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문제 정의
- 4) 본 연구자 등은 최근에 ALI 상태에서 사람의 비강 점막상피세포를 Tianswell의 insert위에 단층막으로 일차배양하는 기술을 확립하여 보고한 바 있다.5)본 연구의 목적은 이를 약물의 투과실험에 적용하기 위해서 견고한 tight jimction을 확립하기 위한 최적의 배양 조건을 찾고 이를 평가하는데 있다.
- 있다. 7-10) 따라서, insert에 비강점막세포를 seeding 한 후 4일째 되는 날 apical 쪽의 배지를 제거하고 ALI상태를 유지하였을 때, tight junction의 변화여부가 약물의 투과에 미치는 영향을 알아보고자 하였다.
- 이러한 약물의 비강점막투여 전후에 점액질의 분비 변화를 in vivo 상에서 관찰하는 실험계를 확립하는 것이 시급한 것으로 생각되며 이와 연관하여 약물이 점막상피세포를 투과하는 과정을 정량적으로 평가할 수 있는 가능성을 보여준 것이 본 연구의 커다란 의의라 할 수 있다. 그러나, 이상의 조건에서는 tight junction의 형성이 Caco-2 cell 만큼은 견고하지 않은 것으로 생각되며, 배지의 종류나 Ca++의 농도 등을 조절하는 실험을 현재 진행중이다.
제안 방법
- ALI 상태를 만들기 위해서 seeding 4일째 되는 날부터 apical 쪽의 배지를 제거하고 공기에 노출시켰으며, basolateral 쪽의 배지만 교환하였다.
- ALI 상태에서의 투과 실험은, ALI를 만든 3일 및 6일 후에 위와 같은 방법으로 시행하였다.
- 0 mL를 넣고 잘 섞은 후, liquid scintillation analyzer(TRI-CARB 2200CA, PACKARD, USA)를 사용하여 분석하였다. Budesonide samplee high-performance liquid chromatography(HPLC)를 사용하여 분석하였다. 사용한 HPLC는 binary pump(Gilson Model 305 and 306), automatic injector(Gilson Model 234), UV detector(Gilson Model 118)로 구성되어 있다.
- Petri dish에서 배양한 비강점막상피세포가 50-60%의 밀도를 이루었을 때, Clonetics사에서 제공하는 trypsin-EDlA를 사용하여 dish에 부착된 세포를 분리하였다. 비강 점막상피세포의 단충막을 통한 약물의 수송을 관찰하기 위해 TransweH (Corrmg Costa, 미국)의 insert에 분리된 세포를 seeding 하였다.
- 또한, polyester 재질의 3460과 3462가 polycarbonate 재질의 3401이나 3402보다 tight junctioir> 형성하기에 더 적당함을 알 수 있다. Pore size가 04㎛이고 polyester 재질을 가진 3460 insert에 비강점막세포를 seeding하였을 때 mannitol의 permeability coefficient가 6.61 × 10-5 cm/s로서 가장 낮았으므로 비강점막상피세포의 일차배양에 가장 적합함을 알 수 있었고 앞으로의 실험은 모두 이 insert를 사용하기로 하였다.
- “C-maM血tole 시료 300 ㎕에 cocktail(Ultima Gold, PACKARD) 2.0 mL를 넣고 잘 섞은 후, liquid scintillation analyzer(TRI-CARB 2200CA, PACKARD, USA)를 사용하여 분석하였다. Budesonide samplee high-performance liquid chromatography(HPLC)를 사용하여 분석하였다.
- 포매한 조직을 toluidine blue로 염색하고 적당한 부분의 선택하기 위해 semithin section(1000 nm)으로 자른 후, light microscopy로 관찰하였다. 그런 후 ultrathin section (50-60 nm)은 uranyl acetate와 lead citrate로 차례로 각각 6분과 3분간 염색하여 투과전자현미경(JEM 1200 EX Ⅱelectron microscopy)을 사용하여 관찰하였다.5)
- 5 μg/mL; Sigma)과 bovine pituitary extract (1% v/v; Pel-Freez Biologicals, Rogers, AR)도 보중하였다. 배양조건은 37℃, 5% CO2, 95% 상대습도를 유지하였으며 , 배지는 seeding 다음날 교환한 후 이틀마다 교환해 주었다.
