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문제 정의
- fraxinea(ASI17017)에서 가장 높은 활성이 나타났다. 다른 균에 비해 월등히 높은 laccase 활성이 나타난 F. fraxinea (ASI17017)를 이용하여 laccase의 생산에 관한 연구를 실시하였다. 우선 균사체 생장을 기준으로 탄소원, 질소원을 선택한 후, 무기염류(Kim 등, 1992)를 선별적으로 첨가하면서 효소 활성이 높은 배지 조성을 확립하였다.
- 소의 비용이 높다는 장벽이 문제가 되어 왔다. 본 논문은 바이오매스의 에너지원으로서의 활용이 아니라 리그닌 분해산물로부터 새로운 기능성 물질의 탐색에 초점을 맞춘 연구로 일차적으로 수행된 효소의 생산에 관한 실험결과를 보고한다. 균주선발 과정에서 세 가지 리그닌 분해효소(lignin peroxidase, laccase, manganese peroxidase)를 검정하였으며, 선발된 F.
제안 방법
- 2차 선발은 1차 선발에서 배지의 탈색 정도가 높은 균주를 선택하여 액체배양(stationary culture)을 하면서 2일 간격으로 시료를 채취하여 리그닌분해효소를 측정하고 효소활성이 높은 균주를 선발하였다.
- 단백질 정량은 Bradford법(1976)에 의하여, UV-visible spectrophotometer(Shimadzu UV-1201)를 사용하여 595 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 표준물질로는 Bovine serum albumin(Sigma Co)을 사용하였다. Glucose 함량은 당 분석기 (YSI, 2700-D Biochem.)를 사용하여 측정 하였다.
- Jar fermentor, balloon type bioreactor 그리고 air-sparging fermentoT의 세 가지 배양기로 효소의 대량생산을 조사하였다(Table 6). Jar fermentor에서는 배양 8일째(3, 540U/l)에 최고의 활성을 나타내었다.
- 본 논문은 바이오매스의 에너지원으로서의 활용이 아니라 리그닌 분해산물로부터 새로운 기능성 물질의 탐색에 초점을 맞춘 연구로 일차적으로 수행된 효소의 생산에 관한 실험결과를 보고한다. 균주선발 과정에서 세 가지 리그닌 분해효소(lignin peroxidase, laccase, manganese peroxidase)를 검정하였으며, 선발된 F. fraxinea를 이용하여 laccase 대량생산 실험을 수행하였다.
- 담자균 류 80여종에서 laccase 고생산 균주(Fomitella fraxinea; 장수버섯)를 선발하고, F. fraxinea를 이용한 리그닌 분해효소의 생산 및 효소의 대량생산 조건을 검토하였다. 먼저 배지 조성에 따른 생산성을 조사한 결과 Cu 등의 무기물의 첨가 유무에 따라 생산되는 효소가 달랐다.
- 담자균을 사용하여 배지의 탈색 정도를 조사한 1차 선발(Table 4)에서 리그닌 분해효소 생산이 높다고 생각되는 10여종의 균주를 선발하여 2차 실험을 실시하였다. Manganese peroxidase는 P.
- 리그닌 분해효소의 대량생산을 위해 10 / jar fermentor (MDL BEM, Marubish Co.), 10 l 풍선형 배양기 (Balloon type air bubble bioreactor; Lee 등, 2002) 그리고 13 Z 폭기의존형 배양기 (Air-sparging fermentor)를 이용하여 효소의 대량 생산 실험을 하였다.
- 먼저 80종의 담자균을 대상으로 리그닌 분해효소 생산 유무를 검정하였다. 즉, Kirk 등(1981)이 P.
- 선별된 균주의 효소생산성을 검정하기 위하여 300 mZ 플라스크에 배지를 100 m씩 분주하여 121℃, 15분간 고압멸균 후배지조성 (Table 3)과 배양방법(정치배양, 진 탕배양; 120rpm)을 달리하여 실험하였다. 배양중 2일간격으로 배양액을 채취하여 효소활성 측정, 세포외 단백질 정량, 총당함량 그리고 최종 건조균체량을 측정하였다. 단백질 정량은 Bradford법(1976)에 의하여, UV-visible spectrophotometer(Shimadzu UV-1201)를 사용하여 595 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 표준물질로는 Bovine serum albumin(Sigma Co)을 사용하였다.
- 먼저, 300 ml flask에 일정량의 배지를 넣어 고압멸균후 장수버섯 균사체colony를 5개씩 접종하여 정치배양한 후 이것을 접종원으로 사용하였다. 선별된 균주의 효소생산성을 검정하기 위하여 300 mZ 플라스크에 배지를 100 m씩 분주하여 121℃, 15분간 고압멸균 후배지조성 (Table 3)과 배양방법(정치배양, 진 탕배양; 120rpm)을 달리하여 실험하였다. 배양중 2일간격으로 배양액을 채취하여 효소활성 측정, 세포외 단백질 정량, 총당함량 그리고 최종 건조균체량을 측정하였다.
