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문제 정의
- 인체 내의 생리적 조건과 흡.사한 조건에서 배당체가 비 배당체로 전환되는 것을 알아보기 위하여 본 실험에서는 대 두와 쥐눈이콩 추출물에 인체와 유사한 조건을 주었다. 즉, 대두와 쥐눈이콩 추출물에 타액, 인공위액 6-읺ucosidase.
- 섭취량을 보다 정확하게 조사하기 위해서는 식품중의 iso-flavone 함량에 대한 기초조사가 이루어져야 하는데 콩의 경우 품종, 생산지, 생산년도에 따라 함량의 차이가 있으므로 콩의 isoflavone 함량을 측정한 연구의 결과가 다르게 나올 수 있다. 이에 본 연구에서는 국내에서 식품으로 소비 량이 증가하고 있는 대두와 쥐눈이콩의 isoflavone 함량을 생산년도 1998년과 1999년도 산에서 분석하고, 배당체 형 태가 체내에서 생리활성을 나타내는 비배당체 형태로 전환 되는 비율을 생리조건과 유사한 환경에서 조사하여 대두와 쥐눈이콩의 효용성을 비교 검증하고자 하였다. 이를 위하여 대두와 쥐눈이콩 추출물을 타액, 인공위액, 효소를 순차적 으로 처리하여 인체 장내 환경의 생리적조건과 유사한 환경 으로 반응시킨 뒤 배당체와 비배당체 함량을 정량하여 시간 경과와 처리 조건에 따른 배당체의 전환정도를 측정하였다.
제안 방법
- 2와 같다. Daidzein과 genistein의 함량을 합한 비배당체 양 을 시료의 건조중량을 기준으로 계산하여 전체 isoflavone 에 대한 %로 표시하였다. 1 N의 염산처리 후 60분 120분, 180분, 210분 시간경과에 따라 대두 추출물의 비배당체 생성율은 16.
- Isoflavone의 분석을 위해 HPLC (Waters BreezerM Software, Waters 1525 Binary HPLC Pump, Waters 2487 Dual Absorbance Detector, Waters Co., USA)를 사용하였으며 사용한 용매는 0.1% acetic acid (A) 와 ac- tonitrile (B)의 45분 동안의 조성과 flow rate는 아래와 같이 프로그래밍하였다. 즉, 초기에는 [85 : 15 (A : B, v/v), 1.
- 국내에서 다량 소비되고 있는 대두와 쥐눈이콩에 함유된 isoflavone의 함량을 비교, 분석하고, 인체조건과 흡사하게 타액, 염산, 인공위액 및 효소 분해를 이용하여 비배당체로 의 전환율을 조사하여 얻은 결과를 요약하면 다음과 같다.
- 대두와 쥐눈이콩 1 kg을 분쇄하여 24시간 동안 70% 메탄올로 3회 추출한 후, 추출액을 rotary vacuum evaporator (Sunil EYELA, Japan) 로 농축하였다. 농축액을 동결 건조하여 분말의 무게를 측정하고 최초의 시료 무게인 1 kg에 대한 수득율을 구하여 백분율 (%)로 표시하였다.
- 대두와 쥐눈이콩의 70% 메탄올 추출물을 각각 1.0 g씩 취하여 0.01N, 0.1N, 1.0N의 염산을 2.0 mL씩 첨가한 후 98 ℃ water bath에서 60분, 120분, 180분, 210분 동안 가열하였다. 시료를 상온으로 냉각한 후, 각 시험관에 ace- tonitrile을 8.
- 2 mL를 첨가한 후 1 unit의 α-glucosidasee- 첨가하여 각각의 시험관을 2시간 또는 24시간 동안 반응시켰다. 또한 시료에 타액과 인공위액 및 β—glucosidase을 넣은 후 2시간 반 응시킨 시험관에 α-glucosidase 1 unit를 첨가하여 각각의 시험관을 2시간 또는 24시간 동안 반응시켜 타액, 인 공위 액, β-glucosidase 및 α-glucosidase 반웅시료로 사용하였다. 각각의 반응시료들을 냉각시켜 acetonitrile을 첨가한 후 교반하여 효소 반응을 정지시켰으며, 실온에서 2시간 이상 정치하여 상등액을 취하였다.
