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문제 정의
- 피부의 멜라닌 생성에 주효소로 작용하는 tyrosinase 활성을 억제하는 물질을 천연물로부터 개발하기 위하여 본 연구를 수행하였다.
- 피부의 멜라닌 생성에 주효소로 작용하는 tyrosinase 활성을 억제하는 물질을 천연물로부터 탐색하기 위하여 본 연구를 수행하여 8종의 화합물을 분리하였다. 분리된 화합물은 각각 각종 spectral data의 검토결과 liquiritigenin (1), isoliquiritigenin (2), isoliquiritigenin-2'-O-methyl ether (3), liquiritin (4), isoliquiritin (5), ononin (6), glycycoumarin (7), glycyrol (8)로 동정하였다.
가설 설정
- 이 생약은 약간의 특이한 냄새가 나며, 맛은 달고 殘留性이다.7) 감초의 성분은 대체로triterpenoidal derivatives, flavone analogs, isoflavone계의 세계 열로 구분된다. triterpenoid 계열로는 glycyrrhizin, liquoric acid, 18-p-glycyrrhetinic acid, glycyrrhetol, uralenic acid, 24-hydroxyglycyrrhetinic acid 의 methylester, glabric acid 가 분리되었고, isoflavone 계열로는 glycestrone, glycyrol, 5-0- methylglycyrol, isoglycyrol 외에 betulic acid도 분리되었으며, licoridin, 7-acetoxy-2-methyIisoflavone, 7-methoxy-2- ethylisoflavone, 7-hydroxy-2-methyl soflavone도 함유되어있다.
제안 방법
- DOPA oxidase의 활성측정은 DOPA를 기질로 하여 tyrosinase에 의하여 생성되는 반응산물인 DOPAchrome이 475nm에서 흡광도를 나타내는 점을 이용하여 시행하였다. 즉, 일정한 반응조건에서 생성된 DOPAchrome의 양을 A475 정량해서 tyrosinase의 활성을 측정하며 시료의 첨가에 의한 activity의 변화를 관찰하여 효소 활성저해 정도를 평가하였다.
- - 예비실험에서 감초의 MeOH ex를 CH2Cl2, EtOAc, I&O로 분획하여 각 분획에 대한 효소활성 억제실험을 한 결과(Table I), 유기용매층에서의 효소 활성 억제 효과가 우수한 것으로 확인되어 유기용매층을 활성분획으로 결정하였다 (Eble I).
- 1H-NMR과 13C-NMR spectrum의 signal pattern이 화합물 1의 그것과 유사하나, 각 spectrum의 aliphatic region에서 당에 기인한 sign사들이 관찰되었다. 13C-NMR spectrum에서 산소가 결합된 carbon signal 이 3개0 157.7, 163.3, 164.9)가 관찰되는 것으로 보아 liquiritigenin에 결합되어 있는 3개의 hydroxy기 중 하나에 당이 ether결합되어 있는 것으로 추정하였다. 당의 종류를 확인하기 위하여 comp.
- 1H-NMR과 13C- NMR spectrum의 signal pattern0] 화합물 2의 그것과 유사하나, 각 spectrum의 aliphatic region에서 당에 기인한 signal 들이 관찰되었다. 13C-NMR spectrum에서 산소가 결합된 carbon signal이 3개0 159.7, 165.4, 166.1)가 관찰되는 것으로 보아 liquiritigenin0, ] 결합되어 있는 3개의 hydroxyP] 중하나에 당이 ether결합되어 있는 것으로 추정하였다. 당의 종류를 확인하기 위하여 화합물 5를 화합물 4에서와 같은 방법으로 산 가수분해하여 liquiritigeniipe 읺ucose를 co-TLC 로 확인하였다.
