장수버섯(Fomitella fraxinea)의 균사체 배양액으로부터 laccase를 생산하기 위한 최적 배양조건을 조사하였다. 복합 배지 중에서 MCM이 laccase의 생산에 가장 우수하였으며, laccase를 생산하기 위한 최적 배지조건은 탄소원, 질소원, 인산원 및 무기질원으로 각각 2% dextrose, 0.4% $(NH_4)_{2}HPO_4$, 0.05% $Na_{2}HPO_{4}{\cdot}7H_{2}O$ 및 0.05% KCl의 첨가에 의하여 효소의 생산이 가장 높았다. 따라서 E. fraxinea로 부터 laccase를 생산하기 위한 최적 배지조건은 2% dextrose, 0.4% $(NH_4)_{2}HPO_4$, 0.05% $Na_{2}HPO_{4}{\cdot}7H_{2}O$ 및 0.05% KCl 이다. 이상의 배지를 사용하여 배양온도 $25^{\circ}C$, 초기 pH 8.0에서 10일 동안 배양하였을 때 효소의 생산이 가장 증가함을 알 수 있었다. Staib agar plate 상에서 장수 버섯(Fomitella fraxinea) 균사체의 laccase활성여부를 확인할 수 있었으며 배양액 중의 효소 활성의 최적 pH와 온도는 pH 5.0과 $50^{\circ}C$ 이었다.
장수버섯(Fomitella fraxinea)의 균사체 배양액으로부터 laccase를 생산하기 위한 최적 배양조건을 조사하였다. 복합 배지 중에서 MCM이 laccase의 생산에 가장 우수하였으며, laccase를 생산하기 위한 최적 배지조건은 탄소원, 질소원, 인산원 및 무기질원으로 각각 2% dextrose, 0.4% $(NH_4)_{2}HPO_4$, 0.05% $Na_{2}HPO_{4}{\cdot}7H_{2}O$ 및 0.05% KCl의 첨가에 의하여 효소의 생산이 가장 높았다. 따라서 E. fraxinea로 부터 laccase를 생산하기 위한 최적 배지조건은 2% dextrose, 0.4% $(NH_4)_{2}HPO_4$, 0.05% $Na_{2}HPO_{4}{\cdot}7H_{2}O$ 및 0.05% KCl 이다. 이상의 배지를 사용하여 배양온도 $25^{\circ}C$, 초기 pH 8.0에서 10일 동안 배양하였을 때 효소의 생산이 가장 증가함을 알 수 있었다. Staib agar plate 상에서 장수 버섯(Fomitella fraxinea) 균사체의 laccase활성여부를 확인할 수 있었으며 배양액 중의 효소 활성의 최적 pH와 온도는 pH 5.0과 $50^{\circ}C$ 이었다.
The culture conditions were investigated to maximize the production of laccase from Fomitella fraxinea mycelia. Among the tested media, mushroom complete medium (MCM) showed the highest production of the enzyme. The optimum culture medium was 2% dextrose, 0.4% $(NH_4)_{2}HPO_4$, 0.05%
The culture conditions were investigated to maximize the production of laccase from Fomitella fraxinea mycelia. Among the tested media, mushroom complete medium (MCM) showed the highest production of the enzyme. The optimum culture medium was 2% dextrose, 0.4% $(NH_4)_{2}HPO_4$, 0.05% $Na_{2}HPO_{4}{\cdot}7H_{2}O$, and 0.05% KCl as carbon, nitrogen, phosphorus, and inorganic salt sources respectively. SDS-PAGE followed by laccase activity staining using 2,6-djmethoxyphenol as the substrate was performed to identify the laccase activity under culture conditions studied. Zymogram analysis of the culture supernatant showed a laccase band with a molecular mass of 50 kDa. The enzyme production from F. fraxinea was reached to the highest level after the cultivation for 10 days at $25^{\circ}C$ and initial pH 8. The enzyme activity of the culture supernatant was most active at $50^{\circ}C$ and pH 5.
The culture conditions were investigated to maximize the production of laccase from Fomitella fraxinea mycelia. Among the tested media, mushroom complete medium (MCM) showed the highest production of the enzyme. The optimum culture medium was 2% dextrose, 0.4% $(NH_4)_{2}HPO_4$, 0.05% $Na_{2}HPO_{4}{\cdot}7H_{2}O$, and 0.05% KCl as carbon, nitrogen, phosphorus, and inorganic salt sources respectively. SDS-PAGE followed by laccase activity staining using 2,6-djmethoxyphenol as the substrate was performed to identify the laccase activity under culture conditions studied. Zymogram analysis of the culture supernatant showed a laccase band with a molecular mass of 50 kDa. The enzyme production from F. fraxinea was reached to the highest level after the cultivation for 10 days at $25^{\circ}C$ and initial pH 8. The enzyme activity of the culture supernatant was most active at $50^{\circ}C$ and pH 5.
