선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 본 연구에서는 천궁물추출액을 이용하여 간암예방 활성중 발암개시과정의 저해물질 (inhibitor of tumor initiation)의 활성검정을 위하여 7, 12-dimethylbenz[a]anthracene(DMBA)- induced CYP1A1 activity와 B[a]P-DNA binding 억제효과 그리 고 quinone reductase (QR), glutathione S-transferase (GST), glutathione (GSH) 유도작용으로 실험에 착수하였다.
- 본 연구에서는 천궁물추출액이 CYP1A1 활성, quinone reductase (QR), glutathione S-transferase (GST) 효소활성 과 glutathione (GSH)함량에 미치는 영향을 측정하며 정상 간세포에서 benzo[a]pyrene-DNA 결합에 미치는 억제효과를 측정하여 간암유발에 대한 예방활성을 측정하고자 한다.
제안 방법
- 모든 시약들을 잘 섞은 후, 37℃에서 4분간 반응시키고, 2 m/의 methanol로 반응을 종결시켰다. 2,000×g에서 20분 동안 원심분리하여 상층액을 취하고, 형광분광광도계 (BIO-TEK SFM25, USA)로 측정 (550nm excitation and 585 nm emission)하였다. 양성대 조군은 p-naphtho-flavone을 사용하였고, 음성대조군으로는 증류수를 사용하였다.
- 하였다.7즉, 흰쥐로부터 분리한 microsomal protein (2 mg/mZ) 200ul에 640 W의 0.05 M Tris-HCl buffer (pH 7.5), 100ul의 BSA (10 mg/m/ in Tris-HCl buffer), 20 ul의 0.25 M MgCl2, 40ul의 cofactor solution, 2.5 unit의 glucose-6-phosphate dehydrogenase, 10ul의 기 질(Img of ethoxyresorufin in 10 ml of methanol), 10 W의 천궁물주출액을 농도별로 첨가하였다. 모든 시약들을 잘 섞은 후, 37℃에서 4분간 반응시키고, 2 m/의 methanol로 반응을 종결시켰다.
- CYP1A1 는 ethoxyresorufin-O-deethylase (EROD) 활성으로 측정하였다.7즉, 흰쥐로부터 분리한 microsomal protein (2 mg/mZ) 200ul에 640 W의 0.
- 회수하였다. DNA pellet은 70% ethanol에 세척한 뒤 500 ul of 10 mM Tris-1 mM EDTA (pH 8.0) buffer로 현탁하였으며, RNA를 제거하기 위하여 RNase A와 RNase T1 을 각각 5 ul씩 첨 가하여 37℃에서 1시 간동안 처 리 하였다. DNA 함유량은 260 nm (1 A260 nm imit=50 ug)에서 흡광도를 측정하여 결정하였다.
- 상온에서 5분간 교반하면서 반응시킨 후, microplate reader, 450nm에서 흡광도를 측정하였다. GSH 함량은 GSH 표준곡선으로 계산하였고, nmol/mg protein으로 표시하였으며, GSH 함량의 비는 대조군에 의한 GSH 양과 시료에 의해 생성된 GSH 양의 비율로 측정하였다.
- 5% SDS를 50% ethanol에 녹여 각 well에 200 ul씩 첨가하고 37℃에서 1시간 반응시킨 뒤, 630nm에서 흡광도를 측정하였다. QR specific activity 계산은 분당 환원된 MTT의 흡광도와 crystal violet의 홉광도에 의해 산출하였고, QR의 활성유도는 대조군의 활성과 시료에 의한 활성의 비로 계산하였다.
- 수 있다. 따라서 천궁물추출액에 의한 cytochrome P4501A1 효소활성에 미치는 영향을 각 농도별로 측정하였다. 천궁물추출액은 3, 15, 30, 90과 150 mg/m/ 농도에서 각각 6.
- 생성 유도효과는 Prochaska와 Samamaiif 의 방법을 수정하여 사용하였다. l×104개의 Hepalclc7 세포(mouse hepatoma)를 200)ul의 MEM 배지에 부유시켜 96-well plate에 접종하였다.
- 세포내 총 단백질 및 마이크로 좀내 단백 질은 bicinchoninic acid protein kit를 사용하여 BSA를 표준 단백질 용액으로 이용한 표준검량선을 구하고 그 양을 산출하였다.
- Vbucher specimen은 동국대학교 난치병한양방치료연구소에 보관되어 있다. 천궁물추출액(Cnidii Rhizoma water-extract, CRW)은 천궁 60 g을 조말하여 증류수 400 mZ을 가한 뒤 rotary evaporator (BUCHI RE121, Switzerland)에서 3시간 전탕하여 추출하고 여과한 후 4℃, 3,000 ipm에서 10분간 원심분리하여 얻은 상층액 200 mZ을 감압농축하여 pH 7.4로 적정한 후 저온에서 24시간 방치하여 membrane filter (0.22 um, Whatman. Gennany)로 여과하고 동결건조하였다. 이때 100 mZ 당 3.