- 채취한 조직은 1% protease(type XN, Sigma)와 peniciUin(50 lU/mL) 및 streptomycin (50μg/mL)을 함유한 Dulbecco's modified Eagle's medium과 Ham's nutrient F12의 1:1 혼합액(DMEM/F12)에 넣어 4℃에서 16-20시간동안 처리하였다. 분리된 세포를 항생제를 포함한 DMEMM12에서 3번 씻은 후, 항생제와 10% fetal bovine serum(FBS)를 함유한 DMEM/F12에 부유시킨 다음, 플라스틱 dish에 평판하여 37℃에서 1시간동안 정치해 점막상 피세포외의 섬유아세포, 내피세포 및 근세포를 바닥에 부착시켜 제거하였다. 부유된 점막세포들은 직경 10 cm의 plastic tissue culture dish 에 3×l04 ceHs/dish 의 밀도로 seeding 시켰다.
- 비강 점막상피세포의 단충막을 통한 약물의 수송을 관찰하기 위해 TransweH (Corrmg Costa, 미국)의 insert에 분리된 세포를 seeding 하였다. 이 때, insert의 직경(1.
- 비강점막상피세포가 iii&ert의 표면에 confluent layer를 형성했을 때 (seeding 4일 후), budesonide의 투과실험을 시행하였다. 우선 투과완충액(transport buffer; 15mM의 glucose 를 포함한 Hank's balanced salt solution)으로 monolayer를 씻은 후, 투과 완충액을 넣어 약 30분간 배양기에 넣어 안정화 시켰다.
- 비강점막세포를 Transwell0]] seeding한 3-4일 후에 완전한 합류를 이루었으며 위상차 현미경으로 관찰하였을 때 전형적인 상피세포의 형태를 나타내며 단층막을 형성하였다(data not shown). 이후에는 apical 쪽의 배지를 제거하여도 baso-lateral 쪽의 배지가 새어나오지 않은 것으로부터 tighit junction이 형성되었음을 일차적으로 알 수 있었다.
- 비강점막세포의 일차배양시 tight junction의 형성과 세포의 부착을 가장 잘 시킬 수 있는 inser를 찾기 위하여 Tranawell 3401(polycarbonate, 0.4 ㎛), 3402(polycarbonate, 3.0 ㎛), 3460(polyester, 0.4 ㎛), 3462(polyester, 3.0 ㎛)에 세포를 각각 seeding한 후 14C-mannitol의 transport를 관찰하여 tight junction의 형성 여부를 확인하였다. Figure 2에서는 시간에 따른 mannitol의 투과정도를 나타내었고 Figure 3에서는 세포의 단층막만을 통한 mannitol의 permeability coefficient를 계산한 결과를 종합하였다.
- 사람의 비강점막상피세포를 Transwell의 insert 위에 단층 막으로 일차배양하기 위한 최적의 조건을 찾기 위하여 insert의 직경, 재질, 및 pore size(0.4 ㎛와 3.0 ㎛)의 영향과 ing하는 cell의 밀도 등의 영향을 관찰하였다. Insert의 직경은 TEER값에 별다른 영향을 미치지 못하였으며 (data not shown), 또한 seeding density가 높은 경우(4×105 cells/ cm2)는 낮은 경우(8× 104 cells/cm2)보다 confluent layer를 2일 정도 빨리 형성하였을 뿐 permeability coefficient값과 TEER값에는 영향을 미치지 못하였다(data not shown).
- 사람의 비강점막세포는 부비강염 환자의 내시경을 이용한부비동 수술중에 정상 하비갑개의 점막을 채취하였으며, 조직의 배양은 본 연구자 등이 보고한 방법5)을 약간 변형하여 이용하였다. 채취한 조직은 1% protease(type XN, Sigma)와 peniciUin(50 lU/mL) 및 streptomycin (50μg/mL)을 함유한 Dulbecco's modified Eagle's medium과 Ham's nutrient F12의 1:1 혼합액(DMEM/F12)에 넣어 4℃에서 16-20시간동안 처리하였다.
