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문제 정의
- 본 연구에서는 disodium cromoglycate (DSCG)를 비교 약물로 사용하여13) compound 48/80 유발 전신성 아나필 락시, anti- DNP IgE에 의한 국소성 아나필락시 및 흰쥐 복강 비만세포로부터 히스타민의 유리에 미치는 택란의 영향을 분석하였으며, 세포내 cAMP양을 측정하여 이들의 작용기전을 검토하였다.
제안 방법
- Compound 48/80에 의해 유도된 아나필락시 반응에 대한 LLAE의 효과 - 즉시형 과민반응에 대한 LLAE의 효과를 검토하기 늬하여 비면 역학적 자극물질인 compound 48/80을 사용하여 打']성 아나필락시를 유도하였다. 치사율은 compound 48/80 (O.
- 측정하여 LLAE의 효과를 검토하였다. Compound 48/80을 투여하기 1시간 전에 LLAE 및 DSCG를 투여하고 치사율 실험이 끝난 후 심장에서 채혈하여 혈청을 분리한 다음 히스타민 양을 측정하였다. Table IU에서와같이 LLAE 및 DSCG에 의한 혈청 중 히스타민의 유리는 compound 48/80에 의해 유도된 아나필락시 반응과 유사한 양상으로 억제되었으며, 특히 1 mg/g의 농도에서 유의성 있는 억제 효과를 나타내었다.
- 즉 anti-DNP IgE 100 略을 함유한 생리식염수 50 娉 생쥐의 등의 털을 제거한 부위에 피하주사하여감작시킨 다음 48시간 후에 꼬리 정맥에 DNP-HSA 1 mg과 evans blue 16 mg을 포함한 생리식염수를 주사하여 항원 항체반응을 야기시켰다. anti-DNP IgE로 감작시킨 비만세포를 DNP- HSA로 탈감작시키기 1시간 전에 생리식염수로 조제한 LLAE (0.001-1 mg/gX 경구투여하고 30분 후에 치사시켰다. Evans blue로 염색된 피부 부위를 잘라 1 M-K0H 1 ml를 가하고 5% CO2 incubator에서 하룻밤 동안 방치하여 피부 조직을 용해시킨다음 0.
- 2 暗 혼합한 시험관에 넣고 진탕 후 원심분리 (5OOXg, 10분) 하였다. butanol층 8 m2를 취해 0.1 M HC1 3 m/, w-heptane 10 帽 가하여 진탕 후 원심분리 (500Xg, 10분) 하였다. 여기에서 얻어진 수층 2 m/에 1 M NaOH 용액 400 照 1% o-phthaldialdehyde 용액 100 pZ를 가하고 37℃ 수욕상에서 3분간 반응시킨 다음 3 M HC1 용액 200 以를 가하여 혼합하고 2분 동안 방치한 다음 入ex=353nm, 入em=438nm에서 상대 형광강도를 측정하여 정량하였다.
- 001-1 mg/g, 체중)는 생리식염수에 녹인 다음 compound 48/ 80 주사 1시간 전에 복강 내에 주사하였다. 또 시간의존 실험으로 compound 48/80을 투여하고 5분 및 10분 후에 각각 LLAE (1 mg/g, 체중)을 복강 내에 주사하였다. 치사율 실험은 아나필락시 쇽을 유발시킨 후 1시간 동안 관찰하였으며 관찰 후 생쥐의 심장에서 채혈하고 혈청을 분리하여 히스타민을 정량하였다.
- 수동 피부 아나필락시 (PCA) 에 미치는 LLAE의 효과 -PCA 에 미치는 LLAE鸿 영향을 검토하기 위하여 DNP-HSA4 evans blue의 혼합액을 투여하기 1시간 전에 LLAE (0.001-1 mg/g) 및 DSCG (0.001-1 m以g)를 경구투여하였다. Table IV에서와 같이 수동 피부 아나필락시 반응은 LLAE 및 DSCG에 의해 농도 의존적으로 억제되었으며, 특히 0.
- 1 M HC1 3 m/, w-heptane 10 帽 가하여 진탕 후 원심분리 (500Xg, 10분) 하였다. 여기에서 얻어진 수층 2 m/에 1 M NaOH 용액 400 照 1% o-phthaldialdehyde 용액 100 pZ를 가하고 37℃ 수욕상에서 3분간 반응시킨 다음 3 M HC1 용액 200 以를 가하여 혼합하고 2분 동안 방치한 다음 入ex=353nm, 入em=438nm에서 상대 형광강도를 측정하여 정량하였다.
