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문제 정의
- 지금까지 산수유에 관한 연구자료는 가공에 관한 연구와 한방 재료에 관한 연구가 있을 뿐이며 웅용적인 면에서는 아직 미흡한 편이다. 따라서 본 연구에서는 천연 보존료 개발의 일환으로 산수유 열매의 추출물과 분획물을 몇 종의 병원균과 식중독균, 식품과 관련이 있는 10개 균주에 대한 항균 활성 검색과 항균성이 강한 에탄올 추출물의 최소저 해농도, 추출물에 함유된 항균 활성 물질의 열과 pH 안정성을 조사하여 산수유의 항균 활성 물질을 식품 보존료의 이용 가능성 검정을 위한 기초 자료를 제공하고자 하였다.
제안 방법
- 산수유 추출물 중 항균 활성을 나타내는 물질의 열 안정성은 산수유의 에탄올 추출물을 50〜 까지 10°C 간격으로 각각 1시간 동안, 에서 15분 동안 열처리한 후 대조 구와 같이 한천배지 확산법으로 생육 저해 환을 측정하여 비교하였다. 또한 pH 안정성은 산수유의 에탄올 추출물을 염산과 수 산화나트륨으로 pH 3〜U까지 조절하고 상온에서 1시간 방치한 후, 다시 각 균주의 최적 pH로 중화시켜서 열 안정성과 동일한 방법으로 생육 저해 환을 측정하여 비교하였다.
- 칠아세테 이 트로 추출한 항균 활성 물질을 몇 종의 병원균과 식중독균 식품과 관련이 있는 세균, 젖산균 및 효모 등 10개 균주에 대하여 항균 활성 검색을 하였으며, 항균력이 강한 산수유 에탄 올 추출물을 용매 계통분획 하여 각 분 획별 항균 활성을 조사하였다. 또한 에탄올 추출물의 최소저해농도, 추출물에 함유된 항균성 물질의 열 안정성 pH 등을 조사하였다. 산수유 과 육과 씨 추출물의 항균 활성은 에탄올 추출물과 물 추출물이 10 균주 중 세균에 대하여 항균 활성이 강하였으나, 젖산균 및 효모에 대해서는 항균 활성이 나타나지 않았다.
- 산수유 1 kg을 상기 방법으로 에탄올 추출물 256, 0 g을 얻은 후 용매 분획하였다. 즉, 에탄올 추출물을 분획여두에서 핵산 : 메탄올 : 물(10 : 1 : 9 v/v) 1 L씩 3회 추출, 농축하여 핵산 추출 분획물 360 g을 얻었고, 계속해서 같은 방법으로 수 층을 에테르 및 에■칠 아세테이트로 용매 분획한 다음 농축하여 각각 28, 0 g, 84.
- 산수유 추출물 중 항균 활성을 나타내는 물질의 열 안정성은 산수유의 에탄올 추출물을 50〜 까지 10°C 간격으로 각각 1시간 동안, 에서 15분 동안 열처리한 후 대조 구와 같이 한천배지 확산법으로 생육 저해 환을 측정하여 비교하였다. 또한 pH 안정성은 산수유의 에탄올 추출물을 염산과 수 산화나트륨으로 pH 3〜U까지 조절하고 상온에서 1시간 방치한 후, 다시 각 균주의 최적 pH로 중화시켜서 열 안정성과 동일한 방법으로 생육 저해 환을 측정하여 비교하였다.
- 산수유 1 kg을 상기 방법으로 에탄올 추출물 256, 0 g을 얻은 후 용매 분획하였다. 즉, 에탄올 추출물을 분획여두에서 핵산 : 메탄올 : 물(10 : 1 : 9 v/v) 1 L씩 3회 추출, 농축하여 핵산 추출 분획물 360 g을 얻었고, 계속해서 같은 방법으로 수 층을 에테르 및 에■칠 아세테이트로 용매 분획한 다음 농축하여 각각 28, 0 g, 84.0 g을 분획물을 얻었으며, 최종적으로 물 분획물 108, 0 g을 얻어 적당한 농도로 희석하여 사용하였다.
