[국내논문]전분을 이용한 탄수화물 분해효소의 고 생산과 효소 안정성 증가를 위안 글리세롤 첨가 Glycerol Addition for the Hyper-production and Stabilization of a Novel Carbohydrolase by Lipomyces starkeyi원문보기
Lipomyces starkeyi KSM 22는 덱스트라나아제와 아밀라아제 활성을 동시에 갖는 덱사메이즈를 생산한다. 1% (w/v)의 전분을 포함한 배지에 0.02% (w/v) 2-deoxy-D-glucose를 첨가한 경우, 넣지 않았을 때보다 약 2.5배의 증대된 효소 생산성을 보였으며, 0.5% (v/v) 글리세롤을 첨가한 경우 2.4배의 효소생산성을 보여 1% (w/v)의 덱스트란을 사용한 경우에 생산되는 덱사메이즈 양만큼의 생산성을 얻을 수 있었다. 정제된 효소와 효소 안정제로 사용이 가능한 혼합액을 4$0^{\circ}C$에서 3주간 방치 후 초기 활성과 비교하여 잔존하는 효소의 활성을 확인한 결과 25% (v/v) 글리세롤을 첨가했을 때 3주 후 덱스트라나아제의 활성으로 확인된 덱사메이즈의 활성은 초기의 90.9%가 유지되었고, 1% (v/v) 글리세롤에 50 mM CaCl$_2$와 KH$_2$PO$_4$를 첨가한 경우는 초기 활성의 73.4%가 유지되어 덱사메이즈 안정성에 효과가 있었다.
Lipomyces starkeyi KSM 22는 덱스트라나아제와 아밀라아제 활성을 동시에 갖는 덱사메이즈를 생산한다. 1% (w/v)의 전분을 포함한 배지에 0.02% (w/v) 2-deoxy-D-glucose를 첨가한 경우, 넣지 않았을 때보다 약 2.5배의 증대된 효소 생산성을 보였으며, 0.5% (v/v) 글리세롤을 첨가한 경우 2.4배의 효소생산성을 보여 1% (w/v)의 덱스트란을 사용한 경우에 생산되는 덱사메이즈 양만큼의 생산성을 얻을 수 있었다. 정제된 효소와 효소 안정제로 사용이 가능한 혼합액을 4$0^{\circ}C$에서 3주간 방치 후 초기 활성과 비교하여 잔존하는 효소의 활성을 확인한 결과 25% (v/v) 글리세롤을 첨가했을 때 3주 후 덱스트라나아제의 활성으로 확인된 덱사메이즈의 활성은 초기의 90.9%가 유지되었고, 1% (v/v) 글리세롤에 50 mM CaCl$_2$와 KH$_2$PO$_4$를 첨가한 경우는 초기 활성의 73.4%가 유지되어 덱사메이즈 안정성에 효과가 있었다.
Lipomyces starkeyi KSM 22 produces dextranase and amylase (DXAMase). The addition of 0.02％ (w/v) 2-deoxy-D-glucose or 0.5% (w/v) glycerol into a 1% (w/v) starch medium increased the final activity of DXAMase produced 2.5 fold or 2.4 fold, respectively, compared to that of a 1% (w/v) starch medium. T...
Lipomyces starkeyi KSM 22 produces dextranase and amylase (DXAMase). The addition of 0.02％ (w/v) 2-deoxy-D-glucose or 0.5% (w/v) glycerol into a 1% (w/v) starch medium increased the final activity of DXAMase produced 2.5 fold or 2.4 fold, respectively, compared to that of a 1% (w/v) starch medium. This activity was similar to that produced with 1% (w/v) dextran. The stability of purified OXAMase at 40$\^{C}$ for 3 weeks was tested using the various enzyme stabilizers. With the addition of 25% (v/v) glycerol, 90.9% of initial activity was left after 3 weeks. For practical use, the addition of 1% (v/v) glycerol with 50 mM of CaCl$_2$ or KH$_2$PO$_4$was adequate and maintained 73.4% of the initial activity under the test conditions used.
