16S rDNA-RFLP에 의한 Spirastrella abata와 Spirastrella panis 해면에 서식하는 배양가능한 공생세균 군집의 비교 Comparative Analysis of the Community of Culturable Bacteria Associated with Sponges, Spirastrella abata and Spirastrella panis by 16S rDNA-RFLP원문보기
계통적으로 근연하며 지리적 분포가 유사한 두 종의 Spirastrella 속의 해양 해면, S. panis와 S. abata의 배양 가능한 공생세균 군집구조를 16S rDNA-RFLP 방법에 의해 분석하였다. 공생세균의 배양은 해면추출물 3%를 포함하는 MA 배지를 사용하였다. 증폭된 16S rDNA의 RFLP (restriction fragment length polymorphism) 분석을 위한 제한효소로 HaeIII와 MspI을 이용하였으며, 그 결과 24개의 RFLP type을 구별할 수 있었다. 각 패턴별로 1~5개의 분리균주를 선별하여 부분 염기서열 분석 결과, 알려진 세균 종과 98.4% 이상의 유사도를 나타내었으며 2종의 Spirastrella 해면으로부터 분리된 세균들은 모두 Alphaproteobacteria, Gammaproteobacteria, Firmicutes, Actinobacteria 4개의 강(class)에 포함되었다. Alphaproteobacteria는 S. abata에서 39.3%, S. panis에서 47.6%가 관찰되어 두 해면에서 우점하는 세균 군집이었다. Gammaproteobacteria의 경우 S. abata에서 38.5%로 관찰된 반면 S. panis에서 1.6%의 아주 적은 비율로 관찰되었다. 또한 Bacillus (phylum Firmicutes) 종은 S. abata에서 9.7%를 나타낸 반면, S. panis에서는 44.3%의 분포를 나타내었다. Planococcus maritimus (8.1%, phylum Firmicutes)와 Psychrobacter nivimaris (28.9%, phylum Gammaproteobacteria)는 S. abata에서만 관찰되어 이들은 S. abata에 특이적인 세균 종임을 알 수 있었다. 같은 장소에 서식하는 계통적으로 근연한 두 종의 해면에서 공생세균의 군집 구조는 차이가 큰 것으로 나타났다.
계통적으로 근연하며 지리적 분포가 유사한 두 종의 Spirastrella 속의 해양 해면, S. panis와 S. abata의 배양 가능한 공생세균 군집구조를 16S rDNA-RFLP 방법에 의해 분석하였다. 공생세균의 배양은 해면추출물 3%를 포함하는 MA 배지를 사용하였다. 증폭된 16S rDNA의 RFLP (restriction fragment length polymorphism) 분석을 위한 제한효소로 HaeIII와 MspI을 이용하였으며, 그 결과 24개의 RFLP type을 구별할 수 있었다. 각 패턴별로 1~5개의 분리균주를 선별하여 부분 염기서열 분석 결과, 알려진 세균 종과 98.4% 이상의 유사도를 나타내었으며 2종의 Spirastrella 해면으로부터 분리된 세균들은 모두 Alphaproteobacteria, Gammaproteobacteria, Firmicutes, Actinobacteria 4개의 강(class)에 포함되었다. Alphaproteobacteria는 S. abata에서 39.3%, S. panis에서 47.6%가 관찰되어 두 해면에서 우점하는 세균 군집이었다. Gammaproteobacteria의 경우 S. abata에서 38.5%로 관찰된 반면 S. panis에서 1.6%의 아주 적은 비율로 관찰되었다. 또한 Bacillus (phylum Firmicutes) 종은 S. abata에서 9.7%를 나타낸 반면, S. panis에서는 44.3%의 분포를 나타내었다. Planococcus maritimus (8.1%, phylum Firmicutes)와 Psychrobacter nivimaris (28.9%, phylum Gammaproteobacteria)는 S. abata에서만 관찰되어 이들은 S. abata에 특이적인 세균 종임을 알 수 있었다. 같은 장소에 서식하는 계통적으로 근연한 두 종의 해면에서 공생세균의 군집 구조는 차이가 큰 것으로 나타났다.
A cultivation-based approach was employed to compare the culturable bacterial diversity associated with two phylogenetically closely related marine sponges, Spirastrella abata and Spirastrella panis, which have geologically overlapping distribution patterns. The bacteria associated with sponge were ...