- 본 실험에서는 대두와 쥐눈이콩 추출물의 생리적인 효과 분석을 위하여 추출 초기에 internal standard를 첨가하지 않았다. 따라서 결과의 재현성과 정확도는 반복분석을 하여 각 batch마다 약간의 차이는 있었으나 동일한 경향^을 나 타내었으며 본 논문에서는 대표적인 결과를 제시하였다.
- 시료를 ace- tonitrile을 사용하여 1~50배 희석하여 사용하였다. 상등액 0.22 μm을 Whatman No.l 여과지를 사용하여 여과한 후 high performance liquid chromatography (HPLC) 분석에 사용하였다.
- 각각의 반응시료들을 냉각시켜 acetonitrile을 첨가한 후 교반하여 효소 반응을 정지시켰으며, 실온에서 2시간 이상 정치하여 상등액을 취하였다. 상등액을 여과한 후 isoflavone 함량을 HPLC로 분석하였다.
- 이에 본 연구에서는 국내에서 식품으로 소비 량이 증가하고 있는 대두와 쥐눈이콩의 isoflavone 함량을 생산년도 1998년과 1999년도 산에서 분석하고, 배당체 형 태가 체내에서 생리활성을 나타내는 비배당체 형태로 전환 되는 비율을 생리조건과 유사한 환경에서 조사하여 대두와 쥐눈이콩의 효용성을 비교 검증하고자 하였다. 이를 위하여 대두와 쥐눈이콩 추출물을 타액, 인공위액, 효소를 순차적 으로 처리하여 인체 장내 환경의 생리적조건과 유사한 환경 으로 반응시킨 뒤 배당체와 비배당체 함량을 정량하여 시간 경과와 처리 조건에 따른 배당체의 전환정도를 측정하였다.
- 타액의 경우에는 26~30세의 성인 여성의 타액을 받아 사용하였다. 효소 반응은 37℃에서 진행하였으며, 실제 효소 반 응이 일어나는 시간 (10분 이내)보다 충분한 시간 동안 반응을 연장하여 구강 내에서의 효소적 가수분해 정도를 비교하였다.
대상 데이터
- 대두는 1998년과 1999년도에 재배한 충북 단양산으로 한 삶 식품(주)에서 구입하였으며, 쥐눈이콩은 1998년과 1999년에 강원도 정선에서 재배한 제품으로 동트는 농가(주)에서 구입하여 사용하였다. Daidzein, genistein, glycitein 등의 표준물질 (Fujico 104-33, 104-34, 166-56, 166- 57, 166-95, JAPAN)과 -glucosidase (Sigma G- 6906), a -glucosidase (Sigma G—3651) 는 Sigma (U.S.A) 사의 제품을 사용하였고, HPLC용 용매인 acetoitrilee J. T. Baker (USA) 사의 HPLC용 제품을 사용하였으며 그 외 시약들은 시약용 제품을 사용하였다.
- HPLC에 의한 isoflavone의 정량분석을 위하여 표준물 질을 acetonitrile에 녹여 다양한 희석비율로 만들어진 시료를 이용하여 사용하였다. 본 실험의 분석조건에서 혼합 표준물질은 daidzin (11.
- 대두는 1998년과 1999년도에 재배한 충북 단양산으로 한 삶 식품(주)에서 구입하였으며, 쥐눈이콩은 1998년과 1999년에 강원도 정선에서 재배한 제품으로 동트는 농가(주)에서 구입하여 사용하였다. Daidzein, genistein, glycitein 등의 표준물질 (Fujico 104-33, 104-34, 166-56, 166- 57, 166-95, JAPAN)과 -glucosidase (Sigma G- 6906), a -glucosidase (Sigma G—3651) 는 Sigma (U.
- 수확년도에 따른 대두와 쥐눈이콩의 isoflavone 함량을 비교하기 위하여 약 12개월의 간격으로 동일한 업체에서 시료를 구입하였다. 대두와 쥐눈이콩 1 kg의 메탄올 추출 수득율은 1998년도 산은 각각 13.
- 타액의 경우에는 26~30세의 성인 여성의 타액을 받아 사용하였다. 효소 반응은 37℃에서 진행하였으며, 실제 효소 반 응이 일어나는 시간 (10분 이내)보다 충분한 시간 동안 반응을 연장하여 구강 내에서의 효소적 가수분해 정도를 비교하였다.