Lipomyces starkeyi KSM 22 produces dextranase and amylase (DXAMase). The addition of 0.02％ (w/v) 2-deoxy-D-glucose or 0.5% (w/v) glycerol into a 1% (w/v) starch medium increased the final activity of DXAMase produced 2.5 fold or 2.4 fold, respectively, compared to that of a 1% (w/v) starch medium. This activity was similar to that produced with 1% (w/v) dextran. The stability of purified OXAMase at 40$\^{C}$ for 3 weeks was tested using the various enzyme stabilizers. With the addition of 25% (v/v) glycerol, 90.9% of initial activity was left after 3 weeks. For practical use, the addition of 1% (v/v) glycerol with 50 mM of CaCl$_2$ or KH$_2$PO$_4$was adequate and maintained 73.4% of the initial activity under the test conditions used.
* AI 자동 식별 결과로 적합하지 않은 문장이 있을 수 있으니, 이용에 유의하시기 바랍니다.
문제 정의
이 효소를 덱사메이즈 (DXAMase)라 명명하였으며, 불용성 글루칸의 형성을 억제하고, 이미 생성된 플라그를 제거하는 기능을 가지고 있어 구강세정제의 활성 성분으로의 이용 가능성을 확인하였다(5, 6). 효소의상업적 이용을 위해서는 고생산성과 안정성 유지가 필요하며, 본 연구에서는 덱사메이즈의 생산성 증대를 위해 gratuitous repressor인 2-deoxy-D-glucose(4, 7) 오} pectin 가수분해 효소 유전자의 repressor인 글리세롤(8-9)을 이용하여 효소의 생산성증가에 미치는 효과를 살펴보았으며, 현재 상용 중인 구강세정제에 포함되어 있는 다양한 종류의 염과 화학성분들, 그리고 일반적으로 효소의 안정제로 사용되는 물질들을 첨가하여 DXAMase의 안정성을 증가할 수 있는 조건을 연구하였다.
19배 더 촉진하는 것으로 보고하였으며 isomaltose에서 isomaltopentaose의 경우는 21%-73%의낮은 induction을 보임을 보고하였다<13). L. starkeyi KSM22 균을 값싼 전분을 사용하여 효소를 생산하는 경우 생산 비용에 장점이 될 수 있지만 전분만을 탄소원으로 사용하는 경우효소의 생산성이 덱스트란을 사용하는 경우보다 낮아 전분을이용하면서 효소의 생산성을 증가시키기 위해서 gratuitous repressor를 이용하고자 하였다. 전분에 0.
제안 방법
덱사메이즈의 역가는 덱스트라나아제와 아밀라아제의 활성으로 확인하였으며, 20 mM citate phosphate 완충용액 (pH 5.5) 에 녹인 2% (w/v)의 덱스트란 혹은 전분을 기질로 사용하였다. 효소와 기질을 혼합하여 37°C에서 일정시간 반응시킨 후 반응액을 copper-bicinchoninate 환원당 측정 방법으로 유리된 환원당들의 양을 글루코스 양으로 환산하여 비교하였다(10).
5) 에 녹인 2% (w/v)의 덱스트란 혹은 전분을 기질로 사용하였다. 효소와 기질을 혼합하여 37°C에서 일정시간 반응시킨 후 반응액을 copper-bicinchoninate 환원당 측정 방법으로 유리된 환원당들의 양을 글루코스 양으로 환산하여 비교하였다(10). 효소 1 unit (IU)은 위 반응 조건에서 1분 동안 1 俱nole의글루코오스에 해당하는 환원당을 유리해내는데 필요한 효소의 양으로 정의한다.
단백질농도와 역가는 정제 단계별로 측정하였다. 단백질 농축액 (30 mg/1.5 mL) 을 20 mM potassium phosphate 완충용액 (pH 6.4) 으로 평형화 시킨 DEAE-Sepharose 컬럼에 주입하고 NaCl로 0-1.0 M까지 농도 구배를 주어 단백질을 용출하였다. 활성을 보이는 분획을 모아 농축한 후 GPC 컬럼 (Bio-Rad Co.
