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문제 정의
- 따라서 본 실험에서는 전남지역 도축장에 출하된 도축으로부터 Salmonella의 감염분포를 조사하고, 분리된 S typhimurium의 항생제 내성유형을 검사함으로써 돼지에서의 Salmonella 전파 위험도를 검사하고 이들에 대한 효과적인 예방 및 치료체계를 확립할 수 있는 기초자료를 마련하고자 하였다. 또한 돼지에서 분리된 야외 분리주에 대해서 장 점막에서의 비특이성 탐식상피세포로의 침투에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 Salmonella의 invA gene의 분포를 확인하고, Salmonella가 식세포에 의하여 탐식된 후 발현되어 세망내피세포에서 Salmonella의 성장과 생존을 증강시키는 것으로 알려진 중요한 병원성 발현유전자인 spdC 의 분포를 검사함으로써 국내 분리주의 위험도 정도를 평가하고자 하였다.
- 따라서 본 실험에서는 전남지역 도축장에 출하된 도축으로부터 Salmonella의 감염분포를 조사하고, 분리된 S typhimurium의 항생제 내성유형을 검사함으로써 돼지에서의 Salmonella 전파 위험도를 검사하고 이들에 대한 효과적인 예방 및 치료체계를 확립할 수 있는 기초자료를 마련하고자 하였다. 또한 돼지에서 분리된 야외 분리주에 대해서 장 점막에서의 비특이성 탐식상피세포로의 침투에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 Salmonella의 invA gene의 분포를 확인하고, Salmonella가 식세포에 의하여 탐식된 후 발현되어 세망내피세포에서 Salmonella의 성장과 생존을 증강시키는 것으로 알려진 중요한 병원성 발현유전자인 spdC 의 분포를 검사함으로써 국내 분리주의 위험도 정도를 평가하고자 하였다.
- 본 실험에서는 돼지에서 분리된 S typhimurium 에 대한 약제 내성 양상 및 주요 내성형인 STDT 104형에 속하는 ampicilUn, chloramphenicol, streptomycin, sulfonamides 및 tetracycline에 대한 동시 내성균주의 존재 유무 및 분포 정도를 확인하고자 S typhi- munZm에 대한 항생제 내성검사를 실시하였다. 분리주 모두 22종의 항생제 중 7종이상의 항균제에 대하여 내성을 나타내는 다제약제내 성균으로 확인되었다.
- 본 실험에서는 전남지역 도축 돈으로부터 Salmonella의 감염분포를 조사하고 이들로부터 분리된 Salmonella중 S typhimurium의 항생제 내성유형을 검사하였고, 또한 이들 분리주에서 Salmonella의 대표적인 병원성 발현유전자 인 invA gene과 spvC gene의 분포를 확인함으로서 국내 분리주의 위험도 정도를 평가하고자 하였다.
제안 방법
- PCR증폭 : 야외 분리주와 표준균주로부터 추출된 DNA는 AccuPower™(Bioneer) PCR premix cocktail을 사용하여 10必의 DNA 추출물을 20pmol primer로 DNA Thermal cycler Mod이 2400(Perkin Elmer, Scotia) 에서 다음과 같은 조건으로 PCR 증폭을 실시하였다. 93°C 에서 1분간 predenaturation을 실시한 후 93°C에서 1분간 denaturation, 그리고 48C에서 1분간 annealing, 그리고 720에서 2분간 ex- tension을 30 cycles 적용한 다음, 72 °C 에서 2 분간 last extension을 실시하였다.
- R나ype ACSSu丁의 확인 : 항생제 감수성 검사 결과는 ampicillin, chloramphenicol, stre ptomycin, sulfonamides 및 tetracycline^] 5종 항생제에 대하여 동시다제내성을 나타내는 균주를 R-type 로 판정하고 그 분포를 조사하였다.
- 또한 이태리의 Nastasi 등 39)은 ribotyping으로 S typhimurium 의 감염을 추적하여 사람 감염의 주요 원인은 돼지와 소에 의한 감염이라고 보고하였고, 돼지에 분포된 ribotype이 사람 유래와 유사한 분포를 나타낸다고 해 돼지에서 S typhimurium 에 의한 불현성 감염과 이로 인한 식육 오염이 공중보건학적으로 매우 중요함을 알 수 있다. Salmonella의 장상피세포 침입에 관여하는 주요 병원성 유전자로 알려진 invA gene과 세망내피계 세포 내에서 Salmonella의 생존과 증식을 가능하게 하는 주요 병원성 유전자인 spvC gene40>에 대한 PCR 검사를 실시하였다. 분리된 S typhimurium 83주 중 한 결과, 73주(88.