데이터처리
- 2) Values with asterisk are significantly different between soybean and black bean by Student, s t-test. * : p < 0.
- 모든 자료의 통계분석은 SAS 통계 프로그램 (SAS institute, 1987)을 이용하여 분석하였으며, 결과는 평균 ± 표준오차로 표시하였다. 대두와 쥐눈이콩의 이소플라본의 함 량 비교는 Student's t-test를 이용하였고 p < 0.05, p < 0.01에서 유의성을 검증하였다.
- 모든 자료의 통계분석은 SAS 통계 프로그램 (SAS institute, 1987)을 이용하여 분석하였으며, 결과는 평균 ± 표준오차로 표시하였다. 대두와 쥐눈이콩의 이소플라본의 함 량 비교는 Student's t-test를 이용하였고 p < 0.
성능/효과
- 1). 표준물질을 희석하여 분석한 결과 peak 면적범위 (10, 000~1,000, 000)에서는 직선관계를 나타내어, 본 분석방법의 분석한계능은 10 μg of extracts (또는 0.05 "g of isoflavone) 이 하로 나타났다.
- Daidzein과 genistein의 함량을 합한 비배당체 양 을 시료의 건조중량을 기준으로 계산하여 전체 isoflavone 에 대한 %로 표시하였다. 1 N의 염산처리 후 60분 120분, 180분, 210분 시간경과에 따라 대두 추출물의 비배당체 생성율은 16.5%, 29.5%, 32.4%, 30.5%로 증가하였고, 쥐 눈이콩 추출물의 비배당체 생성율은 38.5%, 46.2%, 52.4%, 52.1%로 시간이 경과함에 따라 전체 isoflavone에 대한 비배당체의 비율이 증가하였다. 신체의 pH 조건 즉, 위액 의 pH와 같은 0.
- 1) 메탄올 추출물의 isoflavone의 함량은 쥐눈이콩에서 대두보다 높았으며, 주로 배당체의 형태로 존재하고 있었다.
- 2) 염산 농도에 따른 비배당체로의 전환율은 쥐눈이콩 에서 높았고 특히, 1 N 염산 처리에서 가장 높았으며, 0.1 N과 0.01 N 염산, 인공위액 처리에서는 차이가 없었다. 시간에 따른 비배당체로의 전환율은 180분에서 최대값을 이 루고 그 값을 유지하거나 감소하였다.
- 3) 본 실험의 조건에서 배당체에서 비배당체로의 전환율 은 타액이나 인공위액보다 효소 (glucosidase) 처리에서 높은 전환율을 나타냈다.
- 대두의 비배당체 생성율은 타액과 반응시켰을 경우, 30. 8%, 타액과 인공위액으로 반응시켰을 경우 33.0%였고 타 액과 인공위액 및 6-glucosidase와 2시간 반응 시 49.5% 였으며 타액과 인공위액, a—glucosidase으로 반응시켰을 경우 43.1%로 6 -glucosidase와 반응 때보다 비배당체의 생성율이 낮았다. 타액과 인공위액, 6—이ucosidase, a- glucosidase 순으로 2시간 반응시켰을 경우, 비배당체의 생 성율은 88.
- 이와 같은 결과는 식품의 염산처리 가공과정에서 1 N 염 산으로 180분간 가열할 경우 비배당체의 생성율이 가장 높 아질 것으로 사료된다. 그러나, 생리적 pH 조건에서는 시 간경과에 따라 대두는 23.6~28.4%, 쥐눈이콩은 30.2-37.5%로 비배당체 생성율은 증가하였으나, 가공과정과는 달리 비배당체로의 전환이 낮음으로써 대두와 쥐눈이콩을 식품으로 섭취하였을 때 인체 내에서의 분해보다 식품자체 에 함유되어 있는 전체 isoflavone의 양과 비배당체의 함량이 중요한 의미를 지니고 있음을 시사한다.
- 본 실험에서는 대두와 쥐눈이콩 추출물의 생리적인 효과 분석을 위하여 추출 초기에 internal standard를 첨가하지 않았다. 따라서 결과의 재현성과 정확도는 반복분석을 하여 각 batch마다 약간의 차이는 있었으나 동일한 경향^을 나 타내었으며 본 논문에서는 대표적인 결과를 제시하였다. 표 준물질과 시료의 농도를 달리하여 분석한 결과에서는 직선 의 관계식을 얻었고, HPLC 분석에 사용한 시료에 포함된 isoflavone 함량은 0.