- 세포단층의 integrity를 확인하기 위해, insert에세포를 seed-ing한 날부터 Endohm electrodes를 포함한 voltohmmeter (EVOM, World Precision Instiumeiits)를 사용해서 transepithelial electrical resistamce(TEER)값을 매일 측정하였다. 유효값(ohm × cm2)은 총 TEER값(insert + 세포단충)에서 insert만의 TEER값을 빼서 세포단층만의 TEER값을 구한 후, insert의 면적을 곱하여 구하였다.
- 측정하였다. 유효값(ohm × cm2)은 총 TEER값(insert + 세포단충)에서 insert만의 TEER값을 빼서 세포단층만의 TEER값을 구한 후, insert의 면적을 곱하여 구하였다. 각 실험은 3개의 well 의 값을 각각 측정하여 평균값을 구하였다.
- 비강 점막상피세포의 단충막을 통한 약물의 수송을 관찰하기 위해 TransweH (Corrmg Costa, 미국)의 insert에 분리된 세포를 seeding 하였다. 이 때, insert의 직경(1.2cm), 재질(polyester와 polycarbonate), pore size(0.4 ㎛와 3.0㎛) 및 cell의 밀도(8×104 cells/cm2과 4×105 cells/cm2) 등을 달리하여 최적의 배양조건을 찾도록 하였다. 위의 BEGM 배지를 apical쪽에 0.
- 부유된 점막세포들은 직경 10 cm의 plastic tissue culture dish 에 3×l04 ceHs/dish 의 밀도로 seeding 시켰다. 점막 세포의 수는 hemocytometer를 사용하여 측정했다. 배지는 bronchial epithelial growth medium(BEGM; Clonetics Corp.
- 채취한 조직은 1% protease(type XN, Sigma)와 peniciUin(50 lU/mL) 및 streptomycin (50μg/mL)을 함유한 Dulbecco's modified Eagle's medium과 Ham's nutrient F12의 1:1 혼합액(DMEM/F12)에 넣어 4℃에서 16-20시간동안 처리하였다. 분리된 세포를 항생제를 포함한 DMEMM12에서 3번 씻은 후, 항생제와 10% fetal bovine serum(FBS)를 함유한 DMEM/F12에 부유시킨 다음, 플라스틱 dish에 평판하여 37℃에서 1시간동안 정치해 점막상 피세포외의 섬유아세포, 내피세포 및 근세포를 바닥에 부착시켜 제거하였다.
- 5% ghitaldehyde로 4℃에서 4-6시간 동안 고정시킨 후, 1% OsO4(osmium teroxide)를 사용하여 4℃에서 1시간 동안 처리한 다음 ethanol로 단계적으로 탈수시키고 Epon 812에 포매하였다. 포매한 조직을 toluidine blue로 염색하고 적당한 부분의 선택하기 위해 semithin section(1000 nm)으로 자른 후, light microscopy로 관찰하였다. 그런 후 ultrathin section (50-60 nm)은 uranyl acetate와 lead citrate로 차례로 각각 6분과 3분간 염색하여 투과전자현미경(JEM 1200 EX Ⅱelectron microscopy)을 사용하여 관찰하였다.
대상 데이터
- 사용한 HPLC는 binary pump(Gilson Model 305 and 306), automatic injector(Gilson Model 234), UV detector(Gilson Model 118)로 구성되어 있다. Columne Merck C18 LiChroCART 125-4 column(5 |im, 125×4 mm, Merck, Darmstadt, Germany)를 사용하였다. 이동상은 70%(v/v) methanol을 사용했다.
- 점막 세포의 수는 hemocytometer를 사용하여 측정했다. 배지는 bronchial epithelial growth medium(BEGM; Clonetics Corp., San Diego, CA)을 사용하였으며, 보충액은 hydrocotisone(0.5 μg/mL), insulin(5 μg/mL), transferrin(10μg/mL), epinephrine (0.5μg/mL), triiodothyronine(6.5μg/mL), gentamycin(50μg/mL)과 amphotericin B(50μg/mL)을 Clonetics에서 구입하여 사용하였고, epidermal growth factor(25 ng/mL; Collaborative Research, Bedford, MA), all-trans retinoic acid (10-7M; Sigma Chemical Co., St Louis, MO), bovine serum albumin(1.5 μg/mL; Sigma)과 bovine pituitary extract (1% v/v; Pel-Freez Biologicals, Rogers, AR)도 보중하였다. 배양조건은 37℃, 5% CO2, 95% 상대습도를 유지하였으며 , 배지는 seeding 다음날 교환한 후 이틀마다 교환해 주었다.