- 다양한 기능성을 갖는 산수유를 대상으로 새로운 식품개발 및 천연 보존료 개발의 일환으로 물, 에탄올, 에. 칠아세테 이 트로 추출한 항균 활성 물질을 몇 종의 병원균과 식중독균 식품과 관련이 있는 세균, 젖산균 및 효모 등 10개 균주에 대하여 항균 활성 검색을 하였으며, 항균력이 강한 산수유 에탄 올 추출물을 용매 계통분획 하여 각 분 획별 항균 활성을 조사하였다. 또한 에탄올 추출물의 최소저해농도, 추출물에 함유된 항균성 물질의 열 안정성 pH 등을 조사하였다.
- 항균성 시험용 평판배지는 각각의 생육 배지로 멸균된 기 층용 배지를 petri dish에 15 mL씩 분주하여 웅고시 키고, 중층용 배지를 각각 5 mL씩 시험관에 분주하여 멸균한 후, 45°C 수욕 상에서 보관하면서 각종 시험 균액 (멸균 식염수로 균 현탁액을 만들어 균 농도를 660 皿에서 흡광도가 0.3이 되게 한 균 현탁액) 0, 1 mL를 무균적으로 첨가하여 잘 혼합한 후 기층용 배지 위에 분주한 뒤 고르게 웅고시켜 이중의 균 접종 평판배지를 만들어 사용하였다. 추출된 항균성 물질의 항균력 검색은 한천배지 확산법(1顼2)으로 측정하였다.
대상 데이터
- 시험에 사용한 균주는 그람양성균 3종, 그람음성균 3종, 젖 산균 2종 및 효모 2종 등 총 10종을 선정하여 사용하였다. 균 생육 배지로 세균은 Nutrient broth와 agar(Difco), 젖산균은 Lactobacillus MRS broth와 agar(Difco), 효모는 YM broth와 agar(Difco)를 각각 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 산수유는 전남 구례군 산동면년도 산)에서 수확한 것을 과육과 씨로 분리하고 -20°C 냉장고에서 냉동 보관하면서 실험에 사용하였다.
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사용 균주 및 시약
시험에 사용한 균주는 그람양성균 3종, 그람음성균 3종, 젖 산균 2종 및 효모 2종 등 총 10종을 선정하여 사용하였다. 균 생육 배지로 세균은 Nutrient broth와 agar(Difco), 젖산균은 Lactobacillus MRS broth와 agar(Difco), 효모는 YM broth와 agar(Difco)를 각각 사용하였다.
이론/모형
- 3이 되게 한 균 현탁액) 0, 1 mL를 무균적으로 첨가하여 잘 혼합한 후 기층용 배지 위에 분주한 뒤 고르게 웅고시켜 이중의 균 접종 평판배지를 만들어 사용하였다. 추출된 항균성 물질의 항균력 검색은 한천배지 확산법(1顼2)으로 측정하였다. 추 줄 물의 최소저해농도 (minimum inhibitory concentration, MIC) 측정은 한천배지 희석법으로 측정하였는데, 추출물의 고형물 함량을 0, 1, 0, 25, 0, 5, 1, 0 및 2.
성능/효과
- 산수유의 과육과 씨 에탄올 추출물의 최소저해농도는 세균의 그람양성균과 그람음성균 모두 0, 25 mg/m止로 큰 차이를 보이지 않았으며, 효모와 젖산균은 2 mg/m止로 세균에 비하여 높은 농도에서 생육이 저해됨을 보여 항균 활성이 비교적 낮게 나타났다. 따라서 산수유의 과육과 씨 에탄올 추출물에 함유된 항균 활성 물질은 세균의 졍우 항균 활성이 강하였으나, 효모와 젖산균의 졍우 항균 활성이 아주 약한 결과를 나타났다.
- 이상의 결과로 산수유 과육과 씨의 용매별 분획물은 과육이 씨보다 훨씬 강한 항균 활성을 나타내었고, 극성 용매인 물 분획물이 비극성인 디에칠에테르에 비해서 강한 항균 활성을 보였으므로, 산수유의 과육과 씨 에탄올 추출물에 함유된 항균성 물질은 극성이 강한 것으로 추정할 수 있다. 또한 균주별로는 그람양성과 그람음성에 둘 다 항균 활성이 나타났으며, 효모와 젖산균에서는 항균 활성이 없었다.
