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문제 정의
- SPMB와 SPMEA층에서도 그 효과가 돋보인다. 암을 예방하는 inducer는 SPMB층에 많이 존재하는것으로사료되며 이와 같은 연구결과를 기초로 하여 폐기 감자껍질을 이용한 단계적인 생리활성 물질의 분리 동정이 계속 이루어져 폐기식품 활용 및 건강 대체 식품개발의 연구 대상으로서 기대가 되는 바이다.
- 십이지궤양, 신장병, 고혈압, 화상, 변비 등의 치료에 이용되어 왔으며, 특히 피로회복, 상처치유는 물론 고혈압이나 암을 예방하고, 스트레스로 인한 권태감을 덜어주는 비타민 C가 다량 함유되어 있다. 그러나 식탁에서 애용되는 감자는 일반적으로 껍질을 벗긴 후 조리하므로 본 연구에서는 특히 폐기되고 있는 감자껍질을 수거, 추출 및 분획하여 폐기식 품 속에 들어있는 암세 포 증식 억 제 효과 및 암예방 quinone reductase(QR) 유도 물질에 관하여 연구함으로써 조리시 대부분 폐기되는 감자껍질의 재활용 및 대체 식품산업 개발에 있어 항발암 효과를 가진 기능성 식품으로서의 대체 가능성유무를 본 실험을 통해 타진해 보고자 한다.
제안 방법
- 이 시료를 추출 . 분획하여 각 암세포주에 대한 암세포증식 억 제 효과(cytotoxicity) 와 quinone reductase(QR) 유도활성 물질 검색에 사용하였다.
- 사용하여 행하였다(20, 21). 각 세포주를 1 x 105 cells/well의 농도로 맞추고 24 well 에 각각 1 mL씩 첨가하여 37'C에 서 24 시간 동안 5% CO> incubator에서 배 양한 후, 용매 종류별 분획물을 각각 일정량의 dimethyl sulfoxide(DMSO) 에 녹여서 100, 200, 300, 400 및 500 Ug/mL의 농도로 첨가하였다. 48시간 동안 배양한 후 각 well에 PBS 완충액에 녹인 MTT 용액 (3 mg/mL)을 100 虬씩 첨가하여 4시간 동안 다시 배양시킨 후, well 바닥에 형성된 formazan이 흩어지지 않게 상등액을 제거 하고 DMSO와 ethanol을 1 : 1로 혼합한 용액 1 m也를 첨 가하여 천천히 녹인 후 LTV- visible spectrophotometer(Ph-armacia Biotech 80-2105-20)를 이용하여 570, 610 run에서 흡광도를 측정하여 대조군 세포수를 100%로 하였을 때의 상대적인 세포성장 억제율을 구하였다.
- 각 세포주를 1 x 105 cells/well의 농도로 맞추고 24 well 에 각각 1 mL씩 첨가하여 37'C에 서 24 시간 동안 5% CO> incubator에서 배 양한 후, 용매 종류별 분획물을 각각 일정량의 dimethyl sulfoxide(DMSO) 에 녹여서 100, 200, 300, 400 및 500 Ug/mL의 농도로 첨가하였다. 48시간 동안 배양한 후 각 well에 PBS 완충액에 녹인 MTT 용액 (3 mg/mL)을 100 虬씩 첨가하여 4시간 동안 다시 배양시킨 후, well 바닥에 형성된 formazan이 흩어지지 않게 상등액을 제거 하고 DMSO와 ethanol을 1 : 1로 혼합한 용액 1 m也를 첨 가하여 천천히 녹인 후 LTV- visible spectrophotometer(Ph-armacia Biotech 80-2105-20)를 이용하여 570, 610 run에서 흡광도를 측정하여 대조군 세포수를 100%로 하였을 때의 상대적인 세포성장 억제율을 구하였다.
- QR생성 유도 효과는 Prochaska와 Santamaria의 방법(22)을 일부 변형하여 측정하였다. 즉 T-75 flask에서 배양중인 HepG2세포가 80%이상 증식하게 되면 24 well plate의 각 well에 1X104 cells/mL 되도록 HepG2 세포를 분주하여 , 37℃ 5% CO2 incubator에 24시간 동안 배양한 후 감자껍질 추출물을 각각 DMSO에 녹여 10, 20, 30 및 40 Ug/mL의 농도로 첨가하고 다시 24시간 동안 배양한 다음 배양액을 제거하였다.