- 공급받았다. 부데소나이드(budesonide)는 시그마(St. Louis, 미국)에서 구입하였고, HPLC용 메탄올과 아세토니트릴은 Merck(Damstadt, FRG)에서 구입한 후 0.22 ㎛ membrance으로 여과하고 sonication하여 기포를 충분히 제거한 후사용하였다. 그 외 다른 시약들은 특급시약 이상을 구입하여더 이상 정제하지 않고 사용하였다.
- 사람의 비강점막세포는 부산대학교 의과대학의 이비인후과에서 공급받았다. 부데소나이드(budesonide)는 시그마(St.
- Budesonide samplee high-performance liquid chromatography(HPLC)를 사용하여 분석하였다. 사용한 HPLC는 binary pump(Gilson Model 305 and 306), automatic injector(Gilson Model 234), UV detector(Gilson Model 118)로 구성되어 있다. Columne Merck C18 LiChroCART 125-4 column(5 |im, 125×4 mm, Merck, Darmstadt, Germany)를 사용하였다.
- Columne Merck C18 LiChroCART 125-4 column(5 |im, 125×4 mm, Merck, Darmstadt, Germany)를 사용하였다. 이동상은 70%(v/v) methanol을 사용했다. 유속은 1.
데이터처리
- 유효값(ohm × cm2)은 총 TEER값(insert + 세포단충)에서 insert만의 TEER값을 빼서 세포단층만의 TEER값을 구한 후, insert의 면적을 곱하여 구하였다. 각 실험은 3개의 well 의 값을 각각 측정하여 평균값을 구하였다.6)
- 약물의 투과계수이다. 모든 실험은 최소 3회 이상을 측정한 후 평균±표준편차로 나타내었다.
성능/효과
- p data-page="1">비강점막을 통한 약물의 전신투여 (systemic drug delivery)는 주사제와 경구투여를 대체할 수 있는 좋은 투여 방법으로서 과거 60년이 넘는 동안 많은 연구자들이 관심을 보여오고 있다.1) 비강점막 경로를 통한 약물 투여가 구강, 직장, 질점막 및 경피와 같은 비경구적 경로보다 상대적으로 높은 생체이용율을 나타내면서 근육주사와 비교되는 빠른 흡수속도를 보이고 또한 무엇보다도 환자들이 간편하고 통증 없이 약물을 투여할 수 있다는 점에서 약제학적으로 효용성이 높기 때문이다.2)실제 경구 투여가 힘든 펩타이드 제제의 경우 비강점막을 통한 약물의 투여는 아주 흥미있는 비경구투여의 한 방법으로 알려져 있다.
- 7-10)본 실험에서도 apical 쪽의 배지를 제거하여 ALI 상태로 하였을 때, seeding 4일째에 최고값을 나타내었다가 감소하던 TEER값이 오히려 약간 증가하는 현상을 보였다(Figure 4). 14C-mannitol을 통한 투과 실험에서도 ALI 상태를 만든 후 3일째 되는 날의 투과도는 ALI를 만들기 직전 보다 더욱 줄어드는 것을 관찰하였다(Fig页e 5), 14Cmannitole paracellular 경로만을 통하여 투과되는 것으로 알려져 있으므로6.11)공기와의 접촉을 통한 자극으로 인해 분화가 더욱 촉진되어 세포단층의 tight junction이 더욱 견고해졌음을 알 수 있었다.8.
- 14Cmannitol의 투과에서와 같이, ALI 상태를 만든 3일 후에 budesonide의 투과는 현저히 감소하였으며, 6일 후에는 3일째와 유의성 있는 차이가 없었다(Table Ⅰ).