- au reus 균주에서 억제환의 크기가 22 mm로 가장 높게 나타났다. 또한 그람양성균과 그람음성균에서 모두에서 항균 활성이 나타났다. 이상의 결과로 산수유 과육과 씨의 용매별 분획물은 과육이 씨보다 훨씬 강한 항균 활성을 나타내었고, 극성 용매인 물 분획물이 비극성인 디에칠에테르에 비해서 강한 항균 활성을 보였으므로, 산수유의 과육과 씨 에탄올 추출물에 함유된 항균성 물질은 극성이 강한 것으로 추정할 수 있다.
- coli 두 균주에 대한 생육 저 해 환을 측정한 결과에서 1시간, 121°C에서 15분간 열처리한 뒤, 두 균주 모두 생육저해환의 크기가 대조 구와 거의 비슷한 것으로 보아 산수유 과육의 에탄올 추출물 중의 항균 활성 물질은 열에 매우 안정하였다. 또한 산수유 과육의 에탄올 추출물에 함유되 어 있는 항균 활성 물질의 pH 안정성을 조사하기 위하여 추출물을 pH 3〜 U까지 조절한 후 상온에서 1시간 방치한 다음, 다시 각각 균주의 최적 pH로 중화시켜서 동일한 방법으로 생육 저해 환을 측정한 결과 산수유 과육의 에탄올 추출물을 pH 3〜U까지 에서 항균 활성 검색 결과를 보면, 두 균주 모두 생육저해환의 크기가 대조 구와 거의 비슷한 것으로 보아 산수유 과육의 에탄올 추출물에 함유되어 있는 항균 활성 물질은 산, 알칼리 조건에 서도 항균 활성이 지속적으로 유지되는 것을 알 수 있었다.
- 또한 에탄올 추출물의 최소저해농도, 추출물에 함유된 항균성 물질의 열 안정성 pH 등을 조사하였다. 산수유 과 육과 씨 추출물의 항균 활성은 에탄올 추출물과 물 추출물이 10 균주 중 세균에 대하여 항균 활성이 강하였으나, 젖산균 및 효모에 대해서는 항균 활성이 나타나지 않았다. 산수유의 에 탄 올 추출물을 핵산, 디에■칠에테르, 에.
- 칠아세테 이 트와 물층에서 강한 항균 활성을 보였고 균주별로 일반세 균은 항균 활성이 나타났으며, 효모와 젖산균에서는 항균 활성이 나타나지 않았다. 산수유 과육과 씨의 에탄올 추출물의 최소저해농도는 세균이 0, 25 mg/m工이었고, 효모와 젖산균 이 2 었다 산수유의 과육 에탄올 추출물 농도의 영향은 B. sub以is는 0, 25 mg/mL 이하의 농도에서는 균 증식이 증가되었으나 0, 5 mg/mL 농도에서는 억제되었다. E.
- 산수유 과육의 에탄올 추출물에 함유되어 있는 항균 활성 물질의 열 안정성을 조사하기 위하여 추출물을 50〜 까 지 10°C 간격으로 1시간 동안, 에서 15분간 열처리한 후 그람양성균인 B. 源广eus와 그람음성균인 E. coli 두 균주에 대한 생육 저 해 환을 측정한 결과에서 1시간, 121°C에서 15분간 열처리한 뒤, 두 균주 모두 생육저해환의 크기가 대조 구와 거의 비슷한 것으로 보아 산수유 과육의 에탄올 추출물 중의 항균 활성 물질은 열에 매우 안정하였다. 또한 산수유 과육의 에탄올 추출물에 함유되 어 있는 항균 활성 물질의 pH 안정성을 조사하기 위하여 추출물을 pH 3〜 U까지 조절한 후 상온에서 1시간 방치한 다음, 다시 각각 균주의 최적 pH로 중화시켜서 동일한 방법으로 생육 저해 환을 측정한 결과 산수유 과육의 에탄올 추출물을 pH 3〜U까지 에서 항균 활성 검색 결과를 보면, 두 균주 모두 생육저해환의 크기가 대조 구와 거의 비슷한 것으로 보아 산수유 과육의 에탄올 추출물에 함유되어 있는 항균 활성 물질은 산, 알칼리 조건에 서도 항균 활성이 지속적으로 유지되는 것을 알 수 있었다.
