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문제 정의
- 그러나 서양측백나무는 이러한 조경적 측면에서 식재되어 이용되고 있으나 식물정유 관련 연구는 전무한 실정이다. 본 연구의 목적은 서양측백나무로부터 식물정유를 추출하고, 이들의 주요성분을 GC-MS로 구명하고자 하였으며, 얻어진 정유 성분의 항균활성, DPPH radical 소거능, 그리고 살충작용을 조사하여 서양 측백나무 정 유성분의 이용성을 모색하고자 하였다.
제안 방법
- DPPH를 에탄올에 용해한 후 1.0X10T M 모액으로 만든 후, 시 험구에 최종 농도가 30 이 되도록 처 리하였고, 30, 35, 40, 45분 동안 암상태에 두었다. 시험구는 서양측백나무 정유를 24, 48, 72, 96 ㎕/㎖/의 농도로 처리되었으며, 70% 에탄올을 대조구로 하였다.
- HP 5890 Series H GC, columne HP-1 (60 mm x 0.25 mm x 0.25 qm), carrier gas로는 He (1 mℓ/min.), injection 온도는 250℃, oven 온도는 50℃ (5 min.) ~ 240℃ (22 min.) / 3℃ 승온, injection volumee 1 ㎕ injection mode는 Split (100:l) 조건에서 성분들을 분석하였으며, HP 5971 MSD (Mass Selective Detector) 에서 mass range : 28~550, acquisition mode : scan mode 조건으로 성분들을 정 량하였다,
- 측정하였다. 배지 1 ㎖당 1 X 108 개의 세포가 포함되도록 하여 50℃ 용융한천배지에 매립하여 항균활성 측정용 평판배지를 조제하였다. 항균활성 검정을 위해 정유 원액 및 희석액 50 ㎕를 loading하여 건조된 paper disc (08 mm, Adventec) 를 시험미생물이 접종된 평판배지 위에 올려놓고 세균의 경우 37℃, 효모와 곰팡이의 경우 28℃의 incubator에서 24~72시간 incubation하여 paper disc 주위에 형성된 생육저해환 (inhibition zone) 직경을 측정하여 항균활성을 나타내었다.
- 살충효과는 빨간 집모기를 대상으로 분무(spraying), 훈증(fumigation), 및 자연 증발에 의해 검정하였으며, 서양측 백나무 정유는 dodecane에 일정농도로 분산하여 시료로 사용하였다. 분무에 의한 검정은 50X50X50 cm 크기의 아크릴 상자에 집모기를 20마리씩 방사하고, dodecane에 일정한 농도로 분산시킨 서양측백나무 정유 용액을 분무 기로 약 0.16 g씩 분무하여 상온에서 시간 경과에 따른 집 모기 살충효과를 살펴보았다. 훈증에 의한 집모기 살충효 과 검정은 아크릴 상자에 집모기 20마리를 방사하고 dodecane에 분산시킨 서양측백나무 정유 및 증류수를 시 판 액체모기약 훈증기에서 3시간 훈증시키면서 상온에서 시간 경과에 따른 집모기 살충효과를 조사하였다.
- 추출하였다. 분쇄된 서 양측백나무 잎 125 g을 1 ℓ의 증류수가 든 추출기에 넣고 3 시간 동안 추출한 후 수율을 조사하였다. 정유추출은 2 kW 용량의 heating mantle를 사용하였으며, 저비중 및 고비중의 정유추출을 위해 pyrex 재질의 추출장비를 직접 제작하여 사용하였다 (Fig.
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6. 살충작용
살충효과는 빨간 집모기를 대상으로 분무(spraying), 훈증(fumigation), 및 자연 증발에 의해 검정하였으며, 서양측 백나무 정유는 dodecane에 일정농도로 분산하여 시료로 사용하였다. 분무에 의한 검정은 50X50X50 cm 크기의 아크릴 상자에 집모기를 20마리씩 방사하고, dodecane에 일정한 농도로 분산시킨 서양측백나무 정유 용액을 분무 기로 약 0.