- Salmonella의 동정: Salmonella의 혈청형에 대한 동정은 Murray의 방법”에 따라 다음과 같이 실시하였다. Salmon시la 의 심균을 감별 배 지인 MacConkey agar(Difco, USA)에 계대 배 양한 후 lactose 비분해 집락을 골라 triple sugar iron agar(TSI, Difco, USA)에 접종하여 배양성상을 검사하였다. Salmon이la로 동정된 세균은 Salmonella O antisera(Difco, USA)를 이용하여 O antigen 검사를 실시하였고, O antigen이 결정된 균주는 H antigen(Difco, USA)검사를 실시하였다.
- Salmon시la 의 심균을 감별 배 지인 MacConkey agar(Difco, USA)에 계대 배 양한 후 lactose 비분해 집락을 골라 triple sugar iron agar(TSI, Difco, USA)에 접종하여 배양성상을 검사하였다. Salmon이la로 동정된 세균은 Salmonella O antisera(Difco, USA)를 이용하여 O antigen 검사를 실시하였고, O antigen이 결정된 균주는 H antigen(Difco, USA)검사를 실시하였다. 검사 대상 집락은 10 畝의 veal infusion broth(Difco, USA)에 접종한 후 37°C에서 24시간 증균하였다.
- Salmon이la로 동정된 세균은 Salmonella O antisera(Difco, USA)를 이용하여 O antigen 검사를 실시하였고, O antigen이 결정된 균주는 H antigen(Difco, USA)검사를 실시하였다. 검사 대상 집락은 10 畝의 veal infusion broth(Difco, USA)에 접종한 후 37°C에서 24시간 증균하였다. 세균증균 액은 의 0.
- 세균액이 건조된 후 BBL사 의 항생제 감수성 디스크(Sensidisc, BBL Co, USA)를 부착시키고 37°C에서 배양하였다. 배양결과는 항생제 디스크 주위의 억제영역의 직경을 측정하여 제조사의 판독기준에 따라 감수성 (senceptibility), 중등도(intermediate), 내성 (resistant)의 세 단계로 평가하였다.
- 항생제 감수성 검사 : 분리된 S typhimurium 에 대한 항생제 감수성 검사는 Bauer 등의 방법30)에 따라 디스크 확산법으로 다음과 같이 실시하였다. 분리균주를 brain heart infusion broth(BHI, Difco, USA)에 접종하여 배양한 후 0.85% 멸균saline으로 MacFarland scale No 0.5로 조정한 후 멸균면봉을 이용하여 세균희 석액을 Mueller Hinton agar(Difco, USA)에 도 말 접종하였다.세균액이 건조된 후 BBL사 의 항생제 감수성 디스크(Sensidisc, BBL Co, USA)를 부착시키고 37°C에서 배양하였다.
- 검사 대상 집락은 10 畝의 veal infusion broth(Difco, USA)에 접종한 후 37°C에서 24시간 증균하였다. 세균증균 액은 의 0.6% formalin-saline과 동량혼합 하여 실온에서 1시간 동안 균을 고정하고 H antisera와 고정균액 500成를 혼합하여 50°C 항온수조에서 1시간 반응시킨 후 웅집 유무를 관찰하는 방법으로 H antigen을 확인하였다
- 전기영동 : 증폭된 PCR products는 lOObp ladder(Biobasics, Canada) 와 함께 1.5% agarose g시에서 100V로 30분간 전기 영동 한 후 ethidium bromide로 염색하여 SL-20 DNA Image Visualizer(Seolin Scientific Co, USA) 를 사용하여 특이 band를 확인하였다.
대상 데이터
- 검사 대상 항생제 : 양돈농가에서 예방 및 성장촉진목적으로 사용되는 사료첨가 제 용 항생제와 질병 발생시 치료를 주목적으로 사용되는 주사 및 음수용 치료용 항생제를 바탕으로 amoxacillin/clavulanic acid, amikacin, am picillin, bacitracin, ceptiofur, cephalothin, ciprofloxacin, chloramphenicol, enrofloxacin, erythromycin, gentamicin, lincomycin, lincomycin/spectinomycin, neomycin, nor floxacin, ploymyxin B, penicillin, strepto mycin, sulfamethoxasol/trimethoprim, tetra cycline, tiamulin, tylosin 등 22종의 항생제를 선택하였다.
- 전남지역의 32개 농장에서 각 농장별로 20두씩 640두를 대상으로 검사를 실시하였다. 도축장으로 출하된 돼지도체의 맹장으로부터 내용물을 무균적으로 채취한 후 곧바로 실험실로 운반하여 Salmonella의 분리에 사용하였다.
- 전남지역의 32개 농장에서 각 농장별로 20두씩 640두를 대상으로 검사를 실시하였다. 도축장으로 출하된 돼지도체의 맹장으로부터 내용물을 무균적으로 채취한 후 곧바로 실험실로 운반하여 Salmonella의 분리에 사용하였다.
이론/모형
- DNA추출 : Salmonella의 독력 보유 유전자에 대한 PCR검사를 위한 whole cell DNA추출은 Cohen 등의 방법 2®에 따라 다음과 같이 실시하였다. S typhimurium 야외분리주 83주와 S typhimurium ATCC 13311 표준균주를 BHI broth에 접종하여 37°C, 24시간 배양한 후 배양균액을 회수하여 12, 000 rpm의 속도로 30분간 원심분리하였다.