- Seeding 후 TEER 값은 점차 상승하여 4일 째되는 날에 최대값(80 ohm × cm2) 을 나타내고, 그 이후 조금씩 감소하는 경향을 보여주고 있다. ALI상태가 TEER값에 미치는 영향을 알아보기 위해 TEER값이 최대를 나타내는 4일째부터 ALI상태로 하여 TEER값을 측정하여 본 결과, ALI상태에서 TEER값이 약간 증가하는 경향을 보여주고 있다.
- Figure 2에서는 시간에 따른 mannitol의 투과정도를 나타내었고 Figure 3에서는 세포의 단층막만을 통한 mannitol의 permeability coefficient를 계산한 결과를 종합하였다. Insert의 pore size와 재질에 따라 mannitol의 transport는 큰 차이를 나타내었는데 우선, pore size가 0.4|㎛인 3401과 3460이 pore size가 3.0 ㎛인 3402와 3462보다 mannitol의 투과가 덜함을 보여주고 있다. Pore size가 작을수록 cell들이 바닥에 더 잘 붙고, 잘 자란다는 것을 알 수 있었다.
- 0 ㎛인 3402와 3462보다 mannitol의 투과가 덜함을 보여주고 있다. Pore size가 작을수록 cell들이 바닥에 더 잘 붙고, 잘 자란다는 것을 알 수 있었다. 또한, polyester 재질의 3460과 3462가 polycarbonate 재질의 3401이나 3402보다 tight junctioir> 형성하기에 더 적당함을 알 수 있다.
- Insert의 직경은 TEER값에 별다른 영향을 미치지 못하였으며 (data not shown), 또한 seeding density가 높은 경우(4×105 cells/ cm2)는 낮은 경우(8× 104 cells/cm2)보다 confluent layer를 2일 정도 빨리 형성하였을 뿐 permeability coefficient값과 TEER값에는 영향을 미치지 못하였다(data not shown). 그러나, Caco-2 cell의 배양에 많이 이용되는 polycarbonate 재질보다는 polyester 재질일 때 mannitol의 투과가 더욱 억제되었으며, pore size가 작을수록 비강점막세포의 배양에 적합한 것을 알 수 있었다(Figure 2와 3). 이는 세포가 insert 의 표면에 부착하는 특성의 차이에 기인하는 것으로 생각되며 또한 pore size가 클수록 부착하는데 어려움이 있기 때문인 것으로 생각된다.
- 그러나, ALI를 만든 6일 후에는 3일째와 유의성 있는 차이를 나타내지 않는 것을 볼 수 있었다. 따라서, 비강 점막 세포를 3460 insert에 seeding한 후 4일째 되는 날 ALI 상태를 만들어 3일이 지난 후에 tight junction0] 가장 잘 형성된다는 것을 알 수 있었다.
- 비강점막세포를 배양하지 않은 insert에 비해 일차배양을 4일간 한 경우 mannitol의 transport7}- 현저히 감소함을 보여주고 있다. 또한, ALI 상태를 만든 후 3일째 되는 날의 투과도는 ALI를 만들기 직전 보다 더욱 줄어드는 것으로부터 ALI가 세포단층을 좀 더 tight하게 만들었다는 것을 알 수 있었다. 그러나, ALI를 만든 6일 후에는 3일째와 유의성 있는 차이를 나타내지 않는 것을 볼 수 있었다.
후속연구
- 2)실제 경구 투여가 힘든 펩타이드 제제의 경우 비강점막을 통한 약물의 투여는 아주 흥미있는 비경구투여의 한 방법으로 알려져 있다.1) 또한, 비강점막은 비염과 같은 질환에서 mucin의 분비를 억제시키는 약물의 국소적 적용을 위한 연구에도 필요하다.
- 그러나, 이상의 조건에서는 tight junction의 형성이 Caco-2 cell 만큼은 견고하지 않은 것으로 생각되며, 배지의 종류나 Ca++의 농도 등을 조절하는 실험을 현재 진행중이다. 이러한 실험 계가 완성되면 비강점막을 통한 각종 약물 및 펩타이드/프로틴 제제의 nasal delivery를 사람의 비강점막상피세포를 사용하여 in vitro상에서 간편하고 정량적으로 평가하는 것이 가능할 것으로 기대된다.
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