0 M까지 농도 구배를 주어 단백질을 용출하였다. 활성을 보이는 분획을 모아 농축한 후 GPC 컬럼 (Bio-Rad Co., A-0.5 m, 70 cm X 2.6 cm) 에 주입하여 분리하였으며, 사용한 컬럼은 50 mM citrate phosphate (pH 5.5) 완충용액으로평형화 시켰고 투입한 단백질은 4 mg/mL이었다.
구강세정제에 포함된 성분들 중 몇 가지를 정제된 덱사메이즈 효소 안정성에 미치는 영향을 조사하였다. 이온들의 킬 레이팅 효과를 줄이기 위해 50 mM citrate phosphate 완충용액 (pH 5.
효소 안정성에 미치는 영향을 조사하였다. 이온들의 킬 레이팅 효과를 줄이기 위해 50 mM citrate phosphate 완충용액 (pH 5.5)을 사용하였으며, 이 완충용액에 화학성분들을 녹이고, 이 용액과 효소액을 85:15 (v/v-덱스트라나아제 역가 기준; 24.6 U/mL)의 비율로 혼합하여 40°C에서 3주간 방치하면서 24시간마다 시료를 취하여 역가를 확인하였다. 역가 확인 방법은 위에서 제시한 방법과 동일하다.
본 연구에서 사용한 L starkeyi KSM22 균은 부분적으로 constitutive 하게 덱사메이즈를 생산하는 derepresse된 균으로(5), 이 균의 효소를 상업적으로 이용흐}.기위하여 값이 싼 탄소원을 이용하여 효소를 생산하고자 배양시 여러 가지 종류의 탄소원이 덱사메이즈 생산에 미치는 영향을 확인하였다 (Table 1). LW 기본 배지에 1% (w/v) 전분만을 사용하고 OD660 이 8.
8% 이상의 초기 효소 활성이 잔존함을 확인하였다. 하지만 이러한화학성분의 농도는 덱사메이즈의 상품화를 위해서는 너무 높은 농도이므로 글리세롤의 농도를 1% (v/v)로 유지하고 여러가지 종류의 염들을 추가함으로써 효소의 안정성을 증가할수 있는 조건을 살펴보았다(Table 2). 1% (v/v) 글리세롤에 50 mM KH2PO4와 CaCl2 가 첨가된 군에서 초기 활성의 73.
LW 배지에 1% 전분 대신 다른 종류의 탄소원을 넣고 덱사메이즈 생산에 주는 영향을 조사하였다. 사용한 탄소 원은 전분 이외에 글루코오스, 플락토오스, 말토오스, 덱스트란, 하이드롤, 그리고 수크로오스이었으며, LW 배지에 10 g/L (w/v)의 농도로 각각의 탄소원을 첨가하였고, 28°C에서 48시간 배양하여 상등액을 조효소액으로 회수하였다.
대상 데이터
효소 1 unit (IU)은 위 반응 조건에서 1분 동안 1 俱nole의글루코오스에 해당하는 환원당을 유리해내는데 필요한 효소의 양으로 정의한다. 단백질은 Bradford(ll)법에 의해 정량해주고 280 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 표준물질로 Bovine serum albumin (Sigma Chemical Co., USA)을 사용하였다.
생산에 주는 영향을 조사하였다. 사용한 탄소 원은 전분 이외에 글루코오스, 플락토오스, 말토오스, 덱스트란, 하이드롤, 그리고 수크로오스이었으며, LW 배지에 10 g/L (w/v)의 농도로 각각의 탄소원을 첨가하였고, 28°C에서 48시간 배양하여 상등액을 조효소액으로 회수하였다.
그러므로 효소 생산을 위하여 가장 좋은 Lipomyces균의 특성은 구성적(constitutive)으로 효소를 생산하고 derepression 되어야 한다(12). 본 연구에서 사용한 L starkeyi KSM22 균은 부분적으로 constitutive 하게 덱사메이즈를 생산하는 derepresse된 균으로(5), 이 균의 효소를 상업적으로 이용흐}.기위하여 값이 싼 탄소원을 이용하여 효소를 생산하고자 배양시 여러 가지 종류의 탄소원이 덱사메이즈 생산에 미치는 영향을 확인하였다 (Table 1).