A cultivation-based approach was employed to compare the culturable bacterial diversity associated with two phylogenetically closely related marine sponges, Spirastrella abata and Spirastrella panis, which have geologically overlapping distribution patterns. The bacteria associated with sponge were cultivated using MA medium supplemented with 3% sponge extracts. Community structures of the culturable bacteria of the two sponge species were analyzed with PCR-RFLP (restriction fragment length polymorphism) based on 16S rDNA sequences. The RFLP fingerprinting of 16S rDNA digested with HaeIII and MspI, revealed 24 independent RFLP types, in which 1-5 representative strains from each type were partially sequenced. The sequence analysis showed >98.4% similarity to known bacterial species in public databases. Overall, the microbial populations of two sponges investigated were found to be the members of the classes; Alphaproteobacteria, Gammaproteobacteria, Firmicutes, and Actinobacteria. The Alphaproteobacteria were predominant in the bacterial communities of the two sponges. Gammaproteobacteria represented 38.5% of bacterial community in S. abata. Whereas only 1.6% of this class was present in S. panis. Bacillus species were dominat in S. panis. Bacillus species were found to be 44.3% of bacterial species in S. panis, while they were only 9.7% in S. abata. It is interesting to note that Planococcus maritimus (8.1%, phylum Firmicutes) and Psychrobacter nivimaris (28.9%, phylum Gammaproteobacteria) were found only in S. abata. This result revealed that profiles of bacterial communities from the sponges with a close phylogenetic relationship were highly species-specific.
A cultivation-based approach was employed to compare the culturable bacterial diversity associated with two phylogenetically closely related marine sponges, Spirastrella abata and Spirastrella panis, which have geologically overlapping distribution patterns. The bacteria associated with sponge were cultivated using MA medium supplemented with 3% sponge extracts. Community structures of the culturable bacteria of the two sponge species were analyzed with PCR-RFLP (restriction fragment length polymorphism) based on 16S rDNA sequences. The RFLP fingerprinting of 16S rDNA digested with HaeIII and MspI, revealed 24 independent RFLP types, in which 1-5 representative strains from each type were partially sequenced. The sequence analysis showed >98.4% similarity to known bacterial species in public databases. Overall, the microbial populations of two sponges investigated were found to be the members of the classes; Alphaproteobacteria, Gammaproteobacteria, Firmicutes, and Actinobacteria. The Alphaproteobacteria were predominant in the bacterial communities of the two sponges. Gammaproteobacteria represented 38.5% of bacterial community in S. abata. Whereas only 1.6% of this class was present in S. panis. Bacillus species were dominat in S. panis. Bacillus species were found to be 44.3% of bacterial species in S. panis, while they were only 9.7% in S. abata. It is interesting to note that Planococcus maritimus (8.1%, phylum Firmicutes) and Psychrobacter nivimaris (28.9%, phylum Gammaproteobacteria) were found only in S. abata. This result revealed that profiles of bacterial communities from the sponges with a close phylogenetic relationship were highly species-specific.
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제안 방법
16S rDNA-RFLP fingerprinting type에 따라 각각의 RFLP type 별로 1~5개의 분리 균주들을 선택하여 총 46균주의 부분 염기 서열(900 bp 이상)을 분석하였다. 증폭된 PCR 산물은 High Pure PCR Product Purification kit (Roche, IN)를 이용하여 정제하였으며, 27f primer로 ABI PRISM 3100 automated sequencer (PE Applied Biosystems, CA)를 이용하여 염기 서열을 결정하였다.
GeneAmp PCR system 2700 thermal cycler (Applied Biosystems, Version 2.0, USA)를 이용하여 94°C에서 3분간 초기 변성시킨 후, 94°C에서 40초간 변성, 55°C에서 40초간 냉각, 72°C에서 1분간 신장, 이 과정을 30 cycle 반복 수행한 후 최종적으로 72°C에서 10분간 신장시켰다.
PCR 반응은 100 ng의 주형 DNA와 5U e-Taq polymerase (Solgent, Korea), 10 mM dNTP, 10× e-Taq buffer, 10 pmol primer를 최종 반응량이 50 µl가 되도록 혼합하여 수행하였다.
RFLP 분석에 의해 24개의 type으로 나뉜, 2종의 Spirastrella 해면으로부터 분리된 세균들에 대하여 각 RFLP type 별로 1~5개의 분리 균주를 선별하여 부분 염기서열을 분석하였으며, 결정된 부분 염기서열은 NCBI에 등록하였다(Table 1). 염기서열이 분석된 총 46개의 분리 균주는 모두 기존에 보고된 세균 종과 98.
