본 연구는 사람의 간암세포인 HepG2 세포를 대상으로 강력한 암 예방 효과물질을 함유하고 있을 것으로 추측되는 향버섯 메탄올 추출물의 암세포 성장 저해 효과를 검토하고 또한 암세포 성장 억제 효과의 분자생물학적 기전을 파악하기 위하여 암세포주의 세포주기 조절인자들의 발현을 조사하였다. 향버섯 메탄을 추출물의 HePG2세포에 대한 성장 저해 효과를 MTT assay로 검토한 결과 높은 암세포 성장 저해 효과를 나타내었으며 사람의 정상 간세포인 Chang cell에서는 세포독성이 나타나지 않았다. 또한 향버섯 추출물의 작용으로 HepG2 세포에서 cyclin A와 Dl 단백질의 발현이 억제 되었으며 cyclin Bl 단백질의 발현은 증가하는 경향을 나타내었다. 그리고 암 억제 단백질인 p53의 발현은 전반적으로 증가되었으며, 이와 대조적으로 PCNA 단백질은 감소하는 경향을 나타내었고 세포분열 억제 단백질 p27의 발현은 증가 하는 경향을 나타내었다. 이러한 결과로 볼 때 향버섯 메탄올 추출물은 간암세포의 세포주기 중 Gl기 에서 S기로의 진행을 조절하는 인자인 cyclin A와 cyclin Dl 발현을 억제시키고 p53, p27 단백질을 활성화 시킴과 동시에 PCNA 작용을 억제 함으로써 세포주기 중 Gl/S기 차단을 유도하여 암세포 증식을 억제한 것으로 추정된다.
본 연구는 사람의 간암세포인 HepG2 세포를 대상으로 강력한 암 예방 효과물질을 함유하고 있을 것으로 추측되는 향버섯 메탄올 추출물의 암세포 성장 저해 효과를 검토하고 또한 암세포 성장 억제 효과의 분자생물학적 기전을 파악하기 위하여 암세포주의 세포주기 조절인자들의 발현을 조사하였다. 향버섯 메탄을 추출물의 HePG2세포에 대한 성장 저해 효과를 MTT assay로 검토한 결과 높은 암세포 성장 저해 효과를 나타내었으며 사람의 정상 간세포인 Chang cell에서는 세포독성이 나타나지 않았다. 또한 향버섯 추출물의 작용으로 HepG2 세포에서 cyclin A와 Dl 단백질의 발현이 억제 되었으며 cyclin Bl 단백질의 발현은 증가하는 경향을 나타내었다. 그리고 암 억제 단백질인 p53의 발현은 전반적으로 증가되었으며, 이와 대조적으로 PCNA 단백질은 감소하는 경향을 나타내었고 세포분열 억제 단백질 p27의 발현은 증가 하는 경향을 나타내었다. 이러한 결과로 볼 때 향버섯 메탄올 추출물은 간암세포의 세포주기 중 Gl기 에서 S기로의 진행을 조절하는 인자인 cyclin A와 cyclin Dl 발현을 억제시키고 p53, p27 단백질을 활성화 시킴과 동시에 PCNA 작용을 억제 함으로써 세포주기 중 Gl/S기 차단을 유도하여 암세포 증식을 억제한 것으로 추정된다.
We investigated the effect of Sarcodon aspratus extract on expression of cell cycle regulators. Methanol extract of Sarcodon aspratus showed a growth suppression on HepG2. As shown by western blot analysis, the expressions of cyclin A and Dl known as cell cycle regulators were decreased after treatm...
We investigated the effect of Sarcodon aspratus extract on expression of cell cycle regulators. Methanol extract of Sarcodon aspratus showed a growth suppression on HepG2. As shown by western blot analysis, the expressions of cyclin A and Dl known as cell cycle regulators were decreased after treatment of Sarcodon aspratus extract. On the other hand, the expression of cyclin Bl was increased in the presence of Sarcodon aspratus extract. Furthermore, the expression of p53, a tumor supressor gene, and p27, a cell cycle dependent protein kinase inhibitor, were increased, whereas the expression of PCNA was decreased. In conclusion, our study suggests that growth inhibitory effect of Sardodon aspratus methanol extract on HepG2 is induced by cell cycle arrest in the Gl phase caused by decrease in cyclin A, Dl expressions and increases in p53, p27 expression.