- 13C-NMR spectrum에서 모두 16개의 carbon signal이 관찰되었는데, methoxyl기를 제외하고 산소가 결합된 carbon signal이 comp. 1과 같이 3개(6 162.1, 163.1, 163.5) 가 관찰되는 것으로 보아 isoliquiritigenin0, ] 결합된 hydroxyl 기 중의 어느 하나가 methoxyl기로 치환된 것으로 추정하고, 1H-NMR 및 13C-NMR spectral data를 표품의 문헌치와각종 spectral data를 비교하여 isoliquiritigenin-2-O-methyl ethei로 결정하였다.12)
- 당의 종류를 확인하기 위하여 comp. 4를 8% 염산-dioxane용액으로 가수분해하여 liquiritigenin과 glucose를 co-TLC로 확인하였다. HMBC spectrum에서는 glucose의 anomeric protoi과 4' 위의 carbon signal이 coupling하는 cross peak를 관찰할 수 있었다.
- 억제효과를 평가하여 data base화 하였다.6) 그 중 tyro- sinas에대한 억제 활성이 인정된 감초의 뿌리로부터 activity guided fractionation에 의하여 활성물질의 분리를 시도하였다.
- 2회 반복 추출하여 , 추출액을 감압농축하였다. MeOH 추출액을 증류수에 현탁시키고 동량의 ethyl acetate (EtOAc) 를 가한 후 분획깔때기로 수층과 EtOAc층을 분획충]는 조작을 3회 반복 실시한 후, 각각의 수층과 EtOAc층을 감압 농축하여 , EtOAC 분획과 H2O 분획을 얻었다. 얻어진 EtOAc 분획 200 g을 siHca gel column으로 다음과 같이 분획하였다.
- 즉, 일정한 반응조건에서 생성된 DOPAchrome의 양을 A475 정량해서 tyrosinase의 활성을 측정하며 시료의 첨가에 의한 activity의 변화를 관찰하여 효소 활성저해 정도를 평가하였다. Vial에 L-tyrosine 900(0.96 g/ml), L-DOPA 90 p, / (0.012 g/ml)를 가하고, 시료는 MeOH-H2O 혹은 DMSO- H2O (1:1)에 용해시켜 최종농도가 각각 0, 10, 20, 50, 100, 200 g/ml이 되도록 하여 가한다. 각 반응액의 volume이 1890µl가 되도록 50 mM NaH2PO4/Na2HPO4 buffer (50 mM, pH 6.
- 화합물 7의 1H-NMR 및 "c-NMR의 spectrum을 화합물 옹의 그것과 비교할 때, 1H-NMR spectrum에서 aromatic Held에 존재하던 singlet signal 2개 중 하나가 소실됨이 관찰되었고, 13C-NMR spectrum에서 aromatic field에 나타났던 11개의 signal 중 하나가, 160ppm 근처로 저자장 shift한 것을 관찰할 수 있었다. 그리하여 이와 관련된 화합물의1H-NMR 및 ~C-NMR의 spectral data를 비교하여 glycyrol로 결정하였다.17)
- 1)가 관찰되는 것으로 보아 liquiritigenin0, ] 결합되어 있는 3개의 hydroxyP] 중하나에 당이 ether결합되어 있는 것으로 추정하였다. 당의 종류를 확인하기 위하여 화합물 5를 화합물 4에서와 같은 방법으로 산 가수분해하여 liquiritigeniipe 읺ucose를 co-TLC 로 확인하였다. HMBC spectrum에서는 읺ucose의 anomeric proton과 4위의 carbon signal이 coupling하는 cross peak를관찰할 수 있었다.
- HMBC spectrum에서 당의 anomeric proton과 chromone의 7위의 carbon0] coupling하는 cross peak를 확인할 수 있었으며, methoxyl proton과 4위의 carbon0] coupling하는 cross peak를 확인할 수 있었다. 따라서 formononetine 7위에 hydroxyl기 대신 glucose가 ether 결합된 ononiri 이라고 결론짓고 1H-NMR 및 13C-NMR spectral data를 표준품의 그것과 비교하여 결정하였다.13-15)
- 본 연구실에서는 천연미백제 개발을 목표로 피부의 melanin polymer 생 합성 에 key enzyme으로 작용하는 tyrosinase 활성을 억제하는 물질을 천연물로부터 탐색하기 위하여 문헌에 소개되고 있는 미백효과를 갖는 전통 한약은 물론, 전국 각지에서 무작위로 채집한 60g종의 고등식물을 확보하여 이들의 MeOH 추출물에 대하여 in vitro에서의 tyrosinase 활성 억제효과를 평가하여 data base화 하였다.6) 그 중 tyro- sinas에대한 억제 활성이 인정된 감초의 뿌리로부터 activity guided fractionation에 의하여 활성물질의 분리를 시도하였다.