각각 10-4까지 순차 희석한 후 각각의 해면 추출물 3%를 가한 MA 배지(marine agar 2216, Difco, USA)에 100 µl씩 도말하여 30°C에서 2일간 배양하였다.
증폭된 PCR 산물은 High Pure PCR Product Purification kit (Roche, IN)를 이용하여 정제하였으며, 27f primer로 ABI PRISM 3100 automated sequencer (PE Applied Biosystems, CA)를 이용하여 염기 서열을 결정하였다. 결정된 염기서열은 NCBI (the National Center for Biotechnology Information)에 등록된 염기서열을 대상으로 Blast search를 수행하였다. 각 염기서열의 alignment는 CLUSTAL W (23)를 이용하여 정렬하였고 계통분석은 PHYDIT 3.
분리된 균주들의 순수 분리를 위하여 동일 한천 배지에서 계대 배양하여 단일 콜로니를 얻었다. 두 종의 해면에서 분리한 균주 중, Spirastrella abata에서 135균주, Spirastrella panis에서 124개의 균주를 무작위로 선별하여 총 348개의 균주를 이용해 16S rDNA의 RFLP 분석을 수행하였다.
반응물은 3% agarose gel (Bio-Rad, USA)을 사용하여 1× TAE buffer (40 mM Tris-acetate, 1 mM EDTA, pH8.0)로 100 V, 30분간 전기 영동한 후 EtBr (50 ng/ml)로 염색하여 Gel Logic 200 (Kodak)을 이용하여 UV 하에서 관찰하여 각 균주의 밴드유형을 확인하였다.
Spirastrella abata에서 303개, Spirastrella panis에서 317개의 균주를 분리하였다. 분리된 균주들의 순수 분리를 위하여 동일 한천 배지에서 계대 배양하여 단일 콜로니를 얻었다. 두 종의 해면에서 분리한 균주 중, Spirastrella abata에서 135균주, Spirastrella panis에서 124개의 균주를 무작위로 선별하여 총 348개의 균주를 이용해 16S rDNA의 RFLP 분석을 수행하였다.
4% 이상의 유사도를 나타내었다. 염기서열이 분석된 종들의 동정 결과와 이들의 RFLP type을 근거로 하여 처음 RFLP 분석에 쓰여 졌던 259개의 균주들을 분석하고 이들의 분석 결과에 근거하여 군집의 차이를 분석하였다. 이 결과는 Table 2와 Fig.
0)에서 전기영동 하였다. 전기영동 후, EtBr (ethidium bromide, 50 ng/ml)에 10분간 염색하여 Gel Logic 200 (Kodak, USA)을 이용하여 UV 하에서 약 1.5 kb 단편을 확인하였다.
증폭된 DNA의 확인을 위해서 PCR 반응액 3 µl를 취하여 1% agarose gel (Bio-Rad, USA)을 이용하여 Mupid-ex (ADVANCE, Japan)로 100 V, 25분간 1×TAE buffer (40 mM Tris-acetate, 1 mM EDTA, pH 8.0)에서 전기영동 하였다.
16S rDNA-RFLP fingerprinting type에 따라 각각의 RFLP type 별로 1~5개의 분리 균주들을 선택하여 총 46균주의 부분 염기 서열(900 bp 이상)을 분석하였다. 증폭된 PCR 산물은 High Pure PCR Product Purification kit (Roche, IN)를 이용하여 정제하였으며, 27f primer로 ABI PRISM 3100 automated sequencer (PE Applied Biosystems, CA)를 이용하여 염기 서열을 결정하였다. 결정된 염기서열은 NCBI (the National Center for Biotechnology Information)에 등록된 염기서열을 대상으로 Blast search를 수행하였다.
해면은 2007년 9월 28일 제주도 모슬포항에서 스쿠버 다이빙을 이용하여 25 m 깊이의 바다에서 채집하였으며, 채집된 Spirastrella abata와 Spirastrella panis는 해면조직이 공기와 접촉되는 것을 방지하기 위하여 해수가 포함된 plastic bags에 옮겨 4°C에서 운반하였다. 해면 조각을 멸균된 인공해수(ASW)로 3회 세척 후, 해면의 안쪽을 1 cm3 크기로 잘라 인공해수 3 ml 넣어 균질화시킨 다음 10 min 간 초음파 처리하였다. 각각 10-4까지 순차 희석한 후 각각의 해면 추출물 3%를 가한 MA 배지(marine agar 2216, Difco, USA)에 100 µl씩 도말하여 30°C에서 2일간 배양하였다.