- 일부 변형하여 측정하였다. 즉 T-75 flask에서 배양중인 HepG2세포가 80%이상 증식하게 되면 24 well plate의 각 well에 1X104 cells/mL 되도록 HepG2 세포를 분주하여 , 37℃ 5% CO2 incubator에 24시간 동안 배양한 후 감자껍질 추출물을 각각 DMSO에 녹여 10, 20, 30 및 40 Ug/mL의 농도로 첨가하고 다시 24시간 동안 배양한 다음 배양액을 제거하였다. 배지가 제거된 각 well에 250 虬의 lysis bufferdO mM Tris-HCl, pH 8.
- 본 실험에서는 인체암세포 3종(HepG2, HeLa, MCF-7 cells)을 이용하여 감자껍질의 용매별 분획물을 첨가시켰을 때의 암세포 증식억제 효과를 보았으며, 그 결과는 Fig. 1, 2 및 3에 나타내었다.
- 화합물에 의해 유도되어진다(26-28). QR유도 활성 측정을 보다 신속하고 정확하게 하기 위해 여러 종류의 동물세포를 이용할 수 있는데, 본 연구에서는 암세포 증식억제 효과에 사용된 3종의 암세포 중 유일하게 QR를 가지고 있는 HepG2 세포주를 도입하여 실험을 행하였으며 그 결과는 Fig. 4와 같다. HepG2 암세포주에 대한 용매 분획별 감자껍질 추출물을 10, 20, 30 및 40 Hg/mL씩 첨가했을 때 용매 대조군을 1.
- 일상생활에서 애용되고 있는 감자는 조리 시 껍질이 거의 폐기되고 있는점을감안하여, 폐기 농산물의 재활용의 측면에서 감자껍 질 (SoZamzm tuberosum Peel)을 수거 하여 추출, 분획한 후 항균 및 항발암 효과를 살펴보았다. 항균성 검사로는 5가지의 균주에 대한 감자껍질의 분획물의 농도별 항균활성을 측정한 결과, 전반적으로 SPMEE 에서 가장 큰 항균력을 보였으며, 특히 Pseudomonas aeruginosa 균주에서는 앞서 4가지 균에서는 활성이 없던 수층인 SPMA에서 항균활성이 크게 나타났다.
- 농축기로 감압 농축시 킨 후 동결 건조하였다. 감자껍질의 methanol추출물(SPM)을 얻은 후 각 용매별로 분획 하여 hex-ane층(SPMH), ethylether층(SPMEE), ethylacetate층(SPMEA), butanol층(SPMB) 및 수층분획물(SPMA)로 각각 계층 분획하고 각 층을 감압 농축 후 동결 건조하여 분말로 만들어 시료로 사용하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 감자껍질(So知tuberosum Peel)은 2001년 6월 부산 엄궁농산물시장에서 구입하여 껍질만 음건하였다. 이 시료를 추출 .
- 암세포 증식억제 실험에 사용된 시약중NP-40과menadionee Sigma사(St, Louis. USA) 제품을 사용하였고 flavin adenine dinucleotide(FAD), dicumarol 및 glucose-6-phosphate de-hydrogenase는 Amresco사(USA)에서, minimum essential medium(MEM), Dulbeco's Eagle modified medium(DMEM)과 phosphate buffered saline(PBS) 등은 Gibco-BRL(Grand Island Biologic Co., USA) 에서 구입하였으며, 그 외 연구에 사용된 용매 및 시약은 특급을 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 암세포주는 인 체 간암 세포인 HepG2(hu man hepatcx:ellular carcinoma), 자궁경 부암 세포인 HeLa(hu-man cervicse adenocarcinoma) 및 유방암세포인 MCF-7(human breast adenocarcinoma pleual effusion)로서 2000년 5월 한국세포주은행(Korean Cell Line Bank, KCLB)에서 구입하였다. HepG2, HeLa 및 MCF-7세포주는 DMEM medium에 10% fetal bovine serum(FBS)와 1% 100 units/mL의 penicillin streptomycin0] 함유된 배지를 사용하여, 37℃에서 5% CO? incubator (Forma scientific 3546, USA)로 monolayer# 배양하였다.
이론/모형
- 감자껍질 추출 분획물의 암세포 증식억제 효과는 3 (4,5 dimethylthiazol-2-yl)^2, 5-diphenyltetrazolium bromide(MTT assay)를 사용하여 행하였다(20, 21). 각 세포주를 1 x 105 cells/well의 농도로 맞추고 24 well 에 각각 1 mL씩 첨가하여 37'C에 서 24 시간 동안 5% CO> incubator에서 배 양한 후, 용매 종류별 분획물을 각각 일정량의 dimethyl sulfoxide(DMSO) 에 녹여서 100, 200, 300, 400 및 500 Ug/mL의 농도로 첨가하였다.
- 4) 혼합액을 250 UL씩 첨가하여 효소반응을 정지시키고 UV-visible spectrophotometer# 이용하여 610 nm에서 흡광도를 측정하여 계산하였다. 그리고 단백질량은 동일한 set의 well plate에 대한 crystal violet 염색 방법으로 정량하였다.