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문제 정의
본 연구에서는 다양한 생리활성물질을 함유하는 약용버섯의 산업적 활용을 위한 기초연구로 F. fraxinea 균사체로부터 액체배양법을 이용하여 리그닌 분해효소, laccasef를 생산하기 위한 최적 배양조건을 조사하였으며, 배양액으로부터 효소적 특성을 연구하였다.
장수 버섯 (Fomitella fraxinea)의 균사체 배양액으로부터 laccase를 생산하기 위한 최적 배양조건을 조사하였다. 복합배지 중에서 MCM이 laccase의 생산에 가장 우수하였으며, laccaset- 생산하기 위한 최적 배지 조건은 탄 소원, 질소원, 인산원 및 무기질 원으로 각각 2% dextrose, 0.
제안 방법
8 ml 에 5 mM ABTS 100 μ1 와 효소 100 μ1를 가하여 잘 혼합한 후 420 nm에서 초기 3분 동안의 흡광도의 변화를 측정하였다. 최적 온도를 조사하기 위하여 효소 액의 반응온도를 20。。에서 70。(2까지 10也 간격으로 변화시키며 활성도를 측정하였다.
F. fraxinea 배양액을 8000 rpm에서 10분 동안 원심분리한 후 상등액을 조 효소액으로 사용하였으며, Laccase 활성은 100 mM 아세트산나트륨 완충용액 (pH 5.0) 상에서 5 mM ABTSf- 기질로 사용하여 효소와 반응시켰으며, ABTS 의 산화에 의해 생성된 초록색의 산화물을 420 nm (e=36, 000 M-Lcm-i)에서 측정하였다[29].
균사체로부터 생산된 효소의 활성에 미치는 pH의 영향을 조사하기 위하여 0.1 M 아세트산나트륨 완충용액 (pH 3.0~ 6.0), 인산나트륨 완충용액 (pH 6.0~9.0), carbonate bicarbonate 완충용액 (pH 9.0~ 10.0)을 사용하였으며, 각 완충용액 1.8 ml 에 5 mM ABTS 100 μ1 와 효소 100 μ1를 가하여 잘 혼합한 후 420 nm에서 초기 3분 동안의 흡광도의 변화를 측정하였다. 최적 온도를 조사하기 위하여 효소 액의 반응온도를 20。。에서 70。(2까지 10也 간격으로 변화시키며 활성도를 측정하였다.
배양액 중의 효소 활성을 확인하기 위하여 조효소액을 12% SDS-PAGE 전기영동한 후 DMPO 활성염색법을 수행하였다. 전기영동 한 겔을 0.
배양액 중의 효소의 활성을 확인하기 위하여 배양액 시료를 SDS-PAGE 한 후 2, 6-DMP를 기질로 하여 activity stainig한결과 laccase 활성을 나타내는 band가 45~66 kDa 사이에서 확인되었다(Fig. 2). 이는 Solano 등[25]이 E.
모든 배지는 121。(2에서 15분 동안 멸균하여 사용하였다. 탄소원, 질소원, 인산 원 및 무기질 원 등의 영양원에 따른 효소 생산성을 관찰하기 위하여 시험 배지 중 가장 높은 효소 활성을 나타내는 MCM의 조성으로부터 해당 영양원을 제거하고 2% 탄 소원, 0.4% 질소원과 0.05% 인산 원 및 무기질 원들을 각각 첨가하여 실험하였다. 효소 생산을 위한 최적 배양온도를 결정하기 위하여 항온기의 온도를 15℃~40℃ 까지 5℃ 간격으로 조절하여 배양하였다.
해바라기 씨 50 g을 분말화하여 1000 ml의 증류수에 넣고 30분간 끓여 여과시킨 후, glucose 1 g, KH2PO4 1 g, creatinine 1 g 및 agar 15 g을 첨가하여 110。。에서 20분간 멸균시킨 후 Petri dish에 가하여 실온에서 응고시켰다. 형성된 Staib agar plate 상에 F. fraxinea 균주를 접종하여 2VC에서 1~5일간 배양시킨 후 형성되는 갈색 환을 확인하였다[27].
