밤나무 꽃과 잎의 화학성분 및 항균활성 검색 -제2보. 항균활성 검색- Screening of Antimicrobial Activity from Castanea crenata Sieb. et Zucc. Leaves and Flowers. -II. Screening of Antimicrobial Activities-원문보기
밤나무의 밤꽃과 밤잎의 항균활성 효과를 조사하기 위하여, 시료를 80% methanol로 추출하여 용매분획을 하였다. 용매분획별 수율은 밤꽃에서 ethylacetate 1.94%, methanol 4.75% 및 water 7.81%였고, 밤잎은 ethylacetate 2.24%, methanol 5.03% 및 water 8.47%였다. 밤꽃과 밤잎의 methanol 분획 추출물은 Gram양성 및 음성의 모든 균주에서 강한 항균활성을 보였으며, ethylacetate 및 water 분획 추출물은 약한 항균활성을 보였다. 최소저해농도는 $60\;{\mu}g/disc$ 이상에서 항균력이 인정되었다. Bacillus. subtilis에 대한 생육저해 효과는 control에 비하여 밤꽂과 밤잎 추출물은 모두 낮은 생육저해 효과를 보였으며, 또한 각 추출물은 모두 배양 15시간까지는 현저히 낮은 생육저해를 보이다가 그 후는 약간 높아졌다. 밤꽃 추출물에서는 methanol 추출물이 가장 높은 생육저해효과를 보인 반면에, water 추출물은 다른 추출물에 비하여 낮은 생육저해를 보였으며, 밤잎 추출물은 각 추출물에서 거의 비슷한 생육저해를 보였다. 밤꽃과 밤잎의 methanol 분획 추출물을 B. subtilis에 각각 500 ppm씩 처리한 후, 주사전자현미경(SEM)으로 관찰한 결과, 추출물을 처리하지 아니한 경우는 전형적인 Bacilli의 형태를 보였지만, methanol 분획추출물을 처리한 경우는 세포의 형태가 일그러지고 손상을 입은 형태를 보였다.
밤나무의 밤꽃과 밤잎의 항균활성 효과를 조사하기 위하여, 시료를 80% methanol로 추출하여 용매분획을 하였다. 용매분획별 수율은 밤꽃에서 ethylacetate 1.94%, methanol 4.75% 및 water 7.81%였고, 밤잎은 ethylacetate 2.24%, methanol 5.03% 및 water 8.47%였다. 밤꽃과 밤잎의 methanol 분획 추출물은 Gram양성 및 음성의 모든 균주에서 강한 항균활성을 보였으며, ethylacetate 및 water 분획 추출물은 약한 항균활성을 보였다. 최소저해농도는 $60\;{\mu}g/disc$ 이상에서 항균력이 인정되었다. Bacillus. subtilis에 대한 생육저해 효과는 control에 비하여 밤꽂과 밤잎 추출물은 모두 낮은 생육저해 효과를 보였으며, 또한 각 추출물은 모두 배양 15시간까지는 현저히 낮은 생육저해를 보이다가 그 후는 약간 높아졌다. 밤꽃 추출물에서는 methanol 추출물이 가장 높은 생육저해효과를 보인 반면에, water 추출물은 다른 추출물에 비하여 낮은 생육저해를 보였으며, 밤잎 추출물은 각 추출물에서 거의 비슷한 생육저해를 보였다. 밤꽃과 밤잎의 methanol 분획 추출물을 B. subtilis에 각각 500 ppm씩 처리한 후, 주사전자현미경(SEM)으로 관찰한 결과, 추출물을 처리하지 아니한 경우는 전형적인 Bacilli의 형태를 보였지만, methanol 분획추출물을 처리한 경우는 세포의 형태가 일그러지고 손상을 입은 형태를 보였다.
Chestnut (Casranea crenata S. et Z.) leaves and flowers were extracted with 80% methanol and then fractionated with ethylacetate, methanol and water. Their antimicrobial activities in each fraction were investigated. Methanol fraction of the chestnut leaves and flower showed strong antimicrbial acti...
Chestnut (Casranea crenata S. et Z.) leaves and flowers were extracted with 80% methanol and then fractionated with ethylacetate, methanol and water. Their antimicrobial activities in each fraction were investigated. Methanol fraction of the chestnut leaves and flower showed strong antimicrbial activities against both of Gram positive and Gram negative bacteria. The ethylacetate and water fraction, however, showed only weak antimicrobial activities when the antimicrobial activities were occurred. Minimal inhibitory concentration (MIC) of the methanol extracts of the chestnut leaves and flowers against 5 strains of Gram positive and Gram negative bacteria were at $60\;{\mu}g/disc$. The extracts of the chestnut leaves and flowers inhibited the growth of Bacillus subtilis at 0.5% (w/w) concentration. In order to investigate the effect of extraction methods on the B. subtilis, scanning electron microscope was used. The B. subtilis was damaged when the methanol extracts of the chestnut leves and flowers were at 500 ppm.