We investigated the effect of Sarcodon aspratus extract on expression of cell cycle regulators. Methanol extract of Sarcodon aspratus showed a growth suppression on HepG2. As shown by western blot analysis, the expressions of cyclin A and Dl known as cell cycle regulators were decreased after treatment of Sarcodon aspratus extract. On the other hand, the expression of cyclin Bl was increased in the presence of Sarcodon aspratus extract. Furthermore, the expression of p53, a tumor supressor gene, and p27, a cell cycle dependent protein kinase inhibitor, were increased, whereas the expression of PCNA was decreased. In conclusion, our study suggests that growth inhibitory effect of Sardodon aspratus methanol extract on HepG2 is induced by cell cycle arrest in the Gl phase caused by decrease in cyclin A, Dl expressions and increases in p53, p27 expression.
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문제 정의
따라서 본 연구에서는 사람의 간암세포인 HepG2 세포를 대상으로 향버섯 메탄올 추출물의 암세포 성장 저해 효과를 살펴보고 또한 암세포 성장 억제 효과의 기전을 분석하기 위해 향버섯 메탄올 추출물이 암세포주의 세포주기 조절 인자들의 발현을 어떻게 변화시키는지를 조사하였다.
본 연구는 사람의 간암세포인 HepG2 세포를 대상으로 강력한 암 예방 효과물질을 함유하고 있을 것으로 추측되는 향 버섯 메탄올 추출물의 암세포 성장 저해 효과를 검토하고 또한 암세포 성장 억제 효과의 분자생물학적 기전을 파악하기 위하여 암세포주의 세포주기 조절인자들의 발현을 조사하였다. 향버섯 메탄올 추출물의 HepG2 세포에 대한 성장 저해 효과를 MTT assay로 검토한 결과 높은 암세포 성장 저해 효과를 나타내었으며 사람의 정상 간세포인 Chang cell에서 는 세포독성 이 나타나지 않았다.
이들 세포주기 조절인자의 활성 억제를 통해 DNA 합성 및 세포분열을 억제하여 암세포의 성장을 저 해하며 궁극적으로 apoptosis를 유도함으로써 암세포의 선택적 궤사를 유도할 수 있다는 실험적 증거가 보고되고 있다(15). 이에 본 실험에서는 HepG2 세포에 향버섯 메탄올 주줄물을 첨 가했을 때 향버섯 추줄물이 세포주기의 어느 단계를 차단하여 암세포 성장 저해 효과를 나타내는지 살펴보았다. 단백질 발현정도를 Western blot으로 분석한 결과 향 버섯 추출물의 작용으로 cyclin A의 발현은 대조군에 비해 감소되었고 특히, 농도 1 mg/mL, 48시간 처리시 대조군에 비해 36%의 감소를 나타내었다(Fig.
제안 방법
Cell lysate의 제조 : 세포주기 조절 단백질의 발현 정도를 관찰하기 위하여 먼저 배 양한 HepG2 cell을 1 x 106 cells/ mL로 준비하여 향버섯 메 탄올 추출물을 500 Ug/m止과 1 mg/ mL 농도로 각각 첨가한 후 37℃에서 24시간 및 48시간 각각 배양하였다. 이때 시료를 처리하지 않은 HepG2cell(lxl06 cells/mL)를 대조군으로 사용하였다.
HepG2 세포에서 향버섯 메탄올 추출물이 P53과 PCNA 발현에 미치는 영향을 살펴보았다. 그 결과 p53 단백질의 발현은 시료농도 0.
, CA, USA, 1 : 200 dilution)를 가하여 2시간 상온에서 배 양하였다. Membrane을 세 척 한 후 horseradish peroxidase가 결합되어 있는 secondary antibody(Santacruz Biotech., CA, USA, 1: 2, 000 dilution)를 가하여 2시간 반응시 킨 후 TTBS 용액으로 세 척하고 ECL(Enhanced chemiluminescence) assay system을 사용하여 단백질을 검출하였다.
