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문제 정의
- 따라서 본 연구는 미 선나무와 종내 분류군들의 지역 집 단군을 대상으로 RAPD방법에 의한 분자유전 학적 다형 현상을 분석 하고 이를 기 초로 미선나무의 분류학적 한계를 검토하며 집단간의 유전적 변이를 논의 하고자 수행 되었다.
- RAPD분석 결과는 미 선나무의 종내 분류군 들은 개체변이이고 이를 동일종으로 처리되어야 한 다는 의견을 지지하고 있다. 또한, RAPD분석은 미 선나무 집단이 다양한 유전적 다형성을 지닌 높은 유전자 푸울을 유지 하고 있다는 것을 확인하는데 매 우유용하였다.
- 미 선나무는 꽃의 색과 시과의 형태에 따라 여러개의 종내분류군들이 보고되어 있지만, 이들의 분류학적 정체성과 계급의 설정 등에 관하여는 학자들간에 많은 논란이 있다. 본 연구에서는 RAPD 분석을 실시하여 이를 토대로 미선나무의 종내분류군들의 한계 를 규명 하고 집 단간의 유전적 다형 현상과 유연관계를 논의 하고자 하였다. 16개의 random primer* 이 용 한 효소중합반응을 실시하여 , 70개의 공통적 인 band 를 포함하여 212개의 표식 인자가 관찰되었고, 그 결과는 Nei의 유전적거리를 이용하여 분석하였다.
제안 방법
- 본 연구에서는 RAPD 분석을 실시하여 이를 토대로 미선나무의 종내분류군들의 한계 를 규명 하고 집 단간의 유전적 다형 현상과 유연관계를 논의 하고자 하였다. 16개의 random primer* 이 용 한 효소중합반응을 실시하여 , 70개의 공통적 인 band 를 포함하여 212개의 표식 인자가 관찰되었고, 그 결과는 Nei의 유전적거리를 이용하여 분석하였다. 분 류군간에는 0.
- 0; 500mM NaCl)에 넣은 후 65P에서 20분간 incubation하고, 조직내 phenol 화합물, 탄닌 등의 불 순물을 제거 하기 위하여 , extraction buffer에 2% PVP-40을 첨가하였다. Incubation후 SEVAC용액 (chloroform:Isoamyl alchol=24:l) 7.5 ml를 첨가하여, 4, 200rpm에서 30분간 원심 분리하여 상등액을 취하고 이 부피의 2/3이 되는 양의 isopropanol을 첨가한 후 , -20o P 에서 12시간 이상 보 관 하 였 다 가 15,000rpm으로 50분간 원심 분리 하여 DNA를 분리 하였다. 분리 된 DNA pellete 70% ethanol로 세 척 한 후 TE buffer(lM Tris, 0.
- 이때 각각의 primer에 대한 상기 의 PCR 과정을 통한 screening을 실시 하여, 선택된 primer별로 3회 이상의 반복실험을 수행 하여 재현성 이 뚜렷한 것만을 유용 한 primer로 결정하였다(Table 2). PCR을 통하여 합 성 된 DNA product는 1 x 10』% EtBr이 포함된 1.3% Agarose gel로 전기 영 동하여 UV-illuminator상에서 band를 확인한 후, Universal Software(AAB, 2000)의 1D-PCR program을 이용하여 정확한 band의 위치를 결정하였다.
- 5 ml를 첨가하여, 4, 200rpm에서 30분간 원심 분리하여 상등액을 취하고 이 부피의 2/3이 되는 양의 isopropanol을 첨가한 후 , -20o P 에서 12시간 이상 보 관 하 였 다 가 15,000rpm으로 50분간 원심 분리 하여 DNA를 분리 하였다. 분리 된 DNA pellete 70% ethanol로 세 척 한 후 TE buffer(lM Tris, 0.5M EDTA, pH 8.0)에 용해 하였 으며 , 그 후 필요에 따라 7.5M ammonium acetate,2.5M sodium acetate 등의 양이 온 첨 가과정을 포함한 정제과정을 실시하였다. 추출된 DNA 용액 에 RNA 를 제거하기 위하여 RNase(2unit/ml, 37*0, 1 hour ; Berhinger Mannheim)을 처리 하고, Geneclean kit(Bio 101 Inc.
- 7% Agarose gel로 전기 영 동한 후 1% EtBr 로 염 색하여 UV ilhiminatoi.상에서 marker와의 밝기 정도를 비교하는 spot-test를 실시하여 그 농도를 계 산하여 PCR반응에 사용하였다.
- ① 94。(3에서 2분간 pre-denaturation, ② 94 ℃ 에서 1분간, 44。0 에서 2분간, 72 P 에서 2분으로 구성된 amplifying cycle을 35회 반복, ③ 마지 막으로 72 ℃ 에서 7분동안 extension으로 구성된 3단계의 PCR 과정을 거쳐 DNA product* 만들어 내었다. 이때 각각의 primer에 대한 상기 의 PCR 과정을 통한 screening을 실시 하여, 선택된 primer별로 3회 이상의 반복실험을 수행 하여 재현성 이 뚜렷한 것만을 유용 한 primer로 결정하였다(Table 2). PCR을 통하여 합 성 된 DNA product는 1 x 10』% EtBr이 포함된 1.