8 U/mL 이었고 정제된 효소는 SDS-PAGE와 효소 활성 염색을 수행한 결과 덱스트라나아제와 아밀라아제 역가를 동시에 갖는 순수한 단일 밴드를 갖는 100 kDa 크기의 효소임을 확인하였다. 이 정제된 효소를 다음의 덱사메이즈의 안정성을 위한 화학물질의 선발에 사용하였다.
성능/효과
동시에 갖는 덱사메이즈를 생산한다. 1% (w/v) 의 전분을 포함한 배지에 0.02% (w/v) 2-deoxy-D-glucose를 첨가한 경우, 넣지 않았을 때보다 약 2.5배의 증대된 효소 생산성을 보였으며, 0.5% (v/v) 글리세롤을 첨가한 경우 2.4배의 효소 생산성을 보여 1% (w/v)의 덱스트란을 사용한 경우에 생산되는 덱사메이즈 양만큼의 생산성을 얻을 수 있었다. 정제된 효소와 효소 안정제로 사용이 가능한 혼합액을 40 °C 에서 3주간 방치 후 초기 활성과 비교하여 잔존하는 효소의 활성을 확인한 결과 25% (v/v) 글리세롤을 첨가했을 때 3주 후 덱스트라나아제의 활성으로 확인된 덱사메이즈의 활성은 초기의 90.
기위하여 값이 싼 탄소원을 이용하여 효소를 생산하고자 배양시 여러 가지 종류의 탄소원이 덱사메이즈 생산에 미치는 영향을 확인하였다 (Table 1). LW 기본 배지에 1% (w/v) 전분만을 사용하고 OD660 이 8.0 가량 되었을 때 (접종 후 약 48- 52시간) 덱스트라나아제에 해당하는 효소의 활성은 2.85 U/mL 이었으며, 탄소원으로 1% (w/v) 덱스트란을 사용한 경우는 4.78 U/mL 로 약 1.68배의 증가된 덱사메이즈의 생산을 확인하였다. 실험에 사용한 단당과 이당의 경우는 덱사메이즈 생산이 적어 0.
68배의 증가된 덱사메이즈의 생산을 확인하였다. 실험에 사용한 단당과 이당의 경우는 덱사메이즈 생산이 적어 0.5에서 1.47 U/mL의 활성 범위를 보였다. 하지만, 구체적으로 어떤 물질이 덱스트란나아제 유전자 발현을 위한 inducer 인지 알려져 있지 않다(12).
starkeyi KSM22 균을 값싼 전분을 사용하여 효소를 생산하는 경우 생산 비용에 장점이 될 수 있지만 전분만을 탄소원으로 사용하는 경우효소의 생산성이 덱스트란을 사용하는 경우보다 낮아 전분을이용하면서 효소의 생산성을 증가시키기 위해서 gratuitous repressor를 이용하고자 하였다. 전분에 0.02% (w/v) 2-deoxy- D-glucose를 첨가하여 배지에서 배양했을 경우 전분만을 사용하였을때 보다 약 2.5배 증가된 덱사메이즈 생산성을 보였다(Table 1). 2-deoxy-D-glucose는 탄수화물 분해 효소의 생산을 위한 gratuitous repressor로서 constitutive하고 derepresse 된 탄수화물 분해 효소의 생산을 하는 균을 개발하기 위하여 사용이 되어왔다<4, 7, 14-17).
따라서 pectin 가수분해 효소의 repressor로서 사용되는 글리세롤을 첨가하여 효소의 생산성 연구를 하였다<9). 글리세롤 역시 2-deoxy-D-glucose오} 대사면에서 유사한 효과를 주어 본연구에서는 1% (w/v) 전분이 첨가된 LW기본 배지에 0.5% (v/v) 글리세롤을 첨가하였을 때 전분만을 사용하였을 때보다 약 2.4배 증가된 효소 생산성을 보였다. 이는 값비싼 덱스트란이나 전분에 2-deoxy-D-glucose를 첨가하여 얻을 수 있는 효소의 생산성으로 글리세롤을 사용함으로써 저비용으로 효소를 생산할 수 있음을 의미한다.
