일어나지 않았지만 카드뮴이 첨가 되지 않은 BAP 1.
- 증식시킨 후 식물체의 근단으로부터 염색체를 관찰하였던 바 염색체간 반감이 되어 있음을 확인할 수 있었다. 주맥을 제거한 잎절편을 MS기본배지에 sucrose 30 g/L, agar 8 앙를 첨가하고 생장조절물질인 2, 4-D를 0.1, 0.5, 1.0, 2.0, 4.0mg/L의 농도로 단독처리하였고 pH 5.8로 맞춘 배지에 치상하여 온도 25±1℃ 조도 1, 900 lux, 광주기는 16/8h의 조건에서 캘러스를 유도하였다. 그 후 형성된 캘러스를 식물체 재생에 미치는 2, 4-D의 영향을 감소시키고자 BAP와 kinetin을 조합처리 하여 계대배양을 실시하였으며, 현탁배양은 캘러스를 1, 000/an 망에 통과시켜 세포괴의 크기를 일정하게 한 후 생장조절물질은 계대배양과 같은 동일조건으로 처리하였다, 배양조건으로는, shaking incubator에서 25 rpm, 온도 25 ± 1℃로 배양하였다.
- 카드뮴과 PFP에 대해 스트레스를 받은 반수체 식물과 대조구로서 스트레스를 받지 않은 반수체 식물의 잎, 줄기, 뿌리를 분리하여 단백질유형을 비교 분석하였다. 수용성 단백질의 함량은 Bradford방법으로 정량하였고, 그 함량은 재생된 식물체의 잎, 줄기는 대조구보다는 높았으나 뿌리에 있어서는 낮은 경향을 나타내었다.
- 8로 맞춘 후 카드뮴은 0〜2, 000 M의 농도로 첨가하였으며, p-fluoropheny- lalanine은 0〜200 "M의 필요농도로 첨가한 후 pH를 조절하고 습열멸균을 실시하였다. 카드뮴과 p-fluorophenylala- nine 혼합 선발배지는 위와 동일방법을 사용하였으며 습열멸균 후에 1회용 페트리디쉬에 25 mL씩 분주한 후 low melting agarose (LMA)를 사용하여 2 mL씩 도말하였다.
- 카드뮴이 고농도 (500~2, 000 M)로 첨가된 배지에서 경화된 세포주를 가지고 BAP 단독, BAP와 IAA, NAA, IAA 조합처리, 그리고 카드뮴이 첨가된 BAP 단독, BAP와 IAA, NAA가 조합처리된 MS배지에 치상하여 식물체를 유도하고자 하였다.
대상 데이터
- 캘러스가 형성되지 않았다. 이들 카드뮴과 PFP를 조합 처리하여 형성된 저항성 세포주는 이배체는 Cd" 200 “M+PFP 50 M 처리구에서, 반수체는 Cd++ 100 /zM+PFP 50 AIM 처리구에서 선발된 세포주를 선발하였다. 이때 각 처리 구에서 선발된 세포주를 각각 카드뮴 500, 1, 000, 2, 000 의 농도로 옮겨주어 카드뮴저항성세포주를 선발하였고 그 특성을 조사하였을 때, 카드뮴 저항성을 띤 반수체 및 이배체 유래 캘러스의 경우에는 각각 카드뮴의 농도가 증가할수록 생중량은 감소하였으나, 건조중량은 증가하였다.
- 선발된 colony를 카드뮴이 고농도 (5002000 "M) 로 첨가된 배지에 옮긴 후 30~40일간 경화시켰다. 경화 후 세포의 증식이 비교적 양호한 500//M의 처리구를 선발하였다.
- 5% ammonium persulfate (AMPS), TEMED를 중합하여 만들었다. 농축겔은 4% acrylamide 80 mM Tris-HCl, 1% SDS, 1.5% AMPS, TEMED로 중합시킨 후 시료를 각각 5 채취하여 영동에 사용하였다. Gel calibration은 저분자 marker# 사용하였고 전기영동이 끝난 SDS-PAGE를 10% TCA로 20분간 단백질을 고정시킨 후은염색법으로 염색하였다(Figure.
- 세포의 생장이 왕성한 카드뮴 500 a/M의 것을 선발하여 식물체를 재생시켰고, 재생된 식물체의 잎, 줄기 및 뿌리의 단백질 유형을 분석하였다. 대조구로서는 스트레스를 받지 아니한 식물체를 사용하였다.
- 8% low melting agarose를 사용하여 카드뮴과 PFP가 조합된 선발배지에 도말하였다. 도말 배양 30일 후 형성된 저항성 세포주를 선발하여 경화시키기 위해 카드뮴을 500 M과 1, 000 qM 을 처리한 다음 500 M에서 세포주를 선발하였다. 선발된 세포주를 0.
- 본 실험의 식물재료는 온실내에서 유지되고 있는 담배(Nicotiana tabaccum L. cv. BY4)2} 약배 양으로부터 유도된 반수체의 잎절편으로부터 유도된 캘러스를 사용하였다.