- 다음 동결 건조하여 -4℃에서 보관하였다. 이 추출물을 사용 직전에 생리식염수 또는 Tyrode buffer A (10 mM HEPES, 130 mM NaCl, 5mM KC1, 1.4 mM CaCl2, ImM MgCl2, 5.6 mM glucose, 0.1% bovine serum albumin)를 사용하여 일정 농도로 조제하였다.
- 세포 부유액 중 비만세포는 Yurt 등18)의 방법으로 정제하였다. 즉 Tyrode buffer B 1 mU에재부유시킨 비만세포 부유액을 22.5% metrizamide 2 mZ에 가하여 원심분리(400Xg, 15분)하였다. 완충액과 metrizamide의 접촉면에 남아있는 세포는 수집하여 제거하고 Tyrode buffer B 1 m/에 재부유시켰다.
- 따라 실험하였다. 즉 anti-DNP IgE 100 略을 함유한 생리식염수 50 娉 생쥐의 등의 털을 제거한 부위에 피하주사하여감작시킨 다음 48시간 후에 꼬리 정맥에 DNP-HSA 1 mg과 evans blue 16 mg을 포함한 생리식염수를 주사하여 항원 항체반응을 야기시켰다. anti-DNP IgE로 감작시킨 비만세포를 DNP- HSA로 탈감작시키기 1시간 전에 생리식염수로 조제한 LLAE (0.
- 따라 실험하였다. 즉 비만세포의 탈과립 제로 compound 48/ 80 (0.008 mg/g, 체중)을 흰쥐의 복강 내에 주사하였으며, LLAE (0.001-1 mg/g, 체중)는 생리식염수에 녹인 다음 compound 48/ 80 주사 1시간 전에 복강 내에 주사하였다. 또 시간의존 실험으로 compound 48/80을 투여하고 5분 및 10분 후에 각각 LLAE (1 mg/g, 체중)을 복강 내에 주사하였다.
- 등改의 방법에 따라 정량하였다. 즉 에펜돌프 튜브에 시료 500 B를 취하여 0〕M HC1 450 B와 60% 과염소산 용액 50 山를 혼합한 후 원심분리 (400Xg, 20분)하였다. 그 상징 액 800 W를 취해 5 M NaOH 용액 500 区 증류수 3 ml, w-butanol 10 m/ 및 NaCl 1.
- 즉 흰쥐를 에테르로 마취시킨 후 실온에서 Tyrode buffer B (137 mM NaCl, 12 mM NaHCO3, 2.7 mM KC1, 0.3 mM NaH2PO4, 1 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 5.6 mM dextrose, 0.1% bovine serum albumin) 약 20 mZ를 복강 내에 주입하고 90초간 복벽을 가볍게 마사지하였다. 복벽 중앙선을 주의 깊게절개하고 pasteur pipette으로 복강 세척액을 채취하고 원심분리 (150xg, 10분) 하여 상징액을 분리 제거한 후 비만세포 부유안을 Tyrode buffer B에 재 부유시켰다.
- 또 시간의존 실험으로 compound 48/80을 투여하고 5분 및 10분 후에 각각 LLAE (1 mg/g, 체중)을 복강 내에 주사하였다. 치사율 실험은 아나필락시 쇽을 유발시킨 후 1시간 동안 관찰하였으며 관찰 후 생쥐의 심장에서 채혈하고 혈청을 분리하여 히스타민을 정량하였다.
- 혈청 중 히스타민 유리에 미치는 LLAE의 효과-LLAE의 투여에 의해 전신성 아나필락시가 억제되므로 혈청 중 히스타민 양을 측정하여 LLAE의 효과를 검토하였다. Compound 48/80을 투여하기 1시간 전에 LLAE 및 DSCG를 투여하고 치사율 실험이 끝난 후 심장에서 채혈하여 혈청을 분리한 다음 히스타민 양을 측정하였다.
- 주함유물질인 히스타민이 유리된다. 흰쥐의 복강 비만세포에 미치는 LLAE의 효과를 검토하기 위하여 compound 48/80을투여하기 10분전에 LLAE (0.001-1 mg/mZ) 및 DSCG (0.001-1 mg/mZ)를 처리하였다. Table V에서와같이 LLAE 및 DSCG는비만세포에서 compound 48/80에 의한 히스타민의 유리를 농도의존적으로 억제 시켰으며, LLAE는 0.