- 서양측백나무 정유의 항균활성을 그램 양성 및 그램 음성의 박테리 아, 효모 및 곰팡이 등 28종의 공시균주에 대하여 검토하였다 (Table 2). 서양측백나무 정유의 박테리아에 대한 항균력은 Streptococcus pyogenese Streptococcus mutans에서 0.
- 서양측백나무의 잎으로부터 정유를 steam distillation 법으로 추출하고, GC-MS로 정유 조성성분을 분석하였으며, 28종의 미생물종을 대상으로 항균활성을, DPPH법으로 항산화 활성을, 집모기 에 대한 살충효과를 검정하였다. 서양측백나무 정유 주성분은 monoterpene류였으며, d-isothujone, 1-fenchone, a-thujone, camphor, terpin-4-01 순으로 나타났다.
- 시료 전처리의 효과를 구명하기 위해 잎을 2 cm의 길이로 절단한 후, 가정용 믹서기에 넣고 1분간 분쇄한 후 정유를 추출하였다. 분쇄된 서 양측백나무 잎 125 g을 1 ℓ의 증류수가 든 추출기에 넣고 3 시간 동안 추출한 후 수율을 조사하였다.
- 0X10T M 모액으로 만든 후, 시 험구에 최종 농도가 30 이 되도록 처 리하였고, 30, 35, 40, 45분 동안 암상태에 두었다. 시험구는 서양측백나무 정유를 24, 48, 72, 96 ㎕/㎖/의 농도로 처리되었으며, 70% 에탄올을 대조구로 하였다. 그 후 반응액은 UV spectrophotometer (Milton Roy, model 301) 517 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 잎의 전처리 에 따른 추출효율을 검 정하기 위해 잎을 2 cm 의 길이로 절단한 잎 125 g을 증류수 1 ℓ에 넣어 추출한 처리구와 동량의 잎을 동일한 부피의 증류수에 넣어 가정용 믹서기로 분쇄한 후 추출하였다. 서양측백나무에서 정유 수율은 건물중 당 평균 0.
- 훈증에 의한 집모기 살충효 과 검정은 아크릴 상자에 집모기 20마리를 방사하고 dodecane에 분산시킨 서양측백나무 정유 및 증류수를 시 판 액체모기약 훈증기에서 3시간 훈증시키면서 상온에서 시간 경과에 따른 집모기 살충효과를 조사하였다. 자연증 발에 의한 살충효과 검정은 아크릴 상자에 집모기성충을 20마리씩 방사하고 직경 7 cm 크기의 알루미늄 접시에서 양측백나무 정유 원액을 1 ㎖씩 분주하고 상온에서 증발 시켜 시간 경과에 따른 집모기 살충효과를 검증하였다. 이때 10시간 경과.
- 분쇄된 서 양측백나무 잎 125 g을 1 ℓ의 증류수가 든 추출기에 넣고 3 시간 동안 추출한 후 수율을 조사하였다. 정유추출은 2 kW 용량의 heating mantle를 사용하였으며, 저비중 및 고비중의 정유추출을 위해 pyrex 재질의 추출장비를 직접 제작하여 사용하였다 (Fig. 1). 최종 추출된 정유의 양은 추출 종료 후 1 시간 동안 충분히 냉각시킨 다음 추출장치에 부착된 게이지로 측정하였다.
- 1). 최종 추출된 정유의 양은 추출 종료 후 1 시간 동안 충분히 냉각시킨 다음 추출장치에 부착된 게이지로 측정하였다. 채취한 잎의 함수율은 항온 건조기를 이용한 함수율 측정법 에 의거하여 실시하였으며, 추출된 정유의 수율은 다음의 공식에 의해서 계산하였다.
- 배지 1 ㎖당 1 X 108 개의 세포가 포함되도록 하여 50℃ 용융한천배지에 매립하여 항균활성 측정용 평판배지를 조제하였다. 항균활성 검정을 위해 정유 원액 및 희석액 50 ㎕를 loading하여 건조된 paper disc (08 mm, Adventec) 를 시험미생물이 접종된 평판배지 위에 올려놓고 세균의 경우 37℃, 효모와 곰팡이의 경우 28℃의 incubator에서 24~72시간 incubation하여 paper disc 주위에 형성된 생육저해환 (inhibition zone) 직경을 측정하여 항균활성을 나타내었다.