- fraxinea (ASI17017)를 이용하여 laccase의 생산에 관한 연구를 실시하였다. 우선 균사체 생장을 기준으로 탄소원, 질소원을 선택한 후, 무기염류(Kim 등, 1992)를 선별적으로 첨가하면서 효소 활성이 높은 배지 조성을 확립하였다.
- 배양 방법에서 영양이 충분한 조건에서는 정치배양보다는 진탕배양(120 rpm)에서 효소의 활성이 높았다. 이 균주를 이용한 laccase 대량생산실험에는 jar fermentor, balloon type bioreactor, air-sparging fermentor를 이용하였다. laccase는 jar fermentor와 air-sparging fermentor에서 3, 540 U/ml(8일), 3, 100U/ml(6일)의 생산성을 나타내었다.
대상 데이터
- 리그닌 분해효소 고 생산 균주의 선발을 위하여 80종의 담자균(Table 1)을 대상으로 실험을 실시하였다.이들 균주를 25℃, potato dextrose agar(PDA)에서 계대배양하면서 실험에 사용하였다.
- 1)을 대상으로 실험을 실시하였다.이들 균주를 25℃, potato dextrose agar(PDA)에서 계대배양하면서 실험에 사용하였다.
데이터처리
- Manganese peroxidase활성은 Kofujita 등(1991)의 방법으로 확인하였는데 활성농도는 1분간 반응으로 생성된 물질의 농도를 465 nm에서의 흡광도로 나타내었다. 모든 효소의 활성측정은 배양 중인 플라스크 3개를 선발하여 활성의 평균값으로 나타내었다.
이론/모형
- 배양중 2일간격으로 배양액을 채취하여 효소활성 측정, 세포외 단백질 정량, 총당함량 그리고 최종 건조균체량을 측정하였다. 단백질 정량은 Bradford법(1976)에 의하여, UV-visible spectrophotometer(Shimadzu UV-1201)를 사용하여 595 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 표준물질로는 Bovine serum albumin(Sigma Co)을 사용하였다. Glucose 함량은 당 분석기 (YSI, 2700-D Biochem.
성능/효과
- 생산량은 큰 차이를 나타내었다. 먼저 glucose, malt extract, yeast ex tract만 사용된 배지 (Medium Ⅰ)에서는 manganese peroxidase가 생성되었고(Fig. 1), Cu 등 다수의 무기염류가 포함된 배지 (Medium ID에서는 laccase만 생산되었으나(Fig. 2) 두 종류의 배지 모두에서 균사의 생장은 좋았다.즉, 무기질의 첨가 유무에 따라 생산되는 효소가 달랐다.
- fraxinea를 이용한 리그닌 분해효소의 생산 및 효소의 대량생산 조건을 검토하였다. 먼저 배지 조성에 따른 생산성을 조사한 결과 Cu 등의 무기물의 첨가 유무에 따라 생산되는 효소가 달랐다. 무기물이 첨가되지 않은 배지(Medium I)에서는 manganese peroxidase가 생산되었고, 무기물이 첨가된 배지(Medium Ⅱ)에서는 laccase가 생산되었는데 플라스크 배양 18일째에는 5.
- 배양 방법에 따른 리그닌 분해효소의 활성을 측정한 결과 배양 6일째부터 조금씩 생산되기 시작하여 배지의 영양소모가 가장 많은 12~16일에 효소의 생산량이 급격히 증가하여 18일에는 5.43 U/ml, 20일째에 5.56U/ml으로 최대활성을 나타내었다 (Fig. 2). 이것은 질소 충분 배지에서 균체의 성장이 증가하면 laccase의 생산량도 증가한다(Garzillo and Colao, 1998; Ryu, 2001)는 보고와 일치하였다.
- 56 U/ml의 효소 활성이 나타났다. 배양 방법에서 영양이 충분한 조건에서는 정치배양보다는 진탕배양(120 rpm)에서 효소의 활성이 높았다. 이 균주를 이용한 laccase 대량생산실험에는 jar fermentor, balloon type bioreactor, air-sparging fermentor를 이용하였다.
- 배지 조성과 배양 방법에 따라 리그닌 분해효소의 생산성과 생산량은 큰 차이를 나타내었다. 먼저 glucose, malt extract, yeast ex tract만 사용된 배지 (Medium Ⅰ)에서는 manganese peroxidase가 생성되었고(Fig.
- Balloon type bioreactor는 균사생장이 느린 Tricholoma matsutake의 균사 배양에 탁월한 효과를 보였고(Lee 등, 2002), 전단력이 가장 낮은 생물반응기이므로 laccase 생산에 활용하였으나 효소 활성이 나타나지 않았다. 오히려 전단력이 상당히 높은 air-sparging fermentor에서 활성이 높게 나타나서 manganese peroxidase와는 생산조건이 많이 다른 것으로 확인되었다. 이 결과는 균사체의 생산량이 증가하면 laccase의 생산량도 증가한다는 보고(Ryu, 2001)와는 일치하지 않았다.
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