성능/효과
- 감자껍질의 암세포 증식억제 효과를 MTT assay로 실험한 결과, 3종류의 암세포 HepG2, HeLa 및 MCF-7 세포주에서 모두 ethylether 분획층인 SPMEE층에서 암세포 증식억 제 효과가 크게 나타났으뎌 특히 MCF-7의 경우는 저농도 첨가 시부터 SPMB층에서 높은 억제효과를 보였다. 또 HepG2세포를 이용한 감자껍질의 분획물의 암예방 QR 유도 활성효과를 본 결과, butanol 분획층인 SPMB에서 괄목할 만큼 높은 QR 유도 활성이 증가되었다. 본 실험 결과, 감자껍질에는 전반적으로 SPMEE층에서 높은 항균성을 보여 항균제로서의 개발가능성이 충분히 엿보이며, 나아가 암세포 증식억 제효과도 SPMEE층에서 아주 컸다.
- 또 HepG2세포를 이용한 감자껍질의 분획물의 암예방 QR 유도 활성효과를 본 결과, butanol 분획층인 SPMB에서 괄목할 만큼 높은 QR 유도 활성이 증가되었다. 본 실험 결과, 감자껍질에는 전반적으로 SPMEE층에서 높은 항균성을 보여 항균제로서의 개발가능성이 충분히 엿보이며, 나아가 암세포 증식억 제효과도 SPMEE층에서 아주 컸다. SPMB와 SPMEA층에서도 그 효과가 돋보인다.
- Fig. 1은 인체 간암세王인 HepG2에 각 시료 분획물을 100, 200, 300, 400 및 500 Ug/mL씩 농도를 증가시 켜 첨 가했을 때의 암세포 증식억제 효과를 나타낸 것이며, 저농도 첨가시(100 Rg/mL) 에는 butanol 분획층인 SPMB에서 암세포 증식 억제효과가 현저 하였으나, 시료 농도 200 Ug/m丄을 첨 가했을 때 는 SPMEE층이 다른 분획물보다 그 효과가 월등하여 93.33%의 아주 높은 암세포 증식억 제 효과를 보였다. SPMB에서도 80.
- 33%의 아주 높은 암세포 증식억 제 효과를 보였다. SPMB에서도 80.21%의 높은 억 제 효과가 나타났으며 SPMH층은 시 료첨 가 농도 300 Ug/ml, 이후부터 SPMEE의 효과와 거의 비슷한 높은 암세포 성장 억제 효과가 나타났다. Fig.
- 1의 HepG2 세포에 대한 결과와 비슷한 억제 효과를 나타내었다. 즉, SPMEE층의 가장 낮은 시료농도 200 lig/mL를 첨가했을 때 SPMEE층은 이미 84.18%로 아주 높은 암세포 증식억제 효과를 나타내었으며, 300 Ug/m止를 첨가시에는 96.99 %로 아주 강한 억 제 효과를 나타내 었으며, SPMB와 SPMH는 각각 78.34, 72.06%의 증식 억 제 효과를 보이 다가 SPMH의 경우 400 Ug/mL 첨가시 에는 93.61%의 높은 증식 억제 효과를 나타내어 SPMEE의 증식억제 효과와 비슷한 경향이었다. 인체유방암세포인 MCF-7에 대한 증식 억 제 효과는 Fig.
- 3과 같으며, 초기 첨가 농도시 SPMB층에서 아주 높은 암세포 증식억제 효과를 보였다. 즉, 최소 농도 첨가 농도인 100 Ug/mL를 첨가했을 때 이미 성장 억제율이 72.38%이었고, 200 Ug/mL 첨가시부터는 SPMEE와 그 효과가 비슷하였으며 이후 300 Ug/mL 첨가시와 그 이후에는 SPMEE와 SPMB에서 모두 96.89%로 거의 같은 효과를 나타내었다. SPMEA도 그 다음으로 효과가 있었다.
- 즉, 감자껍질은3종의 암세포주HepG2와 HeLa 그리고MCF-7 모두 ethylether 분획층인 SPMEE에서 가장 높은 암세포 증식억제 효과를 나타내었고, SPMB에서도 높은 효과를 나타냈으며 , 첨 가농도를 증가시 켰을 때 MCF-7의 경우에는 SPMH도 거의 같은 높은 암세포 증식 억제 효과를 나타내었다.
