본 연구에서는 16S rDNA복합중합효소연쇄반응을 이용하여 중이 삼출액에서 미생물병인원에 대한 특성을 알아보았다. 중이염환자의 중이 삼출액에서의 미생물 병인원은 주로 streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae와 Moraxella catarrhalis이다. 26명의 환자로부터 39개의 중이염의 삼출액을 얻었고, 중이 삼출액에서 DNA를 추출하였다. PCR은 16S rDNA의 C4 region에서 21 base pair의 common primer와 각각 bacterium specific primers [(i) Haemophilus-specific primer (ii) Moraxella-specific primer and (iii) Streptococcus-specific primer]를 이용하여 수행하였다. 39 개의 중이염의 삼출액 시료 중에서, H. influenzae가 24 개(61.5%) 검출되었고, M. catarrhalis는 10 개(25.6%), S.pneumoniae는 3개 (7.7%)가 검출되었다. 16s rDNA 복합중합효소연쇄 반응 진단 결과,11 개(28%)의 중이삼출액 시료에서 음성을 나타내었다. 중이염의 중복감염은 9개의 중이 삼출액시료에서 관찰되었고, 이들은 모두 H.influenzae 와 M. catarrhalis 에 의한 중복감염이었다. 본 연구에서 저자 등은 165 rDNA 복합중합효소연쇄반응이 병원성 미생물을 빠르게 진단하고, 중이삼출액의 미생물 병인론을 추적할 수 있는 좋은 방법으로 제시하는 바이다.
본 연구에서는 16S rDNA복합중합효소연쇄반응을 이용하여 중이 삼출액에서 미생물병인원에 대한 특성을 알아보았다. 중이염환자의 중이 삼출액에서의 미생물 병인원은 주로 streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae와 Moraxella catarrhalis이다. 26명의 환자로부터 39개의 중이염의 삼출액을 얻었고, 중이 삼출액에서 DNA를 추출하였다. PCR은 16S rDNA의 C4 region에서 21 base pair의 common primer와 각각 bacterium specific primers [(i) Haemophilus-specific primer (ii) Moraxella-specific primer and (iii) Streptococcus-specific primer]를 이용하여 수행하였다. 39 개의 중이염의 삼출액 시료 중에서, H. influenzae가 24 개(61.5%) 검출되었고, M. catarrhalis는 10 개(25.6%), S.pneumoniae는 3개 (7.7%)가 검출되었다. 16s rDNA 복합중합효소연쇄 반응 진단 결과,11 개(28%)의 중이삼출액 시료에서 음성을 나타내었다. 중이염의 중복감염은 9개의 중이 삼출액시료에서 관찰되었고, 이들은 모두 H.influenzae 와 M. catarrhalis 에 의한 중복감염이었다. 본 연구에서 저자 등은 165 rDNA 복합중합효소연쇄반응이 병원성 미생물을 빠르게 진단하고, 중이삼출액의 미생물 병인론을 추적할 수 있는 좋은 방법으로 제시하는 바이다.
The rapid and reliable 16S rDNA multiplex polymerase chain reaction (PCR) assay was established to characterize bacterial etiologies of middle ear effusion. These etiologies included Haemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis and Streptococcus pneumonia, which were detected in middle-ear effusion...
The rapid and reliable 16S rDNA multiplex polymerase chain reaction (PCR) assay was established to characterize bacterial etiologies of middle ear effusion. These etiologies included Haemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis and Streptococcus pneumonia, which were detected in middle-ear effusion (MEE) samples taken from patient with otitis media. A total of 39 MEE samples were aspirated from 26 patients. DNA was extracted from MEE samples, and PCR was done with DNA extracts by using the common primers, which is localized at C4 region in the 16S rDNA gene of all bacterial species, and species-specific primers: (i) Haemophilus-specific primer, (ii) Moraxella- specific primer, and (iii) Streptococcus-specific primer. Among 39 samples tested, 24 (61.5%) were positive for H. influenzae, 10 (25.6%) were positive for M. catarrhalis, 3(7.7%) were positive for S. pneumonia, and 11 (28%) were negative for 165 rDNA multiplex PCR reaction. Nine samples (28.6%) exhibited a mixed infection and were positive for both H. infuenzae and M. catarrhalis. We suggested that 16S rDNA multiplex PCR is a useful method to identify rapidly for rapid identification of the pathogenic bacteria and characterization of bacterial etiologies of middle ear effusion.