사용하였다. 건조된 향버섯의 자실체(50 g)를 먼저 분쇄기로 600Xg에서 此분동안 분쇄한 다음, 10배의 메탄올을 가한 후 12시간동안3회 반복추출하였으며, 그상등액을 모아여 과한 다음 감압농축시 킨 후 동결 건조하여 메 탄올 추출물 (6.6 g)을 제조하였다. 시료는 소량의 DMSO에 용해하여 사용하였다.
실시하였다. 먼저 배양된 세포에서 배지를 제거한 다음 PBS를 첨가하여 가볍게 섞은 후 PBS를 다시 제거하고 0.25% trypsin-EDTA를 첨가하여 37℃에서 5분간 배양하여 세포가 culture dish의 바닥으로부터 완전히 분리되 었는지 현미경으로 관찰한 후, culture 배지를 첨가하여 잘 혼합한 다음 세포수를 lxlecells/m丄로 조정하여 실험에 사용하였다. 한편 향버섯 메탄올 추출물은 적당한 농도로 DMSO에 용해 시 킨 후 membrane filter로 여 과한 후 사용하였다.
cell을 사용하였다. 세포배양시에는 DMEM 배지에 10 % FBS, 1 % antibiotics(penicillin G/ streptomycin)을 첨가하여 배 양하였으며 이 세포들은 37℃, 5 % CO2 배양기에 적응 시켜 배양하였으며 2~3일마다 계대 배양하면서 실험에 사용하였다.
이 것으로 향버섯 메탄올 추출물의 세포 증식 저해 효과는 모든 세포에 대한 것보다는 특정 암세포에 대해 선택적으로 작용하여 나타난 효과로 사료된다. 이러한 결과를 토대로 암세포의 지속적인 성장 및 분열을 조절하는 세포주기 조절 단백질의 발현 정도를 간암세포인 HepG2 세포에서 살펴보았다. 간암은 아시아와 아프리카에서 가장 많이 나타나는 암으로 향버섯에 의한 간암세포인 HepG2 세포의 증식 억제 작용의 기작 규명은 큰 의의가 있을 것으로 사료된다.
향버섯 메탄올 추출물이 간암세포인 HepG2 세포의 성장에 미치는 영향을 살펴보기 위하여, 세포증식과 세포독성을 in 山标0에서 분석하는데 매우 유용하게 사용되어온 MTT assay를 행하였으며 실험에 사용한 메탄올 추출물의 농도는 예비 실험을 통하여 결정하였다. 그 결과 Table 1에서와 같이 향 버섯 메탄올 추출물은 HepG2세포에 대해 0.
대상 데이터
Cell line : 본 실험에 사용한 세포주는 사람의 간암세포인 HepG2 cell을 사용하였다. 세포배양시에는 DMEM 배지에 10 % FBS, 1 % antibiotics(penicillin G/ streptomycin)을 첨가하여 배 양하였으며 이 세포들은 37℃, 5 % CO2 배양기에 적응 시켜 배양하였으며 2~3일마다 계대 배양하면서 실험에 사용하였다.
본 실험에 사용한 향버섯은 김천 황악산에서 채취한 후 건조하여 사용하였다. 건조된 향버섯의 자실체(50 g)를 먼저 분쇄기로 600Xg에서 此분동안 분쇄한 다음, 10배의 메탄올을 가한 후 12시간동안3회 반복추출하였으며, 그상등액을 모아여 과한 다음 감압농축시 킨 후 동결 건조하여 메 탄올 추출물 (6.
6 g)을 제조하였다. 시료는 소량의 DMSO에 용해하여 사용하였다.
이론/모형
Cjrtotoxicity 측정 : 동물세포에 대한 시료의 cytotoxicity 를 측정 하기 위하여 Green 등(12)의 방법에 따라 MTT assay를 실시하였다. 먼저 배양된 세포에서 배지를 제거한 다음 PBS를 첨가하여 가볍게 섞은 후 PBS를 다시 제거하고 0.
성능/효과
1). Cyclin DIe 0.5 mg/mL 농도에서 24시 간, 48시간 처리 하였을 때 대조군에 비하여 각각 23%, 21% 감소하였으며, 1 mg/mL 농도에서는 24시간 처리시 대조군에 비하여 24%, 22% 감소하는 경향을 나타내었다(Fig. 1). Cyclin E는 전반적으로 영향을 미치지 않은 것으로 나타났다(Fig.