대상 데이터
염색체 DNA는 분리된 세균 균주의 각 colony로부터 gDNA Isolation kit (Promega, USA)를 사용하여 분리하였으며 분리된 DNA는 PCR 반응의 주형으로 사용하였다. 16S rDNA의 증폭에는 27f (AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG)와 1492r (TAC GGY TAC CTT GTT ACG AC)의 primer 쌍을 사용하였다. PCR 반응은 100 ng의 주형 DNA와 5U e-Taq polymerase (Solgent, Korea), 10 mM dNTP, 10× e-Taq buffer, 10 pmol primer를 최종 반응량이 50 µl가 되도록 혼합하여 수행하였다.
PCR 산물의 RFLP 분석을 위해 증폭된 1.5 kb의 DNA 단편에 2종의 제한효소 HaeIII (TaKaRa, Japan)와 MspI (TaKaRa)을 사용하였다. PCR 산물에 각각의 제한 효소를 첨가하여 37°C에서 4시간 반응시켰다.
해면은 2007년 9월 28일 제주도 모슬포항에서 스쿠버 다이빙을 이용하여 25 m 깊이의 바다에서 채집하였으며, 채집된 Spirastrella abata와 Spirastrella panis는 해면조직이 공기와 접촉되는 것을 방지하기 위하여 해수가 포함된 plastic bags에 옮겨 4°C에서 운반하였다.
이론/모형
결정된 염기서열은 NCBI (the National Center for Biotechnology Information)에 등록된 염기서열을 대상으로 Blast search를 수행하였다. 각 염기서열의 alignment는 CLUSTAL W (23)를 이용하여 정렬하였고 계통분석은 PHYDIT 3.5 package (2)를 이용하여 neighbor-joining method에 의해 phylogenetic tree를 추론하였다. 1,000회 반복 bootstrap 분석에 의해 계통수를 확인하였다.
각각 10-4까지 순차 희석한 후 각각의 해면 추출물 3%를 가한 MA 배지(marine agar 2216, Difco, USA)에 100 µl씩 도말하여 30°C에서 2일간 배양하였다. 각각의 해면 추출액은 Wichels 등(27)의 방법에 따라 준비하였다.
두 종의 Spirastrella속의 해면, S. panis와 S. abata의 배양 가능한 공생세균 군집구조를 16S rDNA의 PCR-RFLP 방법에 의해 분석하였다. 마쇄한 해면조직액을 초음파 처리하고 해면 추출액을 첨가한 배지에 배양하였을 경우, 그렇지 않았을 때와 비교하여 훨씬 많은 수의 공생세균이 관찰되었으므로(자료 미제시) 이 방법에 따라 공생세균을 분리하여 군집분석에 이용하였다.
abata의 배양 가능한 공생세균 군집구조를 16S rDNA의 PCR-RFLP 방법에 의해 분석하였다. 마쇄한 해면조직액을 초음파 처리하고 해면 추출액을 첨가한 배지에 배양하였을 경우, 그렇지 않았을 때와 비교하여 훨씬 많은 수의 공생세균이 관찰되었으므로(자료 미제시) 이 방법에 따라 공생세균을 분리하여 군집분석에 이용하였다. 두 종의 해면에서 순수 분리된 총 620개 균주 중 무작위로 선별된, 총 259균주에 대하여 두 종의 제한 효소를 사용하여 16S rDNA의 RFLP 분석을 수행한 결과, 24개의 서로 다른 RFLP type이 구분 되었다(Fig.
따라서 해면 공생세균의 다양성을 밝히는 데 있어 배양법에 근거한 연구도 활발히 이루어지고 있다(10, 13, 28, 30). 본 연구에서는 다양한 천연물이 생산되고 있는 것으로 알려진 Spirastrella 속의 해면 중 계통적으로 근연하며 지리적 분포가 유사한 것으로 알려진 S. abata와 S. panis를 우리나라의 제주도로부터 채집하여 배양 가능한(culturable) 종속영양세균의 공생세균 군집구조를 16S rDNA (16S rRNA gene)를 PCR에 의해 증폭하여 RFLP (restriction fragment length polymorphism) 방법에 의해 분석하였다.
성능/효과
24개의 RFLP type 별로 1~5개씩 중복하여 16S rDNA의 부분 염기서열(900 bp 이상)을 분석한 결과 동일한 RFLP type은 같은 종으로 동정되어(Table 1), 2종의 제한 효소에 의한 RFLP type은 종을 구별하기 위한 간단하고도 안정적인 수단임을 확인할 수 있었다.