대상 데이터
- 48阳간 동종 수동 피부 아나필락시 (PCA)-Kawabata 등⑸의방법에 따라 실험하였다. 즉 anti-DNP IgE 100 略을 함유한 생리식염수 50 娉 생쥐의 등의 털을 제거한 부위에 피하주사하여감작시킨 다음 48시간 후에 꼬리 정맥에 DNP-HSA 1 mg과 evans blue 16 mg을 포함한 생리식염수를 주사하여 항원 항체반응을 야기시켰다.
- a-minimal essential medium (a-MEM)은 Flow Laboratories洌서 구입하였다. cAMP kit는 Amersham사에서 구입하여 사용하였으며 기타 시약은 시판시약 특급을 사용하였다.
- a-minimal essential medium (a-MEM)은 Flow Laboratories洌서 구입하였다. cAMP kit는 Amersham사에서 구입하여 사용하였으며 기타 시약은 시판시약 특급을 사용하였다. 기기는 spectrofluorometer (Shimadzu, RF-5301 PC), spectrophotometer (Shimadzu, UV- 1201)를 사용하였다.
- cAMP kit는 Amersham사에서 구입하여 사용하였으며 기타 시약은 시판시약 특급을 사용하였다. 기기는 spectrofluorometer (Shimadzu, RF-5301 PC), spectrophotometer (Shimadzu, UV- 1201)를 사용하였다.
- 시약 및 기기 -Compound 48/80, anti-dinitrophenyl (DNP) IgE, DNP-human serum albumin (HSA), o-phthaldialdehyde 및 metrizamide는 Sigma사 제품을 사용하였다. a-minimal essential medium (a-MEM)은 Flow Laboratories洌서 구입하였다.
- 실험동물 - Wistar계 흰쥐 및 ICR계 생쥐는 대한 바이오링크 (충북)에서 구입하여 실험에 사용할 때까지 온도 22±2℃, 상대습도 55±5%로 유지되는 항온, 항습 사육실에서 사육하였다.
데이터처리
- E.로 표시하였으며 Student's t-test에 의해 유의성을 검정하여 p<0.05인 결과를 때얻었을 때 유의성이 있는 것으로 하였다.
이론/모형
- 횐쥐 복강 비만세포의 분리 -Kanemoto 등")의 방법에 따라분리하였다. 즉 흰쥐를 에테르로 마취시킨 후 실온에서 Tyrode buffer B (137 mM NaCl, 12 mM NaHCO3, 2.
- Compound 48/80에 의한 전신성 아나필락시-Shin 등均의 방법에 따라 실험하였다. 즉 비만세포의 탈과립 제로 compound 48/ 80 (0.
- 001-1 mg/gX 경구투여하고 30분 후에 치사시켰다. Evans blue로 염색된 피부 부위를 잘라 1 M-K0H 1 ml를 가하고 5% CO2 incubator에서 하룻밤 동안 방치하여 피부 조직을 용해시킨다음 0.6 M 인산과 아세톤 (5:13)의 혼액 9 ml를 가하여 진탕추출한 후 Katayama 등⑹의 방법에 따라 620 run에서 색소량을정량하였다.
- 세포 내 cAMP 측정 -Peachell 등纳의 방법에 따라 실험하였다. 즉, Tyrode buffer A에 부유시킨 사람 비만세포 (5X105 cells/ mZ)에 Tyrode buffer A로 조제한 LLAE (1 mg/mi)를 가하고 5% CO2 incubator로 37℃에서 배양하였다.
- 복벽 중앙선을 주의 깊게절개하고 pasteur pipette으로 복강 세척액을 채취하고 원심분리 (150xg, 10분) 하여 상징액을 분리 제거한 후 비만세포 부유안을 Tyrode buffer B에 재 부유시켰다. 세포 부유액 중 비만세포는 Yurt 등18)의 방법으로 정제하였다. 즉 Tyrode buffer B 1 mU에재부유시킨 비만세포 부유액을 22.
- 히스타민의 정량 - 세포 배양액 및 혈청 중에 있는 히스타민은 Shore 등改의 방법에 따라 정량하였다. 즉 에펜돌프 튜브에 시료 500 B를 취하여 0〕M HC1 450 B와 60% 과염소산 용액 50 山를 혼합한 후 원심분리 (400Xg, 20분)하였다.