- 이중에서 실험목적상 육종에 유리한 반수체유래 캘러스로부터 카드뮴과 p-fluorophenylalanine 가 조합처리된 처리구에서 선발된 캘러스를 본 실험에 사용하였다. 이에 유리화 현상이 일어난 소식물체들을 하나하나 분리하여 (Figure.
- 그리고 PFP 단독처리시에는 이배체인 경우 100 , 반수체인 경우 50 M이었다. 조합 처리된 처리구에서 선발된 세포주에 있어서 이배체인 경우에 있어서는 카드뮴 200 “M과 PFP50//M의 조합처리구에서, 반수체인 경우 카드뮴 100 “M과 PFP50AIM의 조합처리구에서 저항성 세포주를 선발하였다. 선발된 colony를 카드뮴이 고농도 (5002000 "M) 로 첨가된 배지에 옮긴 후 30~40일간 경화시켰다.
- 카드뮴과 p-fluorophenylalanine < 단독, 조합처리하여 생육최하저해농도 (MIC)에서 저항성 세포주를 선발하였다. 선발된 세포주를 가지고 고농도의 카드뮴이 처리된 선발 배지에서 경화시 킨 후 세포증식 이 비교적 양호한 각각 500 mM 처리구의 것으로부터 식물체 재생이 유도되었다.
이론/모형
- 분리하여 단백질유형을 비교 분석하였다. 수용성 단백질의 함량은 Bradford방법으로 정량하였고, 그 함량은 재생된 식물체의 잎, 줄기는 대조구보다는 높았으나 뿌리에 있어서는 낮은 경향을 나타내었다. 단백질 밴드분석은 Laemmli 방법으로 일차원 SDS-PAGE를 수행하였던 결과 단백질 밴드는 공통단백질 밴드, 사라진 밴드, 합성된 밴드가 다양하게 나타났다.
- 이것을 15, 000rpm으로 10분간 원심분리시켜 상등액을 취한 후 Bradford 방법 (1977)으로 단백질함량을 정량하였다. 또한 SDS-PAGE를 위하여 Laemmli buffer (Laemmli 1970), 80 mM Tris-HCl (pH 6.
성능/효과
- 녹색을 나타내거나, 거의 생장을 하지 않았다. Cd*+ 500 M과 BAP 단독, BAP와 IAA를 조합처리한 처리구에서 형성된 색깔은 대체로 녹색과 회색빛 녹색을 나타내었고, 마찬가지로 Cd" 1, 000 과 BAP 단독, BAP와 IAA를 조합처리한 처리구에서 형성된 캘러스도 생장이 저조하며 색깔은 거의 같은 색을 나타내었으며 이 처리구 역시 생장은 저조하였다.
- 0mg/L에서와 비슷한 조건으로 이루어졌다. Cd++ 500M과 BAP 단독, BAP와 IAA를 조합처리한 처리구에서 형성된 색깔은 대체로 녹색이었으나 조건에 따라서는 회색빛이 침적된 녹색으로 나타났으며 지속적인 관찰 결과 거의 진한 회색으로 되어 생장이 정지되었다. 그리고 Cd** 1, 000 /1M과 BAP 단독, BAP 와 IAA를 조합처리한 처리구에서 형성된 캘러스는 생장이 저조하며 색깔은 대체로 옅은 연두색에서 노란색을 나타내었다.
- PFP 100 처리구에서 선발되어 증식된 캘러스를 Cd++ 500과 BAP 그리고 IAA가 첨가된 조건에서는 대체로 연두색을 나타내었으나 Cd++ 1, 000 이 첨가된 BAP와 IAA가 첨가된 처리구에서는 세포의 생장이 저조하였고 색깔도 연두색 계통으로 식물체 재생률은 대체로 낮았다. 그러나 Cd++ 1, 000 M과 BAP 단독처리된 처리구에서는 세포가 생장을 하지 않고 거의가 죽었으며, 세포의 색깔은 무색에 가까왔다.
- 수용성 단백질의 함량은 Bradford방법으로 정량하였고, 그 함량은 재생된 식물체의 잎, 줄기는 대조구보다는 높았으나 뿌리에 있어서는 낮은 경향을 나타내었다. 단백질 밴드분석은 Laemmli 방법으로 일차원 SDS-PAGE를 수행하였던 결과 단백질 밴드는 공통단백질 밴드, 사라진 밴드, 합성된 밴드가 다양하게 나타났다.
- 재생된 식물체로부터 단백질 유형을 비교분석하였던 바, 카드뮴에 스트레스를 받아 재생된 식물체의 잎과 줄기에서는 스트레스를 받지 않은 식물체보다 수용성 단백질의 함량은 높았으나 뿌리에서는 반대의 경향을 나타내었다. 단백질 유형에서는 스트레스를 받은 식물체의 잎에서 83.4 KD 등 3 개, 줄기에서는 128.7 KD 등 6개, 뿌리에서는 83.4 KD 등 5개의 단백질이 나타났음을 알 수 있었다. 이렇게 카드뮴 스트레스에 의해 형성된 단백질은 대조구로 사용한 반수체 식물과는 차이가 있음을 알 수 있었으며 이러한 결과는 Gupta와 Goldsbrough (1990)의 보고와 일치하였다.