5%로 나타나 Alphaproteobacteria에 이어 우점세균 군집으로 나타났다. Gammaproteobacteria 중 Psychrobacter nivimaris는 가장 높은 분포율(28.9%)을 나타내는 세균 종이나 오직 S. abata 해면에서만 발견되어 S. abata에 특이적인 세균 종임을 알 수 있었다.
1 and Table 1). HaeIII에 의해 15 type (Table 1의 아라비아 숫자), MspI에 의해 16개의 type (Table 1의 알파벳)을 얻었으며 이를 근거로 분석한 결과, 총 24개의 서로 다른 RFLP type을 얻을 수 있었다.
2%를 차지하였다. S. abata에서는 Bacillus 속 세균 종들은 9.7%로 매우 적은 분포를 나타낸 반면, S. panis 해면 종에서는 Bacillus aerophilus, B. cereus, B. megaterium 등 Bacillus 속 세균 종들이 44.3%를 차지하여 Bacillus 속 세균 종들이 가장 우점하는 세균 종이었다. Planococcus maritimus는 S.
abata에서만 발견되었다. 그 구성 비율은 8.1%를 차지하여 단일 종으로는 Firmicutes에 포함되는 종에서 가장 우점하는 세균 종이었다.
abata에서만 관찰되었다. 그 외 분포 비율은 적으나 Exiguobacterium marinum, Ruegeria pelagia, Shewanella irciniae, Cobetia marina, Psychrobacter celer 역시 S. abata에서만 관찰되었으며 Bacillus cibi, B. firmus, Halobacillus trueperi, Lysinibacillus boronitolerans, Pseudovibrio ascidiaceicola 종은 S. panis에서만 관찰되었다.
5%로 관찰되었다. 그 중에서 S. panis에서 관찰되지 않았던 Psychrobacter nivimaris는 S. abata에서 28.9%로 가장 많은 수를 차지하여 이 종은 S. abata에 특이적인 종임을 알 수 있었다. Firmicutes의 경우, S.
마쇄한 해면조직액을 초음파 처리하고 해면 추출액을 첨가한 배지에 배양하였을 경우, 그렇지 않았을 때와 비교하여 훨씬 많은 수의 공생세균이 관찰되었으므로(자료 미제시) 이 방법에 따라 공생세균을 분리하여 군집분석에 이용하였다. 두 종의 해면에서 순수 분리된 총 620개 균주 중 무작위로 선별된, 총 259균주에 대하여 두 종의 제한 효소를 사용하여 16S rDNA의 RFLP 분석을 수행한 결과, 24개의 서로 다른 RFLP type이 구분 되었다(Fig. 1 and Table 1). HaeIII에 의해 15 type (Table 1의 아라비아 숫자), MspI에 의해 16개의 type (Table 1의 알파벳)을 얻었으며 이를 근거로 분석한 결과, 총 24개의 서로 다른 RFLP type을 얻을 수 있었다.
두 종의 해면으로부터 분리된, 배양 가능한 공생세균은 모두 Alphaproteobacteria, Gammaproteobacteria, Firmicutes, Actinobacteria 4개의 강(class)에 포함되었다. Table 2에서 보는 바와 같이 Alphaproteobacteria는 S.
즉, 두 종의 해면에서 공통된 우점 세균 군집은 Alphaproteobacteria이었다. 또한 Alphaproteobacteria 중 단일 종으로 가장 우점하는 세균은 Pseudovibrio denitrificans로 S. panis에서 42.7%, S. abata에서 37.8%, 각각 분포하는 것으로 나타났다. 이는 Muscholl-Silberhorn 등(14)에 의한 지중해에 서식하는 해면 10종에 대한 배양 가능한 공생세균의 다양성 연구 결과에서 Alphaproteobacteria가 우점 세균 군집이라는 것과 일치하는 결과였으며, 또한 지중해 해면 10종 중 6종의 해면에서 우점하는 세균 종이 Pseudovibrio denitrificans라는 연구결과 매우 유사한 결과였다.
문(phylum) 수준에서 두 해면 종의 공생세균은 동일하게 4개의 강에 속하였으며, S. abata에서는 Alphaproteobacteria (39.3%)와 Gammaproteobacteria (38.5%)가 우점하는 반면, S.panis의 경우 Firmicutes (49.2%)와 Alphaproteobacteria (47.6%)가 우점하였다. 즉, 두 종의 해면에서 공통된 우점 세균 군집은 Alphaproteobacteria이었다.