킨다(19)고 알려져 있다. HepG2 세포에서 향버섯 추출물에 의한 p27 단백질의 발현은 농도와 시간에 의존적으로 증가하는 경향을 나타내었으며 시료농도 0.5 mg/mL과 1 mg/ mL 농도에서 48시간 처리시 각각 104%와 144%의 현저한 증가를 보였다(Fig. 1). 이와 유사한 결과로 Xiaolin 등(20)이 전립선 암세포인 DU 145 cell에 milk thistle로부터 분리한 flavonoid antioxidant인 silymarin을 처리한 결과 p27 단백질 발현이 농도와 시간에 의 존적으로 증가하였다고 보고하였다.
실험을 통하여 결정하였다. 그 결과 Table 1에서와 같이 향 버섯 메탄올 추출물은 HepG2세포에 대해 0.5 mg/mL 및 1 mg/mL 농도에서 각각 72%, 69% 정도의 성장 저해효과를 보였다. 따라서 향버섯 추출물이 암세포에 선택적 효과를 나타내는지를 알아보기 위해 정상 간세포에 대한 세포 증식 저해 효과를 검토한 결과 정상 간세포인 Chang cell에 대해서는 시 료와 농도에 관계없이 증식 저 해 효과가 크게 나타나지 않았다(data not shown).
미치는 영향을 살펴보았다. 그 결과 p53 단백질의 발현은 시료농도 0.5 mg/m丄에서 24시간, 48시간 처리한 경우 대조군에 비하여 각각 76%, 69% 증가하였고 시료농도 1 mg/ mL에서 24시간, 48시간 처리시 대조군에 비하여 각각 60%, 31% 증가된 것으로 나타났으며 특히 0.5 mg/mL, 24시 간에서 단백질의 발현이 가장 높게 나타났다(Fig. 1). 이와 대조적으로 PCNA 단백질의 발현은 농도와 시간에 의존적으로 감소하는 경향을 나타내었다(Fig.
또한 향 버섯 추출물의 작용으로 HepG2 세포에서 cyclin A와 D1 단백질의 발현이 억제되었으며 cyclin Bl 단백질의 발현은 증가하는 경향을 나타내었다. 그리고 암 억제 단백질인 p53의 발현은 전반적으로 증가되었으며, 이와 대조적으로 PCNA 단백질은 감소하는 경향을 나타내었고 세포분열 억제 단백질 p27의 발현은 증가하는 경향을 나타내었다. 이러한 결과로 볼 때 향버섯 메탄올 추출물은 간암세포의 세포주기 중 G1기 에서 S기로의 진행을 조절하는 인자인 cyclin A와 cyclin D1 발현을 억제시키고 p53, p27 단백질을 활성화 시킴과 동시에 PCNA 작용을 억제 함으로써 세포주기 중 G1/S기 차단을 유도하여 암세포 증식을 억제한 것으로 추정된다.
이에 본 실험에서는 HepG2 세포에 향버섯 메탄올 주줄물을 첨 가했을 때 향버섯 추줄물이 세포주기의 어느 단계를 차단하여 암세포 성장 저해 효과를 나타내는지 살펴보았다. 단백질 발현정도를 Western blot으로 분석한 결과 향 버섯 추출물의 작용으로 cyclin A의 발현은 대조군에 비해 감소되었고 특히, 농도 1 mg/mL, 48시간 처리시 대조군에 비해 36%의 감소를 나타내었다(Fig. 1). Cyclin Bl의 발현은 대조군에 비하여 증가하는 경향을 나타내 었다(Fig.
유사한 결과로 Lee 등(18)에 의한 권백의 물분획물이 human ovarian cell line A2780에서 p53 단백질의 발현을 증가시켜 G1 arrest 를 유도하여 세포주기 진행을 차단시 켰으며 또한 MNNG로 처리한 rat에서 권백이 PCNA를 유의적으로 감소시켰다는 보고가 있다. 따라서 이상의 결과로 향버섯 메탄올 추출물의 암세포에 대한 성장 저해 효과는 세포 내 p53 단백질을 활성화시키고 PCNA 작용을 억제함으로서 apoptosis-f- 유도하고, 세포주기 중 G1 기의 정지가 일어나서 손상된 DNA 복제가 중단되어 비정상적인 세포의 증식을 막음으로서 나타난 결과로 추정된다. .