The rapid and reliable 16S rDNA multiplex polymerase chain reaction (PCR) assay was established to characterize bacterial etiologies of middle ear effusion. These etiologies included Haemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis and Streptococcus pneumonia, which were detected in middle-ear effusion (MEE) samples taken from patient with otitis media. A total of 39 MEE samples were aspirated from 26 patients. DNA was extracted from MEE samples, and PCR was done with DNA extracts by using the common primers, which is localized at C4 region in the 16S rDNA gene of all bacterial species, and species-specific primers: (i) Haemophilus-specific primer, (ii) Moraxella- specific primer, and (iii) Streptococcus-specific primer. Among 39 samples tested, 24 (61.5%) were positive for H. influenzae, 10 (25.6%) were positive for M. catarrhalis, 3(7.7%) were positive for S. pneumonia, and 11 (28%) were negative for 165 rDNA multiplex PCR reaction. Nine samples (28.6%) exhibited a mixed infection and were positive for both H. infuenzae and M. catarrhalis. We suggested that 16S rDNA multiplex PCR is a useful method to identify rapidly for rapid identification of the pathogenic bacteria and characterization of bacterial etiologies of middle ear effusion.
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문제 정의
그러나, 이런 배양법에 의한 중이염 검출방법은 만성 삼출성 중이염에 있어서 20~30%의 낮은 균 검출율을 나타 내었을 뿐만 아니라 많은 시간과 노력이 필요하였다(7). 따라서 중이 삼출액에 대하여 보다 높은 균 검출율을 나타낼 수 있는 방법의 필요성이 제시되었다. 최근에 PCR방법을 이용하기 시작 하였고, PCR을 이용한 진단방법은 일반적인 배양검사의 균 검출 율보다 훨씬 높은 70~80%의미 생물 검출율을 보였다(4, 10).
제안 방법
39 개의 중이 삼출액 검체로부터 DNA를 추출한 후, 16S rDNA 복합중합효소연쇄반응 진단을 시행하였다. 2% agrose gel 상에서 하나 이상의 DNA 단편이 관찰된 시료는 28 개(71.
S. pneumoniae, H.influenzae와 M. catarrhalise를 배양한 후 각 미생물에 특이적인 sense primer와 모든 미생물에 공통적인 antisense primer를 사용하여 최초로 한국인의 중이염 원인균에 대하여 16S rDNA 복합중합효소연쇄반응 진단을 시행하였다. H.
4℃에서 10, 000Xg으로 20 분간 원심 분리 하여 DNA을 침전시키고 80% cold ethan이로 세척 후 건조하여 20μ1 <旧2。로 DNA를 녹인다. 같은 방법으로 미리 배양되었던 Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzaee}- Moraxella catarrhalis로부터 각각의 DNA를 추출하였다.
1). 복합중합효소연쇄반응의 조건은 DNA thermal cycler (MJ Reserch, Waltham, USA)를 사용하여 95, C에서 변성 (denaturation), 50℃ 에서 결합 (annealing), 72℃에서 중합 (polymerization)의 3 단계를 30 회 시행하였다. 중합효소반응의 산물은 각각 3 μl를 2% agarose gel에서 100 volt, 20 분간 전기 영동을 실시하였고 0.
의 경우, 192~212 사이에 위치한 21 mer의 primer를 sense primer로 제작하였다. 이 primer들과 중이 삼출액에서 추출된 DNA와 배양된 미생물로부터 추출된 DNA를 16S rDNA 복합중합효소연쇄반응을 시행하였다(Fig. 1). 복합중합효소연쇄반응의 조건은 DNA thermal cycler (MJ Reserch, Waltham, USA)를 사용하여 95, C에서 변성 (denaturation), 50℃ 에서 결합 (annealing), 72℃에서 중합 (polymerization)의 3 단계를 30 회 시행하였다.
환자들의 나이는 1 세부터 7 세까지였으며 평균 연령은 3 세였다. 중이 삼출액은 이경과 고막운동성 검사를 통해 삼출성 중이염으로 진단되어진 환자에게서 고막천자술과 환기튜브삽입 술로 추출하였다.
복합중합효소연쇄반응의 조건은 DNA thermal cycler (MJ Reserch, Waltham, USA)를 사용하여 95, C에서 변성 (denaturation), 50℃ 에서 결합 (annealing), 72℃에서 중합 (polymerization)의 3 단계를 30 회 시행하였다. 중합효소반응의 산물은 각각 3 μl를 2% agarose gel에서 100 volt, 20 분간 전기 영동을 실시하였고 0.5% ethidium bromide 염색후 자외선 하에서 관찰하였다.
대상 데이터
16S rDNA의 보존 부위 (conserved sequence) 중의 하나인 C4 region의 21 base pair의 염기 서열을 공통적인 anti-sense primer 로 사용하였다(Table 1). H.