7%로 매우 적은 분포를 나타내었다. 반면 Firmicutes 종 중 Planococcus maritimus는 가장 높은 비율(8.1%)로 관찰되는 세균 종이었으나 S. abata에서만 관찰되었다. 그 외 분포 비율은 적으나 Exiguobacterium marinum, Ruegeria pelagia, Shewanella irciniae, Cobetia marina, Psychrobacter celer 역시 S.
본 연구에 사용한 Spirastrella 두 종의 해면은 계통적 유연관계가 가까우며, 지리적 분포가 유사한 것으로 알려진 해면으로써 제주도의 모슬포항의 같은 장소에서 채집된 것으로써, 공생세균의 군집은 문(phylum) 수준에서 Alphaproteobacteria라는 공통의 세균 군집을 갖는 것으로 나타났으나(Fig. 2), 세균 종의 구성에 있어서는 종 특이적인 분포를 나타내었다.
RFLP 분석에 의해 24개의 type으로 나뉜, 2종의 Spirastrella 해면으로부터 분리된 세균들에 대하여 각 RFLP type 별로 1~5개의 분리 균주를 선별하여 부분 염기서열을 분석하였으며, 결정된 부분 염기서열은 NCBI에 등록하였다(Table 1). 염기서열이 분석된 총 46개의 분리 균주는 모두 기존에 보고된 세균 종과 98.4% 이상의 유사도를 나타내었다. 염기서열이 분석된 종들의 동정 결과와 이들의 RFLP type을 근거로 하여 처음 RFLP 분석에 쓰여 졌던 259개의 균주들을 분석하고 이들의 분석 결과에 근거하여 군집의 차이를 분석하였다.
6%)가 우점하였다. 즉, 두 종의 해면에서 공통된 우점 세균 군집은 Alphaproteobacteria이었다. 또한 Alphaproteobacteria 중 단일 종으로 가장 우점하는 세균은 Pseudovibrio denitrificans로 S.
특히 Planococcus maritimus와 Psychrobacter nivimaris의 경우 S. abata에서만 관찰되어 이들은 S. abata에 특이적인 세균 종임을 알 수 있었다. Turque 등(25)의 연구에서도 해면 종들은 서로 공유하는 세균 그룹이외에도 해면 종에 특이적인 세균 종들이 분포함을 보고하고 있다.
6%가 관찰되어 두 해면에서 우점하는 세균 군집이었다. 특히, Alphaproteobacteria에서 Pseudovibrio 종이 두 해면 모두에서 우점종을 차지하였다. Gammaproteobacteria의 경우 S.
후속연구
이러한 배양상의 한계를 극복하기 위해 다양한 조성의 배지를 이용하여, 순수 분리가 아닌 혼합 배양에 의해 세균 군집의 구조를 파악하려는 시도(14)도 이루어지고 있으나 공생세균 군집의 농화배양을 위한 배지로 우선 해면추출물이나 기타 유사물질을 이용하는 방안을 포함하여 배양조건에 관한 더 많은 연구가 필요할 것으로 생각된다. 나아가 metagenome 기법 혹은 분자생물학적 방법에 의한 연구 결과와의 비교도 유용할 것으로 사료된다.
Hentscel 등(8)의 DGGE와 rpo gene을 이용한 비배양법에 의한 연구 결과에서도 유연관계가 멀며 지리적 분포가 서로 다른 두 종의 해면 Aplisina aerophoba와 Athenella swinhoei의 공생미생물 군집이 거의 유사하다는 연구 결과를 보고하여 해면 공생세균은 숙주 특이성 나타낸다는 연구 결과들과는 상이한 결과를 보고하였다. 따라서 공생세균의 숙주 특이성에 관한 연구는 현재까지 보고된 연구 결과로는 일관성을 찾기 어려우며, 앞에서 기술한 바와 같이 해면 종에 따라 공생세균 종의 구성이 매우 다른 경우와 그와 달리 공생세균의 종 구성이 매우 유사하다는 상반된 결과들이 보고되고 있어 해면공생세균의 숙주 특이성에 관한 고찰은 다양한 지리적 분포를 갖는 많은 해면 종을 대상으로 이에 관한 연구가 더욱 수행되어야 할 것으로 생각된다.