- 수행하여 8종의 화합물을 분리하였다. 분리된 화합물은 각각 각종 spectral data의 검토결과 liquiritigenin (1), isoliquiritigenin (2), isoliquiritigenin-2'-O-methyl ether (3), liquiritin (4), isoliquiritin (5), ononin (6), glycycoumarin (7), glycyrol (8)로 동정하였다. 이들 중 tyrosinase 활성 억제 효과는 isoliquiritigenin-2-O-methyl ether가 가장 강했으며 IC50 value는 47 M이었다.
- 4Hz로 m-coupHng하고 있는 doublet 이 관찰되어, 1, 2, 4-trisubstituted benzene Hng의 존재를 추정할 수 있었다. 상기한 부분을 뺀 나머지 I3c-NMR signal들과 aromatic region의 singlet proton signal 2개 (8 6.67, 7.94)를 종합적으로 미루어볼 때 coumarin에 1, 2, 4-3치환 benzene ring과 isoprenyl기, methoxyl기가 결합된 화합물로 추정하였다. HMBC spectrum에서 methoxyl protone)- 5위의 carbon0] coupling하는 cross peak를 관찰할 수 있었으며, 동시에 5위의 carbon과 1" proton0] coupHng하는 cross peak 를 관찰할 수 있었다.
- 또 9위의 carbon이 4위, 8위의 singlet proton과 coupling하는 cross peak가 확인되었다. 이들 관계를 종합하여 본 결과, 이 화합물을 glycycoumarin으로 결론짓고 표품의 1H-NMR 및 i3c-NMR의 spectral data를 비교하여 이ycycoumarin으로 결정하였다.16)
- HMBC spectrum에서는 읺ucose의 anomeric proton과 4위의 carbon signal이 coupling하는 cross peak를관찰할 수 있었다. 이를 종합하여 본 결과 Hquiritigenine 4 위에 glucose가 결합된 isoliquiHtin으로 결론짓고, 1H-NMR 및 i3C-NMR spectral data를 표품의 그것과 비교하여 결정하였다.14)
- HMBC spectrum에서는 glucose의 anomeric protoi과 4' 위의 carbon signal이 coupling하는 cross peak를 관찰할 수 있었다. 이를 종합하여 본 결과 liquiritigenin의 4' 위에 glucose가결합된 liquiritiii으로 결론짓고, 1H-NMR 및 13C-NMR spectral data를 표품의 문헌치와 비교하여 결정하였다
- 5) 가관찰되고 6 100~150 사이에 11개의 methine signal들이 관찰되었다. 이상의 결과로 이 화합물을 isoliquiritigenin으로 추정하고 ifLNMR 및 13C-NMR spectral data를 표품과 비교하여 isoliquiritigenin으로 결정하였다.11)
- 7)가 관찰되고 80~135 ppm 사이에 10개의 methine signal, 그리고 DEPT 135° spectrum에서 449의 methylene signal이 관찰되었다. 이상의 결과를 종합하여 본 화합물은 flavanone을 골격으로 하는 liquiritigenin으로 추정하고 1H-NMR 및 13C-NMR spectral data를 표품의 그것과 비교하여 liquiritigenin으로 결정하였다.10)
- 선광도는 JASCO의 DIP-1000 (digital polarimeter)를 사용하였다. 자외선 흡광도 측정은 Pharmacia의 Ultrospec ID 를 사용하였으며, HPLC는 Shimadzu의 LC-10A를 사용하였다. Fraction collector는 Advantec의 SF-160을 사용하였다.
- 시행하였다. 즉, 일정한 반응조건에서 생성된 DOPAchrome의 양을 A475 정량해서 tyrosinase의 활성을 측정하며 시료의 첨가에 의한 activity의 변화를 관찰하여 효소 활성저해 정도를 평가하였다. Vial에 L-tyrosine 900(0.