이는 값비싼 덱스트란이나 전분에 2-deoxy-D-glucose를 첨가하여 얻을 수 있는 효소의 생산성으로 글리세롤을 사용함으로써 저비용으로 효소를 생산할 수 있음을 의미한다. 배양 상등액으로부터 hollow- fiber와 황산 암모늄을 이용하여 농축하고, 음이온 교환수지 (DEAE- Sepharose)를 이용하여 덱사메이즈를 분리, 정제하였으며 최종적으로 얻어진 덱사메이즈는 덱스트라나아제와 아밀라아제에 해당하는 활성으로 각각 48.1 U/n止과 33.8 U/mL 이었고 정제된 효소는 SDS-PAGE와 효소 활성 염색을 수행한 결과 덱스트라나아제와 아밀라아제 역가를 동시에 갖는 순수한 단일 밴드를 갖는 100 kDa 크기의 효소임을 확인하였다. 이 정제된 효소를 다음의 덱사메이즈의 안정성을 위한 화학물질의 선발에 사용하였다.
첨가한 물질은염, 당알콜, 탄수화물, detergents, 그리고 1% (v/v)의 글리세롤 혹은 PEG 400에 섞어준 50 mM의 염들이었다. 아무것도첨가하지 않은 경우의 덱사메이즈는 실험 기간 후 초기 효소활성의 11.5%만이 남았으며 25% (v/v) 이상의 글리세롤과 70% (v/v)의 Propylene Glycol을 첨가한 경우에는 78.8% 이상의 초기 효소 활성이 잔존함을 확인하였다. 하지만 이러한화학성분의 농도는 덱사메이즈의 상품화를 위해서는 너무 높은 농도이므로 글리세롤의 농도를 1% (v/v)로 유지하고 여러가지 종류의 염들을 추가함으로써 효소의 안정성을 증가할수 있는 조건을 살펴보았다(Table 2).
하지만 이러한화학성분의 농도는 덱사메이즈의 상품화를 위해서는 너무 높은 농도이므로 글리세롤의 농도를 1% (v/v)로 유지하고 여러가지 종류의 염들을 추가함으로써 효소의 안정성을 증가할수 있는 조건을 살펴보았다(Table 2). 1% (v/v) 글리세롤에 50 mM KH2PO4와 CaCl2 가 첨가된 군에서 초기 활성의 73.4% 효소 역가가 유지되어 효소 안정성에 효과가 좋은 것으로 나타났다. 따라서 글리세롤를 효소 생산 배지에 첨가함으로써 효소의 생산성 증가와 생산 효소의 안정성 유지에도좋은 효과가 있겠다.
4배의 효소 생산성을 보여 1% (w/v)의 덱스트란을 사용한 경우에 생산되는 덱사메이즈 양만큼의 생산성을 얻을 수 있었다. 정제된 효소와 효소 안정제로 사용이 가능한 혼합액을 40 °C 에서 3주간 방치 후 초기 활성과 비교하여 잔존하는 효소의 활성을 확인한 결과 25% (v/v) 글리세롤을 첨가했을 때 3주 후 덱스트라나아제의 활성으로 확인된 덱사메이즈의 활성은 초기의 90.9%가 유지되었고, 1% (v/v) 글리세롤에 50 mM CaCk와 KH2PO4를 첨가한 경우는 초기 활성의 73.4%가 유지되어 덱사메이즈 안정성에 효과가 있었다.
이 논문을 인용한 문헌
저자의 다른 논문 :
활용도 분석정보
상세보기
다운로드
내보내기
활용도 Top5 논문
해당 논문의 주제분야에서 활용도가 높은 상위 5개 콘텐츠를 보여줍니다. 더보기 버튼을 클릭하시면 더 많은 관련자료를 살펴볼 수 있습니다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.