- Injection 양은 20 μL로 하였다. 모든 batch마다 실험 전후에 standard 물질을 injection하여 실험의 정확성을 규명하였고 표 준물질과 동일한 retention time을 나타내는 것을 확인하여 분석하는 물질의 identity를 확인하였다. 정량분석에서는 동일한 시료를 재분석시에는 분석오차는 3%이내였다.
- HPLC에 의한 isoflavone의 정량분석을 위하여 표준물 질을 acetonitrile에 녹여 다양한 희석비율로 만들어진 시료를 이용하여 사용하였다. 본 실험의 분석조건에서 혼합 표준물질은 daidzin (11.6분) , genistin (17.9분) , daidzein (28.7분), glycitein (30.1 분), genistein (38.7분)의 순으 로 검출되었다 (Fig. 1). 표준물질을 희석하여 분석한 결과 peak 면적범위 (10, 000~1,000, 000)에서는 직선관계를 나타내어, 본 분석방법의 분석한계능은 10 μg of extracts (또는 0.
- 수확년도에 따른 대두와 쥐눈이콩의 메탄올 추출물을 HPLC로 정량분석한 결과 (Table 2), 대두의 경우 배당체 인 daidzin과 genistin의 함량의 합이 ' 98년산은 70% methanol extract kg당 5, 864 ㎎/㎏, ' 99년산은 5, 586 mg/ kg 이었으며, 비배당체인 daidzein 과 genistein 의 함량의 합 은 ' 98년산은 899 ㎎/㎏, ' 99년산은 731 ㎎/㎏로 생산 년도에 의한 차이는 있었으며, 배당체의 함량이 높게 나타났다. 한편, 쥐눈이콩의 경우에서 배당체의 총량은 ' 98년산 은 8, 895 ㎎/㎏, '99년산은 9, 194 ㎎/㎏이었고, 비배당 체의 총량은 ' 98년산은 2, 065 ㎎/㎏, ' 99년산은 2, 252 ㎎/㎏이었다.
- 1%로 시간이 경과함에 따라 전체 isoflavone에 대한 비배당체의 비율이 증가하였다. 신체의 pH 조건 즉, 위액 의 pH와 같은 0.01 N 염산처리를 한 후 시간경과에 따른 비배당체 생성비율의 변화는 1 N의 염산처리 후의 결과보다 대두나 쥐눈이콩에서 낮게 나타났으며 인공위 액으로 처 리하였을 경우와 유사하게 나타났다. 대두에 0.
- 63 ㎎/㎏으로 쥐눈이콩에서 대두의 함량보다 7배 이상 높은 수치를 보였다. 이 수치는 본 실험의 결과와 비교할 때 daidzein의 함량은 비슷하였으나 genistein의 함량은 쥐눈이 콩에서 다소 낮게 나왔으나, 쥐눈이콩의 비배당체의 함량이 높은 결과는 일치함을 보였다. 콩에 함유되어 있는 생리 활성 물질인 isoflavone의 함량은 재배지역, 종실부위 분포 특성, 추출용매, 추출시의 반응시간 등에 의한 차이가 있을 수 있다.
- 이상의 결과를 종합해 보면 위, 소장 등의 생리적 조건에 서는 대두나 쥐눈이콩의 isoflavone 배당체가 비배당체로 전환이 낮게 일어남으로 식품자체에 들어있는 비배당체의 함량이 중요한 의미를 갖고 있다. 상업적으로 공급되는 이 소플라본 제제와 비교시, 대두와 쥐눈이콩에는 이소플라본 이외에 다른 기능성 요소 (올리고당, 단백질 등)가 함께 포 함되어 있고 특히 쥐눈이콩은 고농도의 이소플라본과 비배 당체 생성율 또한 높으므로 건강기능 식품으로 개발할 가치 가 있을 것으로 사료되며 아울러 기전 연구 또한 요구된다.
- 이와 같은 결과는 식품의 염산처리 가공과정에서 1 N 염 산으로 180분간 가열할 경우 비배당체의 생성율이 가장 높 아질 것으로 사료된다. 그러나, 생리적 pH 조건에서는 시 간경과에 따라 대두는 23.