- 16 g씩 분무하여 상온에서 시간 경과에 따른 집 모기 살충효과를 살펴보았다. 훈증에 의한 집모기 살충효 과 검정은 아크릴 상자에 집모기 20마리를 방사하고 dodecane에 분산시킨 서양측백나무 정유 및 증류수를 시 판 액체모기약 훈증기에서 3시간 훈증시키면서 상온에서 시간 경과에 따른 집모기 살충효과를 조사하였다. 자연증 발에 의한 살충효과 검정은 아크릴 상자에 집모기성충을 20마리씩 방사하고 직경 7 cm 크기의 알루미늄 접시에서 양측백나무 정유 원액을 1 ㎖씩 분주하고 상온에서 증발 시켜 시간 경과에 따른 집모기 살충효과를 검증하였다.
대상 데이터
- 등 7 종을 사용하였다. 곰팡이 균주로는 Alternaria alternata KCTC 6972, Aspergillus niger KCTC 1225, Aspergillus oryzae KCCM 11371, Aureobasidium pullulans KCTC 6081, Botrytis cinerea KCTC 6973, Fusarium solani KCTC 6326, Mucor rouxii KCCM 60146, Penicillium citrinum KCTC 6972, Pityrosoprum ovale KCCM 11894, Rhizopus oryzae KCTC 6945, Saccharomyces cerevisiae KCTC 7904, Tricoderma viride KCTC 6047 등 12 종 및 Candida albicans KCTC 7121, Candida tropicalis KCTC 7212 등 효모 2종을 생명공학연구원 유전자원센터와 한국종균협회로부터 분양받아 공시균주로 사용하였다.
- 본 연구에 사용된 수종은 경상대학교 (경남 진주시 소재) 구내에서 생육하고 있는 수령 30~40년생의 서양측백나무를 대상으로 하였으며, 2003년 6월에 잎을 채취하여 실험에 사용하였다. 잎의 채취는 지면으로부터 높이 2 m부근의 가지를 절지한 후 잎을 분리하였다.
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4. 항균화성
항균활성 측정을 위해 사용된 균주는 Gram negative bacteria로 Escherichia coli KCTC 1682, Klesiella pneumoniae KCTC 2208, Proteus vulgaris KCTC 2433, Pseudomoanas aeruginosa KCTC 1750, Salmonella typhymurium KCTC 1925, Shigella flexineri KCTC 2008, Vibrio vulnificus KCTC 2980 등 7종, Gram positive 균주로는 Bacillus cereus KCTC 1012, Lactobacillus plantarum KCTC 1048, Leuconostoc mesenteroides KCTC 3532, Listeria monocytogenes KCTC 3444, Staphylococcus aureus KCTC 1916, Streptococcus pyogenes KCTC 3208, Streptococcus mutans KCTC 3065 등 7 종을 사용하였다. 곰팡이 균주로는 Alternaria alternata KCTC 6972, Aspergillus niger KCTC 1225, Aspergillus oryzae KCCM 11371, Aureobasidium pullulans KCTC 6081, Botrytis cinerea KCTC 6973, Fusarium solani KCTC 6326, Mucor rouxii KCCM 60146, Penicillium citrinum KCTC 6972, Pityrosoprum ovale KCCM 11894, Rhizopus oryzae KCTC 6945, Saccharomyces cerevisiae KCTC 7904, Tricoderma viride KCTC 6047 등 12 종 및 Candida albicans KCTC 7121, Candida tropicalis KCTC 7212 등 효모 2종을 생명공학연구원 유전자원센터와 한국종균협회로부터 분양받아 공시균주로 사용하였다.
데이터처리
- 최종 수율은 저비중과 고비중 정유수율을 합하고 이들의 평균값으로 나타내었다. 모든 실험은 3 반복으로 행하였으며, 결과는 평균으로 나타내었다.