대상 데이터
- 1x106개 의 마우스 정 상 간세 포(NCTC clone-1469)를 5 ml의 NCTC 136 배지에 부유시켜 6-well plate에 접종시키고 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 18시간 경과 후, 배지를 교환하여 천궁물추출액을 처리하고, 10uM [3H]B[a]Pi- 처리하여 12시간동안 배양하였다.
- Minimal essential medium eagle's (MEM), NCTC-135 medium, antibiotics, dimethylsulfoxide (DMSO),3, 4, 5-dimethylthiazol-2-yl-2, 5-diphenyltetrazolium bromide(MTT), ethyl alcohol anhydrous, Tris-HCl, bovine serum albumin (BSA), Tween-20, flavin adenine dinucletide (FAD), glucose-6-phosphate, P-nicotinamide adenine dinucleotide phosphate(p-NADP), yeast glucose-6-phosphate dehydrogenase, menadione, dicuomarol, crystal violet, NADP+, NaEDTA, triton X-100, 5, 5'-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid) (DTNB), 7, 12-dimethylbenz[a]anthracene (DMBA), glutathione reductase, ethoxyresorufin, bicinchoninic acid protein kit는 Sigma사 (St. Louis, MO, US A) 에서 구입하였고, fetal calf serum(FBS)은 JBI사(대구, 한국)에서 구입하였다. 기타 시약은 세포 배양용 및 분석용 특급시약을 사용하였다.
- 본 실험에서 사용한 천궁(Cnidii Rhizoma)은 동국대학교 부속한방병원에서 구입한 강원도산 천궁을 정선하여 사용하였다. Vbucher specimen은 동국대학교 난치병한양방치료연구소에 보관되어 있다.
- 2,000×g에서 20분 동안 원심분리하여 상층액을 취하고, 형광분광광도계 (BIO-TEK SFM25, USA)로 측정 (550nm excitation and 585 nm emission)하였다. 양성대 조군은 p-naphtho-flavone을 사용하였고, 음성대조군으로는 증류수를 사용하였다. 이 실험은 S회 반복 실험으로 수행하였으며, 각각의 결과는 control0!] 대한 각 시료들의 저해도 정도를 percentage로 나타내었다.
이론/모형
- Sprague-Dawley계 흰쥐의 간 조직으로부터 마이크로좀의 분리는 Phol과 Fouts6의 방법을 참고하여 실시하였고, 관류법으로 DMBA (30 mg/마리)를 처리하였다. 24시간 뒤 흰쥐를.
성능/효과
- B[a]P-DNA adducts는 폐암환자의 폐조직에서도 발견되었으며 음식물에 포함된 여러 식물에서 phenols 성분이 발암과정을 억제하는 것으로 알려져 있고 그 중에서 ellagic acid가 B[a]P와 DNA의 결합을 저해하는 것으로 알려져 있으며, 이들의 암예방활성은 B[a]P epoxide와 adductsf- 형성하여 무독화한다고 보고하고 있다.15 본 연구결과 천궁물추출액을 이용하여 DMBA에 의해 유도된 cytochrome P4501A1 효소의 억제율을 측정한 결과, 이 효소의 활성을 저해함을 관찰할 수 있었다. 또한 천궁물추출액의 B[a]P 대사물과 DNA의 adduct 형성 저해효과를 측정한 결과 양성대조군인 ellagic acid보다는 낮으나 3 mg/mZ에서 33.
- 따라서 발암물질이 DNA와 결합하여 손상을 주게 되는 과정을 저해한다면 암억제 효과가 있을 것이다. 따라서 천궁물추출액에 의한 benzo[a]pyrene-DNA binding inhibition 효과를 알아보기 위해 NCTC-clone 1469 세포를 이용하여 실험한 결과, 3mg/mZ에서 33.3%의 저해 효과를 나타내었으며(Fig. 2), 양성대조군인 ellagic acid는 54.7%의 억제효과가 있었다.
- 5% 농도의 dimethyl fiimaratef- 투여한 결과, 간, 신장 등의 각 조직에서 GST와 QR의 활성이 증가하였다고 주장하였다. 따라서, 천궁물추출액에 의해 마우스의 간 세포에서 암예방 효소의 활성이 증가된 것으로 보아 천궁물추출액은 외부물질이나 대사산물에 의해 일어날 수 있는 암발생중 간암발생에 억제효과가 있는 것으로 사료된다.
- 천궁물추출액은 농도의존적으로 B[a]P의 대사와 관련된 cytochrome P4501A1 의 저해효과가 있었으며 B[a]P과 세포의 DNA 결합을 매우 강하게 억제하였다. 또한 발암물질을 무독성화시키는 quinone reductase 생성 유도를 마우스의 간암세포인 Hepalclc7에서 측정한 결과 QR 생성이 유도되었다. 또한 천궁물추출액은 Hepalclc7 세포에서 GST 활성을 증가시키는 효과가 있었으나 GSH 함량변화에는 큰 영향을 미치지 못했다.