- QR 유도 활성에 관한 연구로 Shim 등(29)은 석류 추출성분 중 ethylether 분획층을 50 Ug/mL 첨 가했을 때 L5배의 QR 유도활성 효과가 나타났음을 보고하였고, Schivendra 등(30)은 마늘과 양파에 대해서도 암예방 효과에 대한 연구가 이루어져 마늘의 지용성 성분인 diallyl sulfice(DAS), di ally dislfice(DADS), dipropyl disulfide(DPDS) 등의 organic sulfides 등은 QR을 유도하는 것으로 보고되었다. 이상에서와 같이 감자껍질에 대한 QR 유도활성 효과 결과는 이제까지 연구되어진 다른 천연물 및 식품 추출물 등이 가진 QR유도 활성효과 연구결과에 비하여서는 월등히 높은 활성효과를 나타내었다. 이것으로 암예방 효과의 척도로 사용되는 QR 유도 활성 효과는 감자껍 질의 성분 중 특히 친수성 성분이 녹아있는 butanol 분획층에 quinone reductase의 inducer가 많이 존재하고 있으리 라 사료되며, 본 연구결과로 미루어 보아 폐기감자껍질의 재활용과 더불어 암예방 건강보조 대체 식품 개발의 가능성을 충분히 시사할 수 있으리라 생각한다.
- 후 항균 및 항발암 효과를 살펴보았다. 항균성 검사로는 5가지의 균주에 대한 감자껍질의 분획물의 농도별 항균활성을 측정한 결과, 전반적으로 SPMEE 에서 가장 큰 항균력을 보였으며, 특히 Pseudomonas aeruginosa 균주에서는 앞서 4가지 균에서는 활성이 없던 수층인 SPMA에서 항균활성이 크게 나타났다. 감자껍질의 암세포 증식억제 효과를 MTT assay로 실험한 결과, 3종류의 암세포 HepG2, HeLa 및 MCF-7 세포주에서 모두 ethylether 분획층인 SPMEE층에서 암세포 증식억 제 효과가 크게 나타났으뎌 특히 MCF-7의 경우는 저농도 첨가 시부터 SPMB층에서 높은 억제효과를 보였다.
- 항균성 검사로는 5가지의 균주에 대한 감자껍질의 분획물의 농도별 항균활성을 측정한 결과, 전반적으로 SPMEE 에서 가장 큰 항균력을 보였으며, 특히 Pseudomonas aeruginosa 균주에서는 앞서 4가지 균에서는 활성이 없던 수층인 SPMA에서 항균활성이 크게 나타났다. 감자껍질의 암세포 증식억제 효과를 MTT assay로 실험한 결과, 3종류의 암세포 HepG2, HeLa 및 MCF-7 세포주에서 모두 ethylether 분획층인 SPMEE층에서 암세포 증식억 제 효과가 크게 나타났으뎌 특히 MCF-7의 경우는 저농도 첨가 시부터 SPMB층에서 높은 억제효과를 보였다. 또 HepG2세포를 이용한 감자껍질의 분획물의 암예방 QR 유도 활성효과를 본 결과, butanol 분획층인 SPMB에서 괄목할 만큼 높은 QR 유도 활성이 증가되었다.
- 4와 같다. HepG2 암세포주에 대한 용매 분획별 감자껍질 추출물을 10, 20, 30 및 40 Hg/mL씩 첨가했을 때 용매 대조군을 1.0으로 하여 비교한 결과, butanol 분획층인 SPMB는 첨가농도 증가에 따라 3.68, 5.48, 7.21 및 8.49의 아주 높은 QR 유도 활성이 나타났으며, 다음으로 SPMEA, SPMH, SPMEE 순이 었다. QR 유도 활성에 관한 연구로 Shim 등(29)은 석류 추출성분 중 ethylether 분획층을 50 Ug/mL 첨 가했을 때 L5배의 QR 유도활성 효과가 나타났음을 보고하였고, Schivendra 등(30)은 마늘과 양파에 대해서도 암예방 효과에 대한 연구가 이루어져 마늘의 지용성 성분인 diallyl sulfice(DAS), di ally dislfice(DADS), dipropyl disulfide(DPDS) 등의 organic sulfides 등은 QR을 유도하는 것으로 보고되었다.
후속연구
- 이상에서와 같이 감자껍질에 대한 QR 유도활성 효과 결과는 이제까지 연구되어진 다른 천연물 및 식품 추출물 등이 가진 QR유도 활성효과 연구결과에 비하여서는 월등히 높은 활성효과를 나타내었다. 이것으로 암예방 효과의 척도로 사용되는 QR 유도 활성 효과는 감자껍 질의 성분 중 특히 친수성 성분이 녹아있는 butanol 분획층에 quinone reductase의 inducer가 많이 존재하고 있으리 라 사료되며, 본 연구결과로 미루어 보아 폐기감자껍질의 재활용과 더불어 암예방 건강보조 대체 식품 개발의 가능성을 충분히 시사할 수 있으리라 생각한다.
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