이론/모형
- 최종 추출된 정유의 양은 추출 종료 후 1 시간 동안 충분히 냉각시킨 다음 추출장치에 부착된 게이지로 측정하였다. 채취한 잎의 함수율은 항온 건조기를 이용한 함수율 측정법 에 의거하여 실시하였으며, 추출된 정유의 수율은 다음의 공식에 의해서 계산하였다. 최종 수율은 저비중과 고비중 정유수율을 합하고 이들의 평균값으로 나타내었다.
- 항균력 검정은 Zaika (1988)의 방법을 응용한 한천배지 확산법 (disc-agar plate diffusion method)과 액체배양법으로 측정하였다. 배지 1 ㎖당 1 X 108 개의 세포가 포함되도록 하여 50℃ 용융한천배지에 매립하여 항균활성 측정용 평판배지를 조제하였다.
성능/효과
- 025 ㎕/㎖의 MIC값을 보여 가장 높게 나타났으며, Listeria monocytogenes, Shigella flexineri, Leuconostoc mesenteroides, Bacillus cereus, 및 Streptococcus mutans에서도 강한 항균력을 보였다. 그램양성균과 음성균을 각각 7종씩 조사한 결과 서양측백나무의 정유는 그램음성균이 그램 양성균에 비해 항균 활성이 높았다. 또한 서 양측백나무 정 유는 2종 효모와 12종의 곰팡이균 중에서 Candida a/bicans에 대해 0.
- 증류수 또는 dodecane을 사용한 대조구에서는 집모기에 대한 살충 효과가 없었다. 그러나 정유 처리시 각 처리 농도별로 살충 효과에 있어 차이는 있었지만, 결국 시간에 지남에 따라 100%의 집모기 퇴 치 효과를 보였다.
- 그램양성균과 음성균을 각각 7종씩 조사한 결과 서양측백나무의 정유는 그램음성균이 그램 양성균에 비해 항균 활성이 높았다. 또한 서 양측백나무 정 유는 2종 효모와 12종의 곰팡이균 중에서 Candida a/bicans에 대해 0.025 ㎕/㎖의 MIC값으로 가장 높은 항균 활성을 보였으며, Alternaria alternata, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Saccharomyces cerevisiae, Botrytis cinerea와 같은 곰팡이에 대해서도 매우 강한 항균활성을 보였다. 특히 효모의 경우 사용된 두 균주간 항균 활성은 매우 차이가 크게 나타났다.
- 검정하였다. 서양측백나무 정유 주성분은 monoterpene류였으며, d-isothujone, 1-fenchone, a-thujone, camphor, terpin-4-01 순으로 나타났다. 정유의 박테리아에 대한 항균력은 박테리아 중 Streptococcus pyogenes에서, 그리고 효모 및 곰팡이 중 Candida albicans에서 가장 높게 나타났다.
- 서양측백나무 정유는 박테리아, 효모 및 곰팡이에 대한 넓은 항균 스펙트럼을 가지고 있었고, 항산화활성과 집모기 퇴치 효과 등의 다양한 생리활성을 가지는 것으로 나타났다. 넓은 항균 스펙트럼은 이 정유가 보존제 등 항균 소재로 다양하게 이용되는 가능성을 제시하고 있다.
- 서양측백나무 정유의 기타 생리활성을 검토한 결과 항산화 활성은 정유 농도가 높아질수록 높게 나타났다 (Fig. 3). 대조구는 시간에 관계없이 0.
- (Table 2). 서양측백나무 정유의 박테리아에 대한 항균력은 Streptococcus pyogenese Streptococcus mutans에서 0.025 ㎕/㎖의 MIC값을 보여 가장 높게 나타났으며, Listeria monocytogenes, Shigella flexineri, Leuconostoc mesenteroides, Bacillus cereus, 및 Streptococcus mutans에서도 강한 항균력을 보였다. 그램양성균과 음성균을 각각 7종씩 조사한 결과 서양측백나무의 정유는 그램음성균이 그램 양성균에 비해 항균 활성이 높았다.