대상 데이터
- - 시료로 사용한 감초의 뿌리는 1999년 11월에 대구 시내 약전골목에서 구입하였고, MeOH extract의 TLC pattern 등을 통하여 예비실험시 사용한 시료와 같은 시료임을 확인하였으며, 충북대학교 이경순 교수로부터 감정을 받았고, 표본은 본대학의 표본실에 보관하고 있다(#960073).
- TLC plate는 Kieselgel 60 (Merck) 및 RP- 18 (Whatman)을 사용하였다. Column chromatography용 고정 상은 silicagel (70-230 mesh, Merck), Sephadex LH-20 (25-100 µ, Sigma), MCI-gel CHP-20P (75-15011, Mitsubishi Chem. Co.), RP-18 (40-63 gm, Merck), Cosmosil (Nacalai tesque) 등을 사용하였다. 발색 시약으로는 vanillinsulfuric acid 시액, 10% sulfuric acid 시액, anisaldehyde sulfuric acid 시액을 사용하였다.
- 자외선 흡광도 측정은 Pharmacia의 Ultrospec ID 를 사용하였으며, HPLC는 Shimadzu의 LC-10A를 사용하였다. Fraction collector는 Advantec의 SF-160을 사용하였다. i3C-NMR (250, 62.
- Fraction collector는 Advantec의 SF-160을 사용하였다. i3C-NMR (250, 62.5 MHZ) spectrometer를 사용하였으며, 내부표준물질로는 tetramethylsilane (TMS)를 사용하여 part per milion (ppm)단위로 나타내었다.
- ), RP-18 (40-63 gm, Merck), Cosmosil (Nacalai tesque) 등을 사용하였다. 발색 시약으로는 vanillinsulfuric acid 시액, 10% sulfuric acid 시액, anisaldehyde sulfuric acid 시액을 사용하였다. Tyrosinase 활성시험에 사용된 시 약은 mushroom tyrosinase (Sigma), L-tyrosine (Sigma), 3, 4-dihydroxyphenylalanine (DOPA) (Sigma) 등이며, buffer로는 Sodium-phosphate bufifei를 사용하였다.
이론/모형
- - 융점은 Fisher-Johns의 Melting Point Apparatus를 사용하여 측정하였으며, 온도는 보정하지 않았다. 선광도는 JASCO의 DIP-1000 (digital polarimeter)를 사용하였다.
- 사용하여 측정하였으며, 온도는 보정하지 않았다. 선광도는 JASCO의 DIP-1000 (digital polarimeter)를 사용하였다. 자외선 흡광도 측정은 Pharmacia의 Ultrospec ID 를 사용하였으며, HPLC는 Shimadzu의 LC-10A를 사용하였다.
성능/효과
- 94)를 종합적으로 미루어볼 때 coumarin에 1, 2, 4-3치환 benzene ring과 isoprenyl기, methoxyl기가 결합된 화합물로 추정하였다. HMBC spectrum에서 methoxyl protone)- 5위의 carbon0] coupling하는 cross peak를 관찰할 수 있었으며, 동시에 5위의 carbon과 1" proton0] coupHng하는 cross peak 를 관찰할 수 있었다. 또 9위의 carbon이 4위, 8위의 singlet proton과 coupling하는 cross peak가 확인되었다.
- 화합물 7의 1H-NMR 및 "c-NMR의 spectrum을 화합물 옹의 그것과 비교할 때, 1H-NMR spectrum에서 aromatic Held에 존재하던 singlet signal 2개 중 하나가 소실됨이 관찰되었고, 13C-NMR spectrum에서 aromatic field에 나타났던 11개의 signal 중 하나가, 160ppm 근처로 저자장 shift한 것을 관찰할 수 있었다. 그리하여 이와 관련된 화합물의1H-NMR 및 ~C-NMR의 spectral data를 비교하여 glycyrol로 결정하였다.
- 보라색으로 발색하였다. 1H-NMR에서 2개의 독립된 methyl proton signal (8 1.63, 1.75)이 관찰되고, 1개의 geminal methylene proton signal (8 3.34)과 저 자장 shifl하여 관찰되는 methine proton signal 05.21)이 coupling 하는 것이 관찰되고, 동시에 '3C-NMR의 signal patterne 볼 때 isoprenyl기 (8 17.0, 22.4, 24.9, 122.7, 130.8)의 존재를 추정할 수 있었다. 또한 서iphatic region에서 methoxyl기에 해당하는 proton signal 03.