- 2E). 또한 정상식물체인 경우에 기내에서 많은 시간 키우면 배지의 고갈 등으로 노화가 일어나는데 식물체 재생된 식물체에서는 배지의 고갈 없이도 빠른 노화가 일어남을 알 수 있었다. 기내에서 성장이 좋은 처리구의 식물체를 선별하여 포트에 옮겨 심었다.
- 선발된 세포주를 가지고 고농도의 카드뮴이 처리된 선발 배지에서 경화시 킨 후 세포증식 이 비교적 양호한 각각 500 mM 처리구의 것으로부터 식물체 재생이 유도되었다. 식물체 재생은 카드뮴이 첨가되지 않은 처리구에서 일어났으며, 이배체인 경우에는 카드뮴 단독처리시 선발된 세포주에서, 반수체인 경우에는 카드뮴과 PFP 조합처리시 선발된 세포주에서 식물체재생이 일어났다. Choi와 Lee (1987)은 제초제인 glyphosate의 저항성 세포주를 선발, Kim과 Chae는 담배의 역병 저항성 세포주를 선발하여 식물체재생을 보고하였으나 대부분 캘러스 수준에서 선발되고 있고 완전한 식물체재생에 대한 보고는 미약한 실정이다.
- 이들 카드뮴과 PFP를 조합 처리하여 형성된 저항성 세포주는 이배체는 Cd" 200 “M+PFP 50 M 처리구에서, 반수체는 Cd++ 100 /zM+PFP 50 AIM 처리구에서 선발된 세포주를 선발하였다. 이때 각 처리 구에서 선발된 세포주를 각각 카드뮴 500, 1, 000, 2, 000 의 농도로 옮겨주어 카드뮴저항성세포주를 선발하였고 그 특성을 조사하였을 때, 카드뮴 저항성을 띤 반수체 및 이배체 유래 캘러스의 경우에는 각각 카드뮴의 농도가 증가할수록 생중량은 감소하였으나, 건조중량은 증가하였다.
- 약배양을 통해 유도된 반수체식물의 증식은 유리화현상을 제거하기 위해 1~3개의 소식물체로 나누어 발근배지로 옮겨주어 증식시켰다. 증식시킨 후 식물체의 근단으로부터 염색체를 관찰하였던 바 염색체간 반감이 되어 있음을 확인할 수 있었다. 주맥을 제거한 잎절편을 MS기본배지에 sucrose 30 g/L, agar 8 앙를 첨가하고 생장조절물질인 2, 4-D를 0.
- 카드뮴 처리시 이배체는 세포의 성장에 있어서 최하저해농도 (MIC; Minimum Inhibition Concentration)는 300 과 PFP는 100/zM 이었으며, 그 이상 농도처리구에서는 선발되지 않았으며, 반수체 역시 카드뮴 처리시 최하저해농도는 200 과 PFP는 50 이었으며, 마찬가지로 그 이상의 고농도에서는 캘러스가 형성되지 않았다. 이들 카드뮴과 PFP를 조합 처리하여 형성된 저항성 세포주는 이배체는 Cd" 200 “M+PFP 50 M 처리구에서, 반수체는 Cd++ 100 /zM+PFP 50 AIM 처리구에서 선발된 세포주를 선발하였다.
후속연구
- 없다. 만약 이에 대한 연구가 확립된다면 모델 생성에 필요한 자료가 제공되어, 인간건강과 환경에 대한 공업 활동의 영향을 예측할 수 있으며, 이미 오염된 장소를 안정시키며 다른 불량환경에도 응용범위가 확대되리라 사료된다.
- 이렇게 카드뮴의 스트레스로부터 유도된 단백질의 기능은 알려지지 않았으며, 이러한 단백질의 변화로 생리적으로 변화가 생겼음을 알 수 있었다. 앞으로 이러한 연구가 수행되어야 할 것이며, 앞으로 이러한 선발 방법으로 재생된 식물체를 야외에서 순화시켜 변이체 식물과도 비교해야 할 것으로 사료된다. 또한 Chaleff와 Carlson (1975)은 아미노산 유사체에 의하여 2차 대사산물이 증가하는데 이러한 것들은 특수한 유리아미노산의 축적과 관련되어 단백질과 아미노산의 비율의 변화에 관계하여 리신을 과잉생산하는 벼 세포주에서는 리신의 함량이 높음을 보고하였다.
- 있었다. 앞으로 이러한 연구는 새로운 생리, 생화학적 기술을 바탕으로 깊이 수행되어야 하며, 이러한 방법은 돌연변이 선발 및 응용범위를 확대시킬 수 있다고 사료된다.
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