MA 배지에 해면 추출물을 첨가한 배지를 이용하는 경우, 보다 다양한 공생세균 군집이 나타나지만 영양농도가 높은 배지의 경우 해면 추출물의 영향이 거의 없는 것으로 보고되고 있어(26), 현재까지의 알려진 배지를 사용한 순수 분리에 의한 배양 방법으로는 배양 가능한 공생세균 중 극히 일부의 세균 군집만이 파악 가능하다. 이러한 배양상의 한계를 극복하기 위해 다양한 조성의 배지를 이용하여, 순수 분리가 아닌 혼합 배양에 의해 세균 군집의 구조를 파악하려는 시도(14)도 이루어지고 있으나 공생세균 군집의 농화배양을 위한 배지로 우선 해면추출물이나 기타 유사물질을 이용하는 방안을 포함하여 배양조건에 관한 더 많은 연구가 필요할 것으로 생각된다. 나아가 metagenome 기법 혹은 분자생물학적 방법에 의한 연구 결과와의 비교도 유용할 것으로 사료된다.
Alphaproteobacteria의 경우 서로 다른 다양한 해면으로부터 높은 빈도로 발견되는 배양 가능한 공생세균으로 밝혀지고 있는데, 이는 각각의 숙주 해면과 공진화해온 것이 아니며, 진화 과정에서 비교적 늦게 해면과 공생관계를 구성한 것으로 추정되고 있다(5). 이와 같이 해면에 따른 공생세균의 군집구조를 규명함으로써 세균과 해면의 공생관계에 따른 생태적 기능의 분석 및 두생물 종 간의 진화적 고찰이 가능하리라 생각된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
S. panis와 S. abata의 배양 가능한 공생세균 군집구조를 16S rDNA-RFLP 방법에 따라 분석한 결과는 무엇인가?
abata의 배양 가능한 공생세균 군집구조를 16S rDNA-RFLP 방법에 의해 분석하였다. 공생세균의 배양은 해면추출물 3%를 포함하는 MA 배지를 사용하였다. 증폭된 16S rDNA의 RFLP (restriction fragment length polymorphism) 분석을 위한 제한효소로 HaeIII와 MspI을 이용하였으며, 그 결과 24개의 RFLP type을 구별할 수 있었다. 각 패턴별로 1~5개의 분리균주를 선별하여 부분 염기서열 분석 결과, 알려진 세균 종과 98.4% 이상의 유사도를 나타내었으며 2종의 Spirastrella 해면으로부터 분리된 세균들은 모두 Alphaproteobacteria, Gammaproteobacteria, Firmicutes, Actinobacteria 4개의 강(class)에 포함되었다. Alphaproteobacteria는 S. abata에서 39.3%, S. panis에서 47.6%가 관찰되어 두 해면에서 우점하는 세균 군집이었다. Gammaproteobacteria의 경우 S. abata에서 38.5%로 관찰된 반면 S. panis에서 1.6%의 아주 적은 비율로 관찰되었다. 또한 Bacillus (phylum Firmicutes) 종은 S. abata에서 9.7%를 나타낸 반면, S. panis에서는 44.3%의 분포를 나타내었다. Planococcus maritimus (8.1%, phylum Firmicutes)와 Psychrobacter nivimaris (28.9%, phylum Gammaproteobacteria)는 S. abata에서만 관찰되어 이들은 S. abata에 특이적인 세균 종임을 알 수 있었다. 같은 장소에 서식하는 계통적으로 근연한 두 종의 해면에서 공생세균의 군집 구조는 차이가 큰 것으로 나타났다.
해면에 서식하는 공생 미생물은 어디에 서식하는가?
특히 여과 섭식하는 해면은 세균, 고세균, 시아노박테리아, 녹조류, 홍조류, 규조류 등 많은 미생물을 포함하고 있으며, Demosponges 종의 mesohyl은 매우 다양한 생태적 미소환경(micro-environment)을 제공하여(22), 해면 생체량의 40% 이상에 달하는 세균을 함유하기도 하는 것으로 알려져 있으며, 이러한 해면은 bacteriosponges 혹은 high-microbial abundance sponges (8)라 불리운다. 해면에 서식하는 공생미생물은 해면의 표면, 혹은 해면 세포내, 혹은 mesohyl에 서식하며 일시적인 혹은 영구적인 공생관계를 유지하는 것으로 알려져 있다. 공생하는 미생물은 Pseudomonas denitificans와 같이 여러 종의 해면에서 우점종으로 발견되는 경우(5, 14)도 있으나, 외부의 환경 변화에도 불구하고 숙주 해면과의 공생관계가 영구적인 세균 종이 있다는 보고(6, 24)도 있다.
해면은 어떤 종류의 미생물을 포함하고 있는가?