Chestnut (Casranea crenata S. et Z.) leaves and flowers were extracted with 80% methanol and then fractionated with ethylacetate, methanol and water. Their antimicrobial activities in each fraction were investigated. Methanol fraction of the chestnut leaves and flower showed strong antimicrbial activities against both of Gram positive and Gram negative bacteria. The ethylacetate and water fraction, however, showed only weak antimicrobial activities when the antimicrobial activities were occurred. Minimal inhibitory concentration (MIC) of the methanol extracts of the chestnut leaves and flowers against 5 strains of Gram positive and Gram negative bacteria were at $60\;{\mu}g/disc$. The extracts of the chestnut leaves and flowers inhibited the growth of Bacillus subtilis at 0.5% (w/w) concentration. In order to investigate the effect of extraction methods on the B. subtilis, scanning electron microscope was used. The B. subtilis was damaged when the methanol extracts of the chestnut leves and flowers were at 500 ppm.
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문제 정의
충분히 있다. 따라서 본 연구는 밤꽃과 밤잎을 원료로 하는 기능성 식품의 개발이나 천연 보존료 개발을 위한 기초자료로 활용하고자, 이들의 항균활성을 검토하였다.
밤나무 (Castanea crenata Sieb. et. Zucc)의 밤꽃과 밤잎을 활용하여 기능성 식품이의 개발이나 천연보존료 개발을 위한 자료로 활용하고자, 전보에서는 이들의 화학성분을 분석하였으며, 계속하여 항균활성을 검토하였다. 밤나무는 참나무과에 속하며, 그 열매는 전분과 탄수화물을 다량 함유한 과일로서, 영양가도 풍부하여 기호식품 또는 대용 식량자원으로서 널리 재배되는 유실수이다.
제안 방법
21) 즉 멸균된 여과지에 시료 100 ㎍ 흡수시킨 후 추출용매를 휘발시키고, 미리 45℃로 식힌 배지에 균을 접종하여 둔 평판배지에 밀착시킨 다음, 멸균수를 75㎕씩을 가하여 추출물을 확산시키고, 4℃에서 1시간 동안 방치·안정화시킨 후, 균주별 각각의 생육 온도에서 24~48시간 배양하여 paper disc주위에 생성된 저해 환 (inhibition zone)의 직경 (mm)을 측정하여 비교하였다.
최 소저 해 농도(minimal inhibitory concentration, MIC)는 항균력 시험을 통하여 비교적 항균 활성이 높았던 5종의 균주 Bacillus subtilis, Micrococcus luteus, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Salmonella enteritidis에 대하여 조사하였다. MIC검색은 시료를 methanol로 용해시켜, 최종농도가 10, 20, 50, 80, 100 및 150)㎍/disc가 되도록 8 mm paper disc에 흡수시킨 후, 항균활성 시험방법과 동일하게 측정하였다끄,
용매분획별 추출 및 수율 측정. Methanol extract 시료의 용매별 추출은, 각 시료 20 g을 silica gel column에 넣고서 Fig. 1과 같은 방법으로 ethylacetate, 메탄올 및 물로 용매별로 추출, 농축하고 수율을 측정하였다. 용매별 및 각 분획별 가용성 고형분의 함량은 추출시료를 정용한 후 정용액 1 mZ를 취하여 105℃에서 건조 후 증발 잔량을 확인, 시료에 대한 가용성 고형분 함량을 백분율로 나타내었다.
추출물이 미생물의 생육에 미치는 저해영향은, 공시 균주들을 액체배지 50ml에 한 백금이 접종한 후, 각 균주의 배양조건에서 24시간 배양하여 활성 화 시켜 사용하였다. 각 미생물의 액체배지에 추출물을 0.5% 농도로 첨가하여, 각 균주의 배양조건에서 배양하면서 , 6, 12, 18, 24, 30, 36, 42 및 48시간에서 경시적으로 배양액 2mZ를 채취하여, spectrophotometer를 이용하여 600nm에서 흡광도를 측정하여 미생물의 증식곡선으로 하였다.23)
항균활성 검색. 각각의 공시균주들에 대해 agar를 넣지 않은 broth상태의 I생육배지를 제조하여 멸균한 후, slant 상태로 배양한 균주 1 백금이를 취하여 10 m/ broth의 균 생육 배지에 접종하고, shaking incubator에서 균주들의 생육최적온도를 맞추어 18~24시간 배양하여 사용하였다.