- 5M sodium acetate 등의 양이 온 첨 가과정을 포함한 정제과정을 실시하였다. 추출된 DNA 용액 에 RNA 를 제거하기 위하여 RNase(2unit/ml, 37*0, 1 hour ; Berhinger Mannheim)을 처리 하고, Geneclean kit(Bio 101 Inc., CA, USA)와 Chelex 100(Bio-Rad Lab., CA, USA)을 이용하여 DNA를 순수정제하였다. 정제된 DNA는 0.
대상 데이터
- 5 “M primer 및 200 M의 각 dATP, dCTP, dGTP, dTTP 등이 포함되어 있다. Primer는 NAPS(University of British Columbia)에서 제 작된 No. 1-100의 10-mer oligo primer를 이 용하였으며 , 다음의 PCR반응에 사 용되었다. ① 94。(3에서 2분간 pre-denaturation, ② 94 ℃ 에서 1분간, 44。0 에서 2분간, 72 P 에서 2분으로 구성된 amplifying cycle을 35회 반복, ③ 마지 막으로 72 ℃ 에서 7분동안 extension으로 구성된 3단계의 PCR 과정을 거쳐 DNA product* 만들어 내었다.
- 본 실험에 사용된 재료는 1999년 4월부터 2000년 10월까지 자생지에서 직접 채집한 12집단을 이용하 였다(Table 1). 또한, 본 연구에 사용된 재료의 증거 표본은 대전대학교 생명과학부 식물표본실(TUT)에 보관하였다.
이론/모형
- DNA추출은 CTAB method(Doyle and Doyle, 1987) 를 다소 변형한 아래의 방법으로 실시하였다. 냉동 보관된 약 1.
- 전기 영 동을 통하여 전개 된 DNA fragment의 각 band를 하나의 형질로 취급하여。과 1의 값을 주어 전체 OTU에 대한 자료행 렬을 작성하였으며, Nei(1972)의 genetic distance로서 유사도지 수 자료행 렬(Table 3)을 산출하였다. 도출된 유전적 거리지수 자료행 렬은 NTSYS-pc(Rohlf, 1992)의 SAHN clustering program을 이 용하여, UPGMA방법에 의한 phenogram(Fig. 1)을 작성하여 각 OTU간의 유전적 유사성 을 검 토하였다.
- 16개의 primer에 의한 RAPD PCR반응 결과, 총 212개의 유전적 표식밴드 를 확인할 수 있었고, 이 중 33%에 달하는 70개의 밴 드는 전 분류군에서 공통적 으로 관찰되었다. 증폭된 DNAband의 존재 유무에 따라 작성 된 기 초자료행 렬을 토대로 Lei(1972)의 유전적 거리지수를 이용하여 비유사도(상사도)지수행렬(Table 3)을 도출하였고, 이를 기초로 UPGMA phenogram을 작성하였다(Fig. 11).
성능/효과
- 1-10). 16개의 primer에 의한 RAPD PCR반응 결과, 총 212개의 유전적 표식밴드 를 확인할 수 있었고, 이 중 33%에 달하는 70개의 밴 드는 전 분류군에서 공통적 으로 관찰되었다. 증폭된 DNAband의 존재 유무에 따라 작성 된 기 초자료행 렬을 토대로 Lei(1972)의 유전적 거리지수를 이용하여 비유사도(상사도)지수행렬(Table 3)을 도출하였고, 이를 기초로 UPGMA phenogram을 작성하였다(Fig.
- , 1993). PCR과정을 통해 증폭된 DNA 절편들은 300-2000bp 사이의 구간에서 관찰되었고, RAPD markere 수는 각 primer마다 3-14개 로 다양하게 나타났으며 , 종내 분 류군간 보다는 지 역별개체군간에 서로 다른 밴드양 상이 관찰되었다(Fig. 1-10). 16개의 primer에 의한 RAPD PCR반응 결과, 총 212개의 유전적 표식밴드 를 확인할 수 있었고, 이 중 33%에 달하는 70개의 밴 드는 전 분류군에서 공통적 으로 관찰되었다.