- 0 mg/ mL 농도별로 측정한 결과는 Table 3과 같다. 산수유의 과육과 씨 에탄올 추출물의 최소저해농도는 세균의 그람양성균과 그람음성균 모두 0, 25 mg/m止로 큰 차이를 보이지 않았으며, 효모와 젖산균은 2 mg/m止로 세균에 비하여 높은 농도에서 생육이 저해됨을 보여 항균 활성이 비교적 낮게 나타났다. 따라서 산수유의 과육과 씨 에탄올 추출물에 함유된 항균 활성 물질은 세균의 졍우 항균 활성이 강하였으나, 효모와 젖산균의 졍우 항균 활성이 아주 약한 결과를 나타났다.
- 칠아세테이트, 디에칠에테르 추출물의 항균 활성 검색 결과는 Table 1과 같다. 산수유의 에탄올 추출물과 물 추출물에서는 사용된 총 10 균주 중 젖산균과 효모를 제외한 대부분의 세균들에 대해 산수유 과육, 씨 모두에서 항균 활성을 보였으나 과육에서 더 강한 항균 활성을 보였으며, 전반적으로 그람양성균이 그람 음성균보다 감수성이 더 크게 나타났다. 그러나 극성이 낮은 용매 추출물일수록 항균 활성은 약해지므로 산수유의 주 항균성 물질은 극성이 낮은 디에■칠에테르보다는 에탄올이나 물에 잘 녹는 물질로 추정된다 이와 같은 결과는 Lee와 Shin CL7)의 식품 부패 미생물을 억제하는 천연 항균성 물질의 검색, Hong 등 CL8)의 유백피의 연구, Park 등(19)의 한약재 추출물의 항균효과 검색에서 그람음성균보다 그람양성균에서 항균 활성이 더 크게 나타난다는 결과와도 비슷하게 나타났으며, 산수유 항균성 물질 추출에는 에탄올이 더 적절한 용매로 생각된다.
- c成는 0, 25 mg/mL 이하의 농도에서는 배양 16시간까지 균 증식이 억제되다가 그 이후 서서히 증가되었다. 산수유의 에탄올 추출물에 함유되어 있는 항균 활성 물질은 에서 15분간 가열한 후에도 그 활성이 유지된 것으로 보아 열에 안 정하였으며, pH의 변화에도 항균 활성의 변화가 거의 없는 것으로 나타났다.
- 산수유의 과육과 씨 에탄올 추출물 중에 항균성 물질을 용매계통 분획하여 얻은 핵산, 디에■칠에테르, 에■칠 아세테이트 및 물 분획물의 항균 활성을 disc plate method에 의한 생육 저지 환을 측정하여 각 균주에 대한 억제 효과를 검색한 결과는 Table 2와 같다. 세균의 졍우 그람양성균과 그람음성균 모두 물과 에■칠 아세테이트 분획물에서 생육 억제 효과가 크게 나타났는데, 특히 과육의 에. 칠아세테이트 분획물에서 S.
- 또한 그람양성균과 그람음성균에서 모두에서 항균 활성이 나타났다. 이상의 결과로 산수유 과육과 씨의 용매별 분획물은 과육이 씨보다 훨씬 강한 항균 활성을 나타내었고, 극성 용매인 물 분획물이 비극성인 디에칠에테르에 비해서 강한 항균 활성을 보였으므로, 산수유의 과육과 씨 에탄올 추출물에 함유된 항균성 물질은 극성이 강한 것으로 추정할 수 있다. 또한 균주별로는 그람양성과 그람음성에 둘 다 항균 활성이 나타났으며, 효모와 젖산균에서는 항균 활성이 없었다.
- 칠아세테이트 및 물로 용매 계통 분획하여 얻은 각 분획물의 항균 활성은 에. 칠아세테 이 트와 물층에서 강한 항균 활성을 보였고 균주별로 일반세 균은 항균 활성이 나타났으며, 효모와 젖산균에서는 항균 활성이 나타나지 않았다. 산수유 과육과 씨의 에탄올 추출물의 최소저해농도는 세균이 0, 25 mg/m工이었고, 효모와 젖산균 이 2 었다 산수유의 과육 에탄올 추출물 농도의 영향은 B.
- 세균의 졍우 그람양성균과 그람음성균 모두 물과 에■칠 아세테이트 분획물에서 생육 억제 효과가 크게 나타났는데, 특히 과육의 에. 칠아세테이트 분획물에서 S. au reus 균주에서 억제환의 크기가 22 mm로 가장 높게 나타났다. 또한 그람양성균과 그람음성균에서 모두에서 항균 활성이 나타났다.
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