미생물의 형태관찰. 미생물에 대한 추출물의 저해효과를 보기 위하여 추출물이 처리된 미생물과 처리되지 않은 미생물의 형태를 SEM전자현미경으로 관찰하였다. 즉, 각 미생물을 배양하여 대수증식기의 단계에서 추출물을 500ppm 첨가 한 후 3 시간 방치하였다.
용매분획별 추출 및 수율 측정. Methanol extract 시료의 용매별 추출은, 각 시료 20 g을 silica gel column에 넣고서 Fig.
45 ㎛ membrane filter에 균체를 고정하였다. 이를 5% glutaldehyde 용액에 하룻밤 담구고멸균수로 세척한 뒤 30-100% 에탄올에 차례로 담구고 탈수하고 다시 isoamyl acetate에 약 30분간 담구어 건조시킨 다음 전자현미경으로 관찰하였다.19
미생물에 대한 추출물의 저해효과를 보기 위하여 추출물이 처리된 미생물과 처리되지 않은 미생물의 형태를 SEM전자현미경으로 관찰하였다. 즉, 각 미생물을 배양하여 대수증식기의 단계에서 추출물을 500ppm 첨가 한 후 3 시간 방치하였다. 그 후 원심분리하여 균체를 분리하고, 0.
소저해농도측정. 최 소저 해 농도(minimal inhibitory concentration, MIC)는 항균력 시험을 통하여 비교적 항균 활성이 높았던 5종의 균주 Bacillus subtilis, Micrococcus luteus, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Salmonella enteritidis에 대하여 조사하였다. MIC검색은 시료를 methanol로 용해시켜, 최종농도가 10, 20, 50, 80, 100 및 150)㎍/disc가 되도록 8 mm paper disc에 흡수시킨 후, 항균활성 시험방법과 동일하게 측정하였다끄,
대상 데이터
공시균주. 밤꽃과 밤잎 추출물의 항균활성 검색을 위하여 Table 1과 같이 식품부패 및 식품위생 관련 세균을 이용하였다. 항균활성 검색.
실험재료. 밤꽃과 밤잎은 2002년 6월 경기도 안성시 한경대학교 부속농장에서 채취하여, 깨끗이 세척하고서 60℃로 열풍 건조한 다음, 분쇄하여 냉동보관 하면서 실험에 사용하였다. 시료의 추출은 80% methanol로 실온에서 마쇄, 추출하여, 여액을 모아서 rotary vacuum evaporator로 농죽하여 methanol extract를 만들어 냉장보관 하면서 실험에 사용하였다.
이론/모형
주출물의 항균활성시험은 paper disc(8mm)를 이용한 한천배지 확산법 (agar diffusion method)을 이용하였다.21) 즉 멸균된 여과지에 시료 100 ㎍ 흡수시킨 후 추출용매를 휘발시키고, 미리 45℃로 식힌 배지에 균을 접종하여 둔 평판배지에 밀착시킨 다음, 멸균수를 75㎕씩을 가하여 추출물을 확산시키고, 4℃에서 1시간 동안 방치·안정화시킨 후, 균주별 각각의 생육 온도에서 24~48시간 배양하여 paper disc주위에 생성된 저해 환 (inhibition zone)의 직경 (mm)을 측정하여 비교하였다.
성능/효과
3, 4 와 같다. Bacillus subtilis^ 대한 생육저해 효과는 밤꽃과 밤잎 추출물을 0.5%씩 배지에 첨가하여, 배양한 결과 control] 비하여 모두 낮은 증식도를 보였다. 각 추출물 모두 배양초기에는 배양 18시간까지는 현저히 낮은 생육저해를 보이다가 그 후는 약간 증식도가 높아졌다.
5%씩 배지에 첨가하여, 배양한 결과 control] 비하여 모두 낮은 증식도를 보였다. 각 추출물 모두 배양초기에는 배양 18시간까지는 현저히 낮은 생육저해를 보이다가 그 후는 약간 증식도가 높아졌다. 밤꽃 추출물에서는 methanol 추출물이 가장 낮은 생육저해효과를 보인 반면에, water 추출물은 다른 추출물에 비하여 높은 증식도를 보였으며 , 밤잎 추출물은 각 추출물에서 거의 비슷한 증식도를 보였다.