- 한편, 쥐눈이콩의 경우에서 배당체의 총량은 ' 98년산 은 8, 895 ㎎/㎏, '99년산은 9, 194 ㎎/㎏이었고, 비배당 체의 총량은 ' 98년산은 2, 065 ㎎/㎏, ' 99년산은 2, 252 ㎎/㎏이었다. 쥐눈이콩의 total isoflavone의 함량은 대 두의 약 2배 정도로 높게 나타났고 (p < 0.05), 특히 비배 당체인 genistein의 함량이 대두보다 매우 높게 나타났다 (p<0.01).
- 0%로 대 두보다 값은 높게 나타났다. 타액과 인공위액, 6-읺ucosi- dase로 2시간 반응시켰을 경우, 비배당체의 비율이 41.2% 였고 타액과 인공위 액, g-glucosidase, a -glucosidase 순으로 2시간 반응시켰을 경우, 비배당체의 비율이 82.6% 로 높게 나타났다.
- 따라서 결과의 재현성과 정확도는 반복분석을 하여 각 batch마다 약간의 차이는 있었으나 동일한 경향^을 나 타내었으며 본 논문에서는 대표적인 결과를 제시하였다. 표 준물질과 시료의 농도를 달리하여 분석한 결과에서는 직선 의 관계식을 얻었고, HPLC 분석에 사용한 시료에 포함된 isoflavone 함량은 0.1~0.5 μg (in 20 μL) 로 표준물질 의 사용농도와 detector에서 나타난 면적에서 나타난 직선 관계식 범위 내에 있었다.
- 3%로 크게 증가하였다. 한편, 타액과 인공위액 및 6-glucosidase와 24시간 반응시 95.2%로 현저하게 비배당체의 비율이 높게 나타나 추출물에 함유된 isoflav- one 대부분이 비배당체로 전환되었음을 보여주었다. 타액 과 인공위액, a-이ucosidase으로 24시간 반응시켰을 경우 비배당체 생성율은 58.
후속연구
- 앞으로 isoflavone에 관한 연구에서는 생리적인 조건을 고려하여야 하며, 비배당체로의 전환 및 가공식품의 발효과 정에 관한 연구가 함께 행해져야 할 것이다. 또한, 본 연구를 기초로 비배당체의 생체전환율에 따른 구체적인 향후 연구가 필요할 것으로 사료된다.
- 이상의 결과를 종합해 보면 위, 소장 등의 생리적 조건에 서는 대두나 쥐눈이콩의 isoflavone 배당체가 비배당체로 전환이 낮게 일어남으로 식품자체에 들어있는 비배당체의 함량이 중요한 의미를 갖고 있다. 상업적으로 공급되는 이 소플라본 제제와 비교시, 대두와 쥐눈이콩에는 이소플라본 이외에 다른 기능성 요소 (올리고당, 단백질 등)가 함께 포 함되어 있고 특히 쥐눈이콩은 고농도의 이소플라본과 비배 당체 생성율 또한 높으므로 건강기능 식품으로 개발할 가치 가 있을 것으로 사료되며 아울러 기전 연구 또한 요구된다.
- 앞으로 isoflavone에 관한 연구에서는 생리적인 조건을 고려하여야 하며, 비배당체로의 전환 및 가공식품의 발효과 정에 관한 연구가 함께 행해져야 할 것이다. 또한, 본 연구를 기초로 비배당체의 생체전환율에 따른 구체적인 향후 연구가 필요할 것으로 사료된다.
- 각종 대두 가공 식품의 추출물을 이용한 효능 검사에서 발효식품이 비발효식품보다 효과가 더 높*岡 았는데 이는 발효를 통하여 배당체가 활성이 높은 비배당체로 전환되었 기 때문에 생체이용률이 높아진 것으로 사료된다. 인체내의 환경과 흡사한 조건에서 효소와 시간적 처리에 의한 비 배당체로의 전환율을 살펴보면 대두보다 쥐눈이콩의 인체 이용율이 높으며, 발효식품의 인체이용율은 더욱 높을 것으로 기대한다. 따라서 대두 발효식품의 소비가 높은 우리나라 국민들에서의 인체이용율은 대두 섭취가 낮은 국민에 비하여 더 높을 것으로 사료된다.
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