대상 데이터
F. fraxinea 균사체로부터 laccase의 생산성을 비교하기 위한 배지로 Coriolus versicolor medium(CVM), Czapek Dox medium(CDM), Lentinulla edodes medium(LEM), mushroom complete medium(MCM), malt yeast glucose medium(MYGM) 및 potato dextrose medium(PDM)을 사용하였으며, 각 배지의 조성은 Table 1과 같다. F.
본 실험에서 사용한 아카시재목버섯의 균주는 농촌진흥청에서 분양 받은 AS1-17015 균주로서, 보관용 배지로는 potato dextrose agar(PDA) 배지를 사용하여 사면배지 상에서 25℃(2에서 7일 동안 배양한 후 4℃ 냉장고에 보관하였다.
성능/효과
05% KC1 이다. 이상의 배지를 사용하여 배양온도 25。(2, 초기 pH 8.0에서 10일 동안 배양하였을 때 효소의 생산이 가장 증가함을 알 수 있었다. Staib agar plate 상에서 장수 버섯(Fomitella fraxinea) 균사체의 laccase활성 여부를 확인할 수 있었으며 배양액 중의 효소 활성의 최적 pH와 온도는 pH 5.
5에 나타내었다. F. fraxinea 균사체를 25℃, 초기 pH 8.0에서 10일 동안 배양하였을 때 효소의 활성이 가장 증가함을 알 수 있었다. 이 결과는 Monotospora sp를 30℃, pH 8.
0에서 10일 동안 배양하였을 때 효소의 생산이 가장 증가함을 알 수 있었다. Staib agar plate 상에서 장수 버섯(Fomitella fraxinea) 균사체의 laccase활성 여부를 확인할 수 있었으며 배양액 중의 효소 활성의 최적 pH와 온도는 pH 5.0과 50℃이었다.
로부터 laccase 활성을 확인한 결과와 유사하였다. 또한 Staib ex(Guizotia abyssinica creatinine agar plate) 상에서 균사체를 배양할 때 형성되는 갈색 환의 크기가 하루 배양 후 20 mm이었으며 5일 배양 후 55 mm를 나타냄으로써 E fraxinea 중의 laccase의 활성 이 m게 증가하는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 3).
1에 나타내었다. 배지 중 MCM을 사용하여 배양하였을 때 다른 배지들에 비하여 laccase의 활성 이 매우 우수함을 알 수 있었다.
복합배지 중에서 MCM이 laccase의 생산에 가장 우수하였으며, laccaset- 생산하기 위한 최적 배지 조건은 탄 소원, 질소원, 인산원 및 무기질 원으로 각각 2% dextrose, 0.4% (NH4)2HPO4, 0.05% Na2HPO4· 7H2O 및 0.05% KCl의 첨가에 의하여 효소의 생산이 가장 높았다. 따라서 F.
4%의 각 종류별 질소원을 첨가하여 배양한 결과를 Table 3에 나타내었다. 유기질 소원 중 tryptone이 우수한 효소생산능력을 나타내었으며 , 전체 질소원 중 (NH4)2HPO4가 가장 높은 효소 활성을 나타내었다. MCM 원 성분인 peptone과 yeast extrac를 혼합하여 첨가하였을 때도 비교적 우수한 활성을 나타내었다.
효소의 생산을 위한 탄소 원의 효과를 조사하기 위하여 MCM에 2%의 각 종류별 탄소 원을 첨가하여 배양한 결과, MCM 원 성분인 dextrose가 탄소 원으로 첨가되었을 때 효소의 활성이 가장 우수하였다(Table 2). 또한 cellobiose를 첨가하였을 때도 효소의 활성이 우수하였으나, sucrose, cellulose 및 glycerol 등은 효소의 생산 능력을 상대적으로 감소시켰다.
6 및 7과 같다. 효소의 활성은 pH 5.0게서 최대 활성을 나타내었으며, pH 8.0 이후로는 효소의 활성도가 60% 이하로 감소하였으며 pH 4.0-6.0 사이에서 비교적 높은 효소 활성을 나타내었으며, 5VC에서 각각 최고의 활성도를 나타내었다. 이 결과는 Xiao 등[33] 이 보고한 Trametes sp.
후속연구
strain AH28-2로부터 분리 정제한 laccase의 최적 온도는 70℃, Cyathus bulleri 로부터 분리 정제한 laccase의 최적 온도가 30<>C로써 본 효소의 특성과 상이함을 나타내었다. 이상의 결과를 토대로 배양액으로부터 효소를 분리 및 정제하여 생화학적 특성에 관한 연구가 진행되어져야 할 것으로 판단된다.
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