86%의 많은 순서로 나타났다. 그리고 밤꽃과 밤잎을 비교해보면 밤꽃보다 밤잎에서 추출수율 및 가용성 고형분의 수율이 각각 높게 나타났다. 밤꽃의 용매분획별 수율과 가용성 고형분을 이8)의 개화후 밤꽃 추출물의 수율과 가용성 고형분 수율의 결과와 비교하면 유사한 결과를 보였다.
또한 각 분획 추출물의 가용성 고형분 함량을 조사한 결과 밤꽃은 water 47.24%, methanol 38.58%, ethylacetate 4.70%였으며, 밤잎도 water 48.62%, methanol 40.18%, ethylacetate 2.86%의 많은 순서로 나타났다. 그리고 밤꽃과 밤잎을 비교해보면 밤꽃보다 밤잎에서 추출수율 및 가용성 고형분의 수율이 각각 높게 나타났다.
각 추출물 모두 배양초기에는 배양 18시간까지는 현저히 낮은 생육저해를 보이다가 그 후는 약간 증식도가 높아졌다. 밤꽃 추출물에서는 methanol 추출물이 가장 낮은 생육저해효과를 보인 반면에, water 추출물은 다른 추출물에 비하여 높은 증식도를 보였으며 , 밤잎 추출물은 각 추출물에서 거의 비슷한 증식도를 보였다. 백 등끄)은 대나무 잎 추출물이 0.
2 및 Table 3과 같다. 밤꽃과 밤잎 각각의 용매별 추출물을 lOOgg/disc 농도로 항균활성을 조사한 결과, methanol 추출물은 Gram positive bacteria 및 Gram negative bacteria 에서 거의 모든 균주에서 항균활성을 보이는데 비하여, water 추출물은 Gram negative bacteria 모두에서 항균활성을 보이지만, Gram positive bacteria에서는 Bacillus subtilis 및 Micrococcus ftrfg에서만 항균활성을 보였다. 한편 ethylacetate 추출물은 Staphylococcus aureus를 제외한 대부분의 균주에서 항균 활성을 보였으나 항균활성력이 미미하게 나타났다.
밤꽃과 밤잎의 methanol extract의 용매 분 획별 추출수율과 가용성 고형분 함량을 측정한 결과는 Table 2와 같다. 시료를 80% methanol로 추출한 결과 밤꽃은 16.32%, 밤잎은 17.21%의 수율을 보였다.
이 추출물들을 각각 용매분획을 한 결과의 수율은 밤꽃에서 ethylacetate 1.94%, methanol 4.75% 및 water 7.81%였고, 밤잎은 ethylacetate 2.24%, methanol 5.03% 및 water 8.47%였다.
밤꽃과 밤잎 각각의 용매별 추출물을 lOOgg/disc 농도로 항균활성을 조사한 결과, methanol 추출물은 Gram positive bacteria 및 Gram negative bacteria 에서 거의 모든 균주에서 항균활성을 보이는데 비하여, water 추출물은 Gram negative bacteria 모두에서 항균활성을 보이지만, Gram positive bacteria에서는 Bacillus subtilis 및 Micrococcus ftrfg에서만 항균활성을 보였다. 한편 ethylacetate 추출물은 Staphylococcus aureus를 제외한 대부분의 균주에서 항균 활성을 보였으나 항균활성력이 미미하게 나타났다. 이처럼 밤꽃 및 밤잎의 용매별 추출물의 항균활성은 methanol 추출물이 가장 강하게 나타났다.
흥미로운 사실은 Gram negative bacteria에서는 추출물 대부분의 균주에서 항균활성이 있었으나, Gram positive bacteria에서는 Bacillus luteun에서만 모든 추출물이 항균활성을 보이는 흥미로운 결과를 보였다. 이러한 결과는 오 등2, 의 식품 유해 세균에 대한 차류 주줄물의 항균활성 효과는, Gram 음성 세균보다는 Gram 양성세균에 훨씬 강하게 작용하였다는 보고와는 유사한 균도 있는 반면에, 대부분의 균에서 상반된 결과를 보이고 있다.
후속연구
한편 백 등끼은 국내산 대나무 줄기와 잎의 에탄올 추출물의 항균활성 검색에서 Gram 음성균보다 Gram 양성균에서 매우 강한 항균활성이 있다고 보고하였다. 이러한 차이는 시료와 균주가 다르고 균의 배양조건이 상이하기 때문으로 생각되며, 앞으로 보다 폭넓은 연구가 필요할 것으로 생각한다. 한편 본 실험의 결과는 이8)의 개화후 밤꽃의 항균 활성을 조사한 결과와는 유사한 결과를 보였다.
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