- 351의 비 유사도지수를 나타냄으로써 미선나무 종내 품종간 유전적 불연속성은 거의 없는 것으로 생각된다. RAPD 분석결과를 기 초로 UPGMA방법의 유집 분석을 수행한 결과, 미선나무의 종내 품종간 및 지역집 단간에 일정한 유전적 불연속성은 거의 나타나지 않 았으나, 충북 진천군의 집단들사이 에는 높은 유전적 유연관계를 확인할 수 있었다. UPGMA phenogram 에 의하면, 충북 진천군의 미선나무(AD4, AD5), 분 홍미선나무(AL2, AL3) 집 단은 광릉의 상아미 선 (ADE), 충북 괴 산의미 선나무(AL4) 집 단과 하나의 유집군을 형성하여 전북 변산의 미선나무집단 (AD2)과 유집된 후에 충북 괴 산의미 선 나무 집 단 (AD6, AD7)군과 커 다란 하나의 유집 군을 형 성 한 후 에, 충북 영 동군의 미선나무(AD3), 전북 부안의미 선나무(AD1), 분홍미선나무 집단(AL1)과 합쳐져 마 지막으로 유집 되는 것으로 나타났다(Fig.
- RAPD 분석에 의한 미선나무집단의 상사도지수 행렬에 의하면, 미선나무의 지역별 개체군간에는 0.108에서 0.321(평균 0.206)의 유전적 상이성을 나 타내었고, 분홍미선의 지 역별개체군 사이 에는 0.167 에서 0.247(평균 0.231)의 매우 낮은 값을 나타내었다. 또한 미 선 나무집 단과 분홍미 선집 단간에 는 0.
- 11). 결국, RAPD 연구결과 미선나무, 분홍미선 및 상아미선의 기 본품종 집 단간에는 뚜렷한 유전적 불연속성 이 관 찰되지 않았으며, 전체적으로 다양한 유전적 다형성 이 관찰되어 현재까지 자생하는 미 선나무는 높은 gene pool을 유지하고 있는 것으로 생각된다. 이와 같은 결과는 학술적 혹은 경 제 적 으로 잠재 적 가치 가 매우 높은 미선나무의 육종 및 신품종 개발이나 자 생지 보전 또는 복원사업 에 있어서 매우 다행스러 운 일이라 사료된다.
- 231)의 매우 낮은 값을 나타내었다. 또한 미 선 나무집 단과 분홍미 선집 단간에 는 0.032 에서 0.316의 차이를 나타내었고, 상아미선은 미선나무와 분홍미선의 개체군들과는 0.225-0.351의 비 유사도지수를 나타냄으로써 미선나무 종내 품종간 유전적 불연속성은 거의 없는 것으로 생각된다. RAPD 분석결과를 기 초로 UPGMA방법의 유집 분석을 수행한 결과, 미선나무의 종내 품종간 및 지역집 단간에 일정한 유전적 불연속성은 거의 나타나지 않 았으나, 충북 진천군의 집단들사이 에는 높은 유전적 유연관계를 확인할 수 있었다.
- 본 연구에 사용된 random primer는 총 100개 이 었 으며, 그 중 primer screenning을 실시하여 분류군 전체 에 반응이 일 어 난 primer는 30개 였다, 본 실험에서 반응이 일어난 30개의 primer는 대부분 G+C content 가 매우 높았으며, 그 중 3회의 반복실험을 통해 분 류군 전체에서 반응이 일어난 것은 16개였다(Table 2). 실험에 사용된 random primer에서 높은 G+C content를 갖는 것은 일반적으로 primer의 염기구성 이 DNA 의 증폭길이에 커다란 영향을 미치며 (William et al.
- 16개의 random primer* 이 용 한 효소중합반응을 실시하여 , 70개의 공통적 인 band 를 포함하여 212개의 표식 인자가 관찰되었고, 그 결과는 Nei의 유전적거리를 이용하여 분석하였다. 분 류군간에는 0.108에서 0.321의 유전적 변이가 관찰 되 었고, UPGMA에 의한 군집 분석을 통하여 동일분 류군보다는 몇몇 지역집단간에 유집군이 형성되었 으며, 종내분류군간에는 뚜렷한 연속성 이 관찰되지 않았다. RAPD분석 결과는 미 선나무의 종내 분류군 들은 개체변이이고 이를 동일종으로 처리되어야 한 다는 의견을 지지하고 있다.
- , 1992). 비록 본 연구에서는 푸른 미선과 둥근미선이 포함되지는 않았지만, RAPD분 석방법이 미선나무속내 분류군의 종집단 및 지역개 체군간의 유전적 다양성 과 유연관계를 설명 하는데 매우 유용한 것으로 판단된다.
후속연구
- 이와 같은 결과는 학술적 혹은 경 제 적 으로 잠재 적 가치 가 매우 높은 미선나무의 육종 및 신품종 개발이나 자 생지 보전 또는 복원사업 에 있어서 매우 다행스러 운 일이라 사료된다. 또한, 미선나무의 종내분류군들에 대한 분류학적 한계설정에 있어서, 꽃과 열매의 형 태적 변이를 근거로 설정된 변종 및 품종 등은 모종 인 미선나무에 모두 이명처리 되어야 할 것으로 판 단되며, 이는 미선나무의 종내분류군들을 개체변이로 취 급하여 하나로 통합한 Paik(1994)의 견해를 지 지하고 있으며, 향후 본 분류군의 분류학적 처리에 반영되어야 할 것으로 생각된다.
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