해양 무척추동물은 세포내 혹은 세포외에 많은 미생물을 포함하는 것으로 알려져 있다(12). 특히 여과 섭식하는 해면은 세균, 고세균, 시아노박테리아, 녹조류, 홍조류, 규조류 등 많은 미생물을 포함하고 있으며, Demosponges 종의 mesohyl은 매우 다양한 생태적 미소환경(micro-environment)을 제공하여(22), 해면 생체량의 40% 이상에 달하는 세균을 함유하기도 하는 것으로 알려져 있으며, 이러한 해면은 bacteriosponges 혹은 high-microbial abundance sponges (8)라 불리운다. 해면에 서식하는 공생미생물은 해면의 표면, 혹은 해면 세포내, 혹은 mesohyl에 서식하며 일시적인 혹은 영구적인 공생관계를 유지하는 것으로 알려져 있다.
참고문헌 (17)
Alam, N., W. Wang, J.G. Hong, C.O. Lee, K.S. Im, and J.H. Jung. 2002. Cytotoxic sphingosine 4-Sulfates from the sponge Spirastrella abata. J. Nat. Prod. 65, 944-945
Chun, J. 1995. Computer-assisted classification and identification of actinomycetes. Ph.D. Thesis, Univ. Newcastle, Newcastle upon Tyne, UK.
Dai, J., Y. Liu, Y.D. Zhou, and D.G. Nagle. 2007. Hypoxia-selective antitumor agents: norsesterterpene peroxides from the marine sponge Diacarnus levii preferentially suppress the growth of tumor cells under hypoxic conditions. J. Nat. Prod. 70, 130-133
Enticknap, J.J., M. Kelly, O. Peraud, and R.T. Hill. 2006. Characterization of a culturable alphaproteobacterial symbiont common to many marine sponges and dvidence for vertical transmission via sponge Larvae. Appl. Environ. Microbiol. 72, 3724-3732
Friedrich, A.B., J. Hacker, I. Fischer, P. Proksch, and U. Hentschel. 2001. Temporal variations of the microbial community associated with the Mediterranean sponge Aplysina aerophoba. FEMS Microbiol. Ecol. 38, 105-113
Hentschel, U., J. Hopke, M. Horn, A.B. Friedrich, M. Wagner, J. Hacker, and B.S. Moore. 2002. Molecular evidence for a uniform microbial community in sponges from different oceans. Appl. Environ. Microbiol. 68, 4431-4440
Kaeberlein, T., K. Lewis, and S.S. Epstein. 2002. Isolating "uncultivable" microorganisms in pure culture in a simulated natural environment. Science 296, 1127-1129
Kennedy, J., P. Baker, C. Piper, P.D. Cotter, M. Walsh, M.J. Mooij, M.B. Bourke, M.C. Rea, P.M. O'Connor, R.P. Ross, C. Hill, F. O'Gara, J.R. Marchesi, and A.D.W. Dobson. 2009. Isolation and analysis of bacteria with antimicrobial activities from the marine sponge Haliclona simulans collected from Irish Waters. Mar. Biotechnol. 11, 384-396
Lafi, F.F., M.J. Garson, and J.A. Fuerst. 2005. Culturable bacterial symbionts isolated from two distinct sponge species (Pseudoceratina clavata and Rhabdastrella globostellata) from the great barrier reef display similar phylogenetic diversity. Microb. Ecol. 50, 213-220
Levina, E.V., A.I. Kalinovsky, P.V. Andriyashenko, P.S. Dmitrenok, D.L. Aminin, and V.A. Stonik. 2005. Phrygiasterol, a cytotoxic cyclopropane-containing polyhydroxysteroid, and related compounds from the pacific starfish Hippasteria phrygiana. J. Nat. Prod. 68, 1541-1544
Li, Z., L. He, and X. Miao. 2008. Cultivable bacterial community from South China Sea sponge as revealed by DGGE fingerprinting and 16S rDNA phylogenetic analysis. Curr. Microbiol. 55, 465-472
Muscholl-Silberhorn, A., V. Thiel, and J.F. Imhoff. 2008. Abundance and bioactivity of cultured sponge-associated bacteria from the Mediterranean Sea. Microb. Ecol. 55, 94-106
Selvin, J. 2009. Exploring the antagonistic producer Streptomyces MSI051: Implications of polyketide synthase gene type II and a ubiquitous defense enzyme phospholipase A2 in the host sponge Dendrilla nigra. Curr. Microbiol. 58, 459-463
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