- 특히 효모의 경우 사용된 두 균주간 항균 활성은 매우 차이가 크게 나타났다. 이상의 결과를 바탕으로 서양측백나무 정유는 그램 양성 박테리아, 곰팡이, 효모 등에 대하여 비교적 넓은 항균 spectrum을 가지는 것으로 나타났다.
- 분무 직후에 정유 용액의 분무 입자에 직 접 닿은 집모기는 아크릴 상자 바닥으로 떨어졌으며 , 정유 용액 농도 증가에 따라 살충효과가 높아졌다. 정유 1.25% 처리 시에는 분무 90분 후 85%, 5.0% 처리 시에는 분무 90분 후에 100% 살충효과를 보였으나, 가장 높은 농도인 20% 처리구에서는 30분만에 100% 살충효과를 보였다.
- 그 후 반응액은 UV spectrophotometer (Milton Roy, model 301) 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 정유의 DPPH radical 소거능은 에탄올만 사용한 대조군의 흡광도를 50% 감소시키는데 필요한 농도를 나타내었고, 이들 실험은 3반복하여 평균값으로 나타내었다.
- 서양측백나무 정유 주성분은 monoterpene류였으며, d-isothujone, 1-fenchone, a-thujone, camphor, terpin-4-01 순으로 나타났다. 정유의 박테리아에 대한 항균력은 박테리아 중 Streptococcus pyogenes에서, 그리고 효모 및 곰팡이 중 Candida albicans에서 가장 높게 나타났다. 특히 서양측백나무 정유는 그램 양성균의 박테리아에 대해 가장 강한 항균력을 보였다.
- 정유는 DPPH radical 소거능을 보유하고 있었으며, ECso 값은 36이었다. 집모기에 대한 살충 효과는 분무, 훈증, 자연증발 등 처리방법에 따라 다르게 나타났으며, 그 중 분무처리가 가장 효과적인 것으로 나타났다. 이상의 결과는 환경 친화적인 항균 및 살충소재로 이용될 수 있을 것이다.
- 정유의 박테리아에 대한 항균력은 박테리아 중 Streptococcus pyogenes에서, 그리고 효모 및 곰팡이 중 Candida albicans에서 가장 높게 나타났다. 특히 서양측백나무 정유는 그램 양성균의 박테리아에 대해 가장 강한 항균력을 보였다. 정유는 DPPH radical 소거능을 보유하고 있었으며, ECso 값은 36이었다.
- 4B). 한편, 자연증발에 의한 살충효과는 분무와 훈증보다 많은 시간이 소요되었으며, 4시간 이후부터 75% 살충 효과가 나타났고, 8시간 경과 후 100% 살충효과를 보였다 (데이터 미제시).
- 이때 10시간 경과.후 서양측백나무 정유의 증발량은 약 0.25 g이 었으며, 증류수는 거의 증발되지 않았다.
- 훈증에 의한 살충효과는 정유 1.25%와 5.0% 처리 구에서 각각 120분만에 100%의 살충효과를 보였으며, 20% 고농도 처 리구에서는 90분만에 100%의 살충력을 보였다 (Fig. 4B). 한편, 자연증발에 의한 살충효과는 분무와 훈증보다 많은 시간이 소요되었으며, 4시간 이후부터 75% 살충 효과가 나타났고, 8시간 경과 후 100% 살충효과를 보였다 (데이터 미제시).
후속연구
- 집모기에 대한 살충 효과는 분무, 훈증, 자연증발 등 처리방법에 따라 다르게 나타났으며, 그 중 분무처리가 가장 효과적인 것으로 나타났다. 이상의 결과는 환경 친화적인 항균 및 살충소재로 이용될 수 있을 것이다.
- 또한 강한 살충력은 환경 친화적인 살충제로 이용가능성을 시사한다. 향후의 연구는 효율적 정유 추출법의 구명, 정유의 주성분인 mono- 및 sesquiterpenoid의 생합성 경로인 mevalonate pathway에서 terpenoids 생합성에 관여하는 여 러 유전자들을 도입함에 따른 물질 생합성 기작을 연구할 예정이며, 구조활성에 대한 연구도 수행할 예정이다.
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