- 15 본 연구결과 천궁물추출액을 이용하여 DMBA에 의해 유도된 cytochrome P4501A1 효소의 억제율을 측정한 결과, 이 효소의 활성을 저해함을 관찰할 수 있었다. 또한 천궁물추출액의 B[a]P 대사물과 DNA의 adduct 형성 저해효과를 측정한 결과 양성대조군인 ellagic acid보다는 낮으나 3 mg/mZ에서 33.3%의 높은 저해효과를 나타내었다(Fig. 2). 현재 , cytochrome P4501A1 을 억제시키는 물질로 vitamin A, phosphorothioate oligonucleotide 등이 알려져 있다.
- GST는 유리기 (Bee radical)를 파괴하여 반응성이 높은 산소들로부터 세포를 보호한다. 본 실험결과 천궁물추출액은 마우스 간암세포에서 GST의 활성을 증가시켰으나 GSH 생성에는 별다른 영향을 나타내지 못했다. 이것은 곧 생체에서 발생한 산화물질과 기타의 독성물질을 무독화시킬 것으로 추측할 수 있다.
- 3). 이 결과에 의하면 천궁물추출액은 quinone에 의한 세포내 독성 및 세포내 DNA손상을 제거 할 것으로 추측된다.
- 천궁물추출액에 의한 GST 활성도를 관찰한 결과, 3, 15, 30과 90mg/m/농도에서 control에 비해 각각 1.7배, 2.1배, 1.5배 , 1.3배의 GST 활성이 나타났으며 , 15mg/mZ 농도에서 최대의 효소활성 유도효과를 관찰할 수 있었다(Fig. 4). 한편 천궁물추출액에 의한 GSH의 유도효과에는 별다른 영향을 나타내지 못했다.
- 따라서 천궁물추출액에 의한 cytochrome P4501A1 효소활성에 미치는 영향을 각 농도별로 측정하였다. 천궁물추출액은 3, 15, 30, 90과 150 mg/m/ 농도에서 각각 6.0%, 5.0%, 11.3%, 15.1%과 17.0%의 저해율이 나타났으므로(Fig. 1), 천궁물추출물이 cytochrome P4501A1 활성을 저해시키는 효과가 있음을 알 수 있었다.
- 천궁물추출액은 농도의존적으로 B[a]P의 대사와 관련된 cytochrome P4501A1 의 저해효과가 있었으며 B[a]P과 세포의 DNA 결합을 매우 강하게 억제하였다. 또한 발암물질을 무독성화시키는 quinone reductase 생성 유도를 마우스의 간암세포인 Hepalclc7에서 측정한 결과 QR 생성이 유도되었다.
- 그러므로 이상적 인 암예방물질은 암예방활성을 가진 monofunctional 효소 유도체이다. 천궁물추출액은 마우스 liver carcinoma인 Hepalclc7 세포를 이용한 in vitro상에서의 QR 생성 유도효과를 측정한 결과, 30 mg/m/ 농도에서 2.5배의 QR 생성 유도율을 보였다. 양성대조군인 P-naphthoflavone(3)_iM)과 ellagic acid(50UM)는 각각 3.
- 천궁물추출액의 QR 생성의 유도율을 측정 한 결과, 3, 15, 30과 90mg/mZ에서 각각 1.2배, 2.0배, 2.5배, 1.9배의 유의성 있는 증가를 나타내었다(Fig. 3). 이 결과에 의하면 천궁물추출액은 quinone에 의한 세포내 독성 및 세포내 DNA손상을 제거 할 것으로 추측된다.
후속연구
- 특히 환경성발암물질인 polyaromatic hydrocarbones (PAHs)류의 화합물의 일종인 benzo[a]pyrene(B|a]P)는 세포독성, 발암성 및 돌연변이원성 이 있는 물질로서 이는 phase I 효소인 cytochrome P450 1A1(CYP1A1)에 의해 대사되어 불안전한 반응중간체인 7, 8-dihydro-9, 10-epoxybenzo[a]pyrene^ 생성하게 되는데 이 중간체는 반응성 이 매우 높아 그 구조중 C10의 carbonium ion의 상태의 것이 세포내 고분자와 반응을 하여 발암을 나타낸다고 알려져 있다.2)따라서 B[a]P에 의한 CYPlAl 대사계 및 이들의 해독에 관련된 효소의 변화는 간암의 유발 및 해독과 관련된 중요한 효소지표로 응용될 수 있다고 판단된다.
- 1배의 생성 유도율을 나타내었다. 따라서 천궁물추출액은 돌연변이원성, 발암물질의 대사과정시 생성된 quinone에 의한 독성 및 DNA 손상을 완화시켜줄 것으로 기대된다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.