성능/효과
- 1. LLAE는 compound 48/80에 의해 유도된 전신성 디아나필락시 디 anti-DNP IgE로 유도된 국소성 아나필락시를 농도 의존적으드 억제하였다.
- 2. LLAE는 compound 48/80에 의한 흰쥐의 복강 비만세포로부터 司스타민의 유리를 농도 의존적으로 억제하였다.
- 3. LLAE는 비만세포의 cAMP의 양을 최고 3배까지 증가시켰다. 。터한 결과로 미루어 볼 때 LLAE는 비만세포 매개 즉시형 알레 弓기 반응을 DSCG와 비슷한 수준으로 억제하였으며 , LLAE 의 알레르기반응 억제 효과는 세포 내 cAMP 함량의 증가에 의한것으私 사료된다.
- 일으키는 가장 많이 사용되는 약물이다.8)이러한 비만세포의 탈과립을 유도하는 자극에 의하여 세포 내 과립에 저장되어 있는 히스타민 등의 화학적 매개 물질이 유리되고, II 결과 말초혈관에 대한 투과성 항진과 확장작용, 점막 표면에 대한 선세포의 분비 항진작용, 기관지 평활근에 대한 수축작용 등을 일으켜 알레르기 반응이 발현하게 된다.
- 001-1 mg/mZ)를 처리하였다. Table V에서와같이 LLAE 및 DSCG는비만세포에서 compound 48/80에 의한 히스타민의 유리를 농도의존적으로 억제 시켰으며, LLAE는 0.1 mg/m/ 및 1 mg/m/의농도에서, DSCG는 0.01-1 mg/m/ 의 농도에서 유의성 있는 억제효과를 나타내었다. 히스타민 유리 억제율은 LLAE와 DSCG 가 비슷하였다.
- 그러나 compound 48/80을 투여 차.기 1시간 전에 LLAE (0.001-1 mg/g, 체중) 및 DSCG (0.0C1-1 mg/g, 체중)를 투여한 후 치사율을 관찰한 결과 농도 의존적으로 치사율이 감소하였으며, 특히 1 m以g의 농도에서는 치사율이 0%이었다. 시간 의존 실험으로 compound 48/80을 투여하고 5분 및 10분 후에 LLAE (1 mg/g, 체중) 및 DSCG (1 n@ g, 체중)을 투여한 결과 Table II에서와같이 5분 후에 LLAE 및 DSCG를 투여한 군은 0%의 치사율을 나타내었으나 10분 후에투여한 군에서는 치사율이 LLAE는 40%, DSCG는 60%이었다.
- 본 견구에서 얻어진 결과들은 LLAE가 비만세포 매개 즉시형알래 드기 반응을 DSCG와 비슷한 수준으로 억제시키고 있으므로 비 간세포 매개 즉시형 알레르기 반응의 예방과 치료에 사용될 中 있음을 시사하고 있다.
- 사람 비만세포의 cAMP 함량에 미치는 LLAE의 효과 - 사람 비만세포에 LLAE (1 mg/m/)를 가하고 배양하였을 때 Table VI 에서와 같이 cAMP의 증가는 순간적이었으며 최고치가 LLAE을가하였을 때는 LLAE를 가하지 않았을 때보다 3배 정도 증가하였다. LLAE을 첨가한 1분 후에 정점에 이르다가 2분 후에는 급격히 감소하였다.
- 0C1-1 mg/g, 체중)를 투여한 후 치사율을 관찰한 결과 농도 의존적으로 치사율이 감소하였으며, 특히 1 m以g의 농도에서는 치사율이 0%이었다. 시간 의존 실험으로 compound 48/80을 투여하고 5분 및 10분 후에 LLAE (1 mg/g, 체중) 및 DSCG (1 n@ g, 체중)을 투여한 결과 Table II에서와같이 5분 후에 LLAE 및 DSCG를 투여한 군은 0%의 치사율을 나타내었으나 10분 후에투여한 군에서는 치사율이 LLAE는 40%, DSCG는 60%이었다. 아나필락시 억제율은 LLAE와 DSCG가 비슷한 효과를 나타내었다.
- LLAE는 비만세포의 cAMP의 양을 최고 3배까지 증가시켰다. 。터한 결과로 미루어 볼 때 LLAE는 비만세포 매개 즉시형 알레 弓기 반응을 DSCG와 비슷한 수준으로 억제하였으며 , LLAE 의 알레르기반응 억제 효과는 세포 내 cAMP 함량의 증가에 의한것으私 사료된다.
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