2000년 9 월부터 2001년 2 월까지 고막 천자술 및 환기튜 브삽입술을 시술한 26 명의 환자들로부터 총 39 개의 중이 삼출액 검체를 얻었다. 환자들의 나이는 1 세부터 7 세까지였으며 평균 연령은 3 세였다.
X58312)의 경우 567-587 사이에 존재한다. H. influenzae 에 특이적인 primere- H. 의 16S rDNA의 177~200 사이에 위치한 24 mer의 primer# sense primei로 제작하였다. M.
region의 21 base pair의 염기 서열을 공통적인 anti-sense primer 로 사용하였다(Table 1). H. influenzae와 M. caf자까uHis의 공통적인 anti-sense primer는 Panu가 제작한 것을 사용하였고(7), S. pneumoniaee] primei는 Whitehead Institute/MT Center for Genome Research에서 개발한 primer3을 이용하여 제작하였다. 이 염기서열은 H.
외이도는 70% isopropyl alcohol을 투입 후 1분 뒤에 제거하였다. 고막의 전하방에 고막천자술을 시행한 후 무균 처리된 흡 입관(Juhn tray)과 흡입장치를 이용해 삼출액을 채취하였다. 검체는 PCR을 위해 바로 -7(TC로 냉각시켰다.
이론/모형
본 연구에서 저자들은 빠르고 경제적이고 간편한 방법인 복합 중합효소반응(multiplex PCR) 방법을 이용하여 소아중이 염환자에서 중이염 원인균 검출을 시행하였다.
성능/효과
2%)이었다. H. influenzaee] DNA 증폭 산물로 예즉되는 525 base pair의 띠가 관찰된 시료는 24 개(61.5%)이었고, M. catarrhalis의 DNA 증폭 산물로 예측되는 237 base pair의 띠가 관찰된 시료는 10 개 (25.6%)이었고, S. pnemomia의 DNA 증폭 산물로 예측되는 395 base pair의 띠가 관찰된 시료는 3 개(7.7%)이었다. 중이삼출액 검체의 16S rDNA 복합중합효소연쇄반응 진단 결과, 혼합 감염은 H.
catarrhalise를 배양한 후 각 미생물에 특이적인 sense primer와 모든 미생물에 공통적인 antisense primer를 사용하여 최초로 한국인의 중이염 원인균에 대하여 16S rDNA 복합중합효소연쇄반응 진단을 시행하였다. H.influenae의 DNA를 주형으로 복합중합효소연쇄반응 진단을 시행한 경우 2% agarose gel 상에서 525 base pair의 DNA 띠가 관찰되었고, S. pneiinomia의 경우는 395 base pair, 그리고 M. catarrhalis의 경우는 237 base pair의 DNA 띠를 관찰할 수 있었다. 또한 미생물을 혼합배양한 후 DNA를 추출하여, 이를 주형으 로 16S rDNA 복합중합효소연쇄반응 진단을 시행한 결과, 미생물을 나타내는 띠가 모두 관찰되었다(Fig.
catarrhalis의 경우는 237 base pair의 DNA 띠를 관찰할 수 있었다. 또한 미생물을 혼합배양한 후 DNA를 추출하여, 이를 주형으 로 16S rDNA 복합중합효소연쇄반응 진단을 시행한 결과, 미생물을 나타내는 띠가 모두 관찰되었다(Fig. 2).
미생물의 16S rDNA 염기서열은 생명연장의 필수적인 부분이기 때문에 대부분이 잘 보존될 뿐만 아니라 family- 또는 species specific sequence를 포함하고 있다. 본 연구에서는 16S rDNA 복 합 중합효소반응을 이용하여 중이삼출액의 중이염 원인균을 진단한 결과, 기존의 PCR 방법보다 훨씬 빠르고 간편하다는 것과 특히 적은 양의 검체에서 균을 검출하는데 유용하다는 것을 확인할 수 있었다.
Post 등(8)은 소아환자로부터 97 개의 중이 삼출액을 각기 특이적인 항원 생성에 관여하는 단백질의 prirnei# 고안하여 PCR 방법으로 분석하였다. 분석결과, 53 개에서 H. influenzae, 45 개 에서 M. catarrhalis, 그리고 29 개에서 S. pneumoniaee 대한 양성 검출율을 나타내었다. 그러나, 일반 균 배양검사에서는 21 개에서 H.
7%)이었다. 중이삼출액 검체의 16S rDNA 복합중합효소연쇄반응 진단 결과, 혼합 감염은 H. influenzae와 M. catarrhalis의 경우 9 개(23.1%)에서만 관찰되었다. 또한 M.
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