5 mg/mL 및 1 mg/mL 농도에서 각각 72%, 69% 정도의 성장 저해효과를 보였다. 따라서 향버섯 추출물이 암세포에 선택적 효과를 나타내는지를 알아보기 위해 정상 간세포에 대한 세포 증식 저해 효과를 검토한 결과 정상 간세포인 Chang cell에 대해서는 시 료와 농도에 관계없이 증식 저 해 효과가 크게 나타나지 않았다(data not shown). 이 것으로 향버섯 메탄올 추출물의 세포 증식 저해 효과는 모든 세포에 대한 것보다는 특정 암세포에 대해 선택적으로 작용하여 나타난 효과로 사료된다.
향버섯 메탄올 추출물의 HepG2 세포에 대한 성장 저해 효과를 MTT assay로 검토한 결과 높은 암세포 성장 저해 효과를 나타내었으며 사람의 정상 간세포인 Chang cell에서 는 세포독성 이 나타나지 않았다. 또한 향 버섯 추출물의 작용으로 HepG2 세포에서 cyclin A와 D1 단백질의 발현이 억제되었으며 cyclin Bl 단백질의 발현은 증가하는 경향을 나타내었다. 그리고 암 억제 단백질인 p53의 발현은 전반적으로 증가되었으며, 이와 대조적으로 PCNA 단백질은 감소하는 경향을 나타내었고 세포분열 억제 단백질 p27의 발현은 증가하는 경향을 나타내었다.
그리고 암 억제 단백질인 p53의 발현은 전반적으로 증가되었으며, 이와 대조적으로 PCNA 단백질은 감소하는 경향을 나타내었고 세포분열 억제 단백질 p27의 발현은 증가하는 경향을 나타내었다. 이러한 결과로 볼 때 향버섯 메탄올 추출물은 간암세포의 세포주기 중 G1기 에서 S기로의 진행을 조절하는 인자인 cyclin A와 cyclin D1 발현을 억제시키고 p53, p27 단백질을 활성화 시킴과 동시에 PCNA 작용을 억제 함으로써 세포주기 중 G1/S기 차단을 유도하여 암세포 증식을 억제한 것으로 추정된다.
본 연구는 사람의 간암세포인 HepG2 세포를 대상으로 강력한 암 예방 효과물질을 함유하고 있을 것으로 추측되는 향 버섯 메탄올 추출물의 암세포 성장 저해 효과를 검토하고 또한 암세포 성장 억제 효과의 분자생물학적 기전을 파악하기 위하여 암세포주의 세포주기 조절인자들의 발현을 조사하였다. 향버섯 메탄올 추출물의 HepG2 세포에 대한 성장 저해 효과를 MTT assay로 검토한 결과 높은 암세포 성장 저해 효과를 나타내었으며 사람의 정상 간세포인 Chang cell에서 는 세포독성 이 나타나지 않았다. 또한 향 버섯 추출물의 작용으로 HepG2 세포에서 cyclin A와 D1 단백질의 발현이 억제되었으며 cyclin Bl 단백질의 발현은 증가하는 경향을 나타내었다.
후속연구
또한 암세포에서는 세포주기 조절 효소인 cyclin/CDK가 비정상적으로 과활성화 되어져 있으며 이들 cyclin/CDK 복합체의 활성을 저해하는 단백질인 pl6, p21, p27 등의 변이도 나타나는 것으로 보고되고 있다(2). 이에 이상증식을 하는 암세포에서 cyclin/CDK, p21, p27, p53 등의 세포주기 조절 인자들의 활성 조절이 가능하다면 암세포의 증식을 조절할 수 있을 것이라 사료된다. 최근 항암화학 요법제들의 부작용을 극복하는 새로운 항암제의 개발을 위하여 항암효과가 있는 천연물에 대하여 항암효과의 검색 및 그 작용기전 연구가 많이 진행되고 있다(5).
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