- 6은 4-methoxyphenylchromonee| 골격을 갖는 것으로 추정된다. 4-Methoxyphenyl group의 결합위치는 chro- mone핵의 2 혹은 3위로 추정되나, 2위에 귀속되는 proton signal이 8 8.43으로 매우 저자장 shift하여 4-methoxyphenyl groupe chromone 핵의 3위에 결합된 것으로 결론지었다. HMBC spectrum에서 당의 anomeric proton과 chromone의 7위의 carbon0] coupling하는 cross peak를 확인할 수 있었으며, methoxyl proton과 4위의 carbon0] coupling하는 cross peak를 확인할 수 있었다.
- 43으로 매우 저자장 shift하여 4-methoxyphenyl groupe chromone 핵의 3위에 결합된 것으로 결론지었다. HMBC spectrum에서 당의 anomeric proton과 chromone의 7위의 carbon0] coupling하는 cross peak를 확인할 수 있었으며, methoxyl proton과 4위의 carbon0] coupling하는 cross peak를 확인할 수 있었다. 따라서 formononetine 7위에 hydroxyl기 대신 glucose가 ether 결합된 ononiri 이라고 결론짓고 1H-NMR 및 13C-NMR spectral data를 표준품의 그것과 비교하여 결정하였다.
- 7) 감초의 성분은 대체로triterpenoidal derivatives, flavone analogs, isoflavone계의 세계 열로 구분된다. triterpenoid 계열로는 glycyrrhizin, liquoric acid, 18-p-glycyrrhetinic acid, glycyrrhetol, uralenic acid, 24-hydroxyglycyrrhetinic acid 의 methylester, glabric acid 가 분리되었고, isoflavone 계열로는 glycestrone, glycyrol, 5-0- methylglycyrol, isoglycyrol 외에 betulic acid도 분리되었으며, licoridin, 7-acetoxy-2-methyIisoflavone, 7-methoxy-2- ethylisoflavone, 7-hydroxy-2-methyl soflavone도 함유되어있다. flavone 계통으로는 liquiritigenin, liquiritin, neoliqui- ritin, liqurazide등이 분리되었다/ 감초의 생리활성으로는 18-p-glycyrrhetinic acid의 3-acetylate 및 amide는 항궤양과 더불어 항염효과가 있으며, glycyrrhetinic acid의 butyrate, salicylate는 항염증효과를 갖고 진통, 해열 효과가 있으며,glycyrrhetinic acid의 hydrosuccinate는 상품화되어 (carbenox- olone)있어 pyloric sphinctei에 작용하여 강력한 항궤양작용을 나타낸다.
- 본 연구실에서 확보하고 있는 600여종의 고등식물에 대한 효소활성 database를 토대로 tyrosinase 활성 억제 효과가 뛰어난 감초의 뿌리를 MeOH로 추출하여 엑스를 만들고, EtOAc, HQ로 분획하여 각각에 대한 활성을 검토한 결과, 유기용매 분획이 강한 활성을 보여 유기용매 분획에 대하여 활성물질의 분리를 시도하여 8종의 화합물을 분리하였다.
- 하여 측정하였으며 결과를 Table 2에 나타내었다. 분리된 화합물 중 isoliquiritigenin-2'-O-methyl ether의 효소활성억제효과가 가장 우수한 것으로 나타났으나, 분리된 화합물 모두 kojic acid 보다는 약한 활성을 나타내었다.
- 분리된 화합물은 각각 각종 spectral data의 검토결과 liquiritigenin (1), isoliquiritigenin (2), isoliquiritigenin-2'-O-methyl ether (3), liquiritin (4), isoliquiritin (5), ononin (6), glycycoumarin (7), glycyrol (8)로 동정하였다. 이들 중 tyrosinase 활성 억제 효과는 isoliquiritigenin-2-O-methyl ether가 가장 강했으며 IC50 value는 47 M이었다.
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