- PCR primer: S typhimurium의 invA gene과 spvC gene 특이적인 oligonucleotide primer는 Sawmy 등의 방법에 따라 다음과 같이 만들어 사용하였다(Table 1).
- Salmonella typhimurium 의 inuA gene 과 spvC gene 에 대한 PCR검사는 Abouzeed 등의 방법4)에 따라 다음과 같이 실시하였으며 invA gene과 spvC gene을 모두 포함하고 있는 S typhimurium ATCC 13311을 비교균주로 사용하였다.
- Salmonella의 동정: Salmonella의 혈청형에 대한 동정은 Murray의 방법”에 따라 다음과 같이 실시하였다. Salmon시la 의 심균을 감별 배 지인 MacConkey agar(Difco, USA)에 계대 배 양한 후 lactose 비분해 집락을 골라 triple sugar iron agar(TSI, Difco, USA)에 접종하여 배양성상을 검사하였다.
- Salmonella의 분리 : 채취한 가검물로부터 Salmonella의 분리는 Stone 등의 방법26,27)에 따라 다음과 같이 실시하였다. 채취한 맹장 내용물을 10배 용량의 buffered peptone water (BPW, Difco, USA)에 넣어 37°C에서 24시간 증균 배양하였다.
- 항생제 감수성 검사 : 분리된 S typhimurium 에 대한 항생제 감수성 검사는 Bauer 등의 방법30)에 따라 디스크 확산법으로 다음과 같이 실시하였다. 분리균주를 brain heart infusion broth(BHI, Difco, USA)에 접종하여 배양한 후 0.
성능/효과
- 또한 S typhimurium 분리주의 invA 와 spvC 유전자에 대한 PCR 검사 결과, 83주 중 73주(88%)에서 inuA gene의 존재가 확인되었으며 24주에서 spvC gene이 확인되었다. 15개 분리주에서 invA 와 spuC를 모두 보유하고 있었으며, invA 와 squC모두에 대하여 음성을 나타내는 균주도 1주(1.2%) 확인되었다.
- 22종의 항생제에 대하여 실시한 항생제 내성검사 결과 ampicillin에 대하여 내성을 나타내는 균주가 48주(57.8%), chloramphenicol에 대하여 내성을 나타내는 균주가 55주(66.3%), sulfonamides에 대하여 내성을 나타내는 균주가 42주(50.6%)로 확인되었으며, 분리주 전체가 streptomycin과 tetracycline에 대하여 내성 을 나타내었다. 또한 이들 내성 균주중 ampicillin, chloramphenicol, streptomycin, sulfonamide 및 tetracycline등의 5종의 항생제에 대하여 동시에 내성을 나타내는 R-type ACSSiiT 균주는 20주(24.
- 도축 돈의 맹장 내용물을 대상으로 Salmonella 의 감염분포 조사 결과는 Table 2와 같다. 32개 농장 640두의 돼지로부터 137주(21.4%)의 Salmonella가 분리되었으며, 이들 분리주의 혈청형 분포를 조사한 결과 S typhimurium 83주(60.6%), S agona가 10주(7.3%), S schwarzen- grund7\ 4주(2.9%), S derby가 4주(2.9%), S ayinde가 1주(0.7%) 분리되었으며 35주(25.5%)는 형별이 불가능하였다.
- 본 실험에서 분리된 83주의 8 typhimurium 에 대하여 실시한 항생제 감수성 검사 결과는 Table 3과 같다. 83분리주 모두 22종의 항생제 중 7종이상의 항균제에 대하여 내성을 나타내는 다제내성균으로 확인되었다. 83주 중 63주(76%)는 10개 이상의 항생제에 대하여 내성을 보였고 이중 한균주는 20개 이상의 항생제에 대하여 내성을 나타내었다.
- 83분리주 모두 22종의 항생제 중 7종이상의 항균제에 대하여 내성을 나타내는 다제내성균으로 확인되었다. 83주 중 63주(76%)는 10개 이상의 항생제에 대하여 내성을 보였고 이중 한균주는 20개 이상의 항생제에 대하여 내성을 나타내었다. 항생제별 유형을 조사한 결과 amoxacillin/clavulanic acid, streptomycin, norfloxacin, ploymyxin B, tetracycline, tiamulin, ceftiofur 등에는 전균주가 내성을 나타내었으며, amikacin에는 68주(82%), tylosin에는 65주(78%)가 내성을 보였다.
- 주요 병원성 유전자인 spvC gene에 대한 PCR검사를 실시한 결과는 Table 4와 같았다. S typhimurium ATCC 13311균주와 함께 실시한 83개 야외 분리주에 대한 imA gene과 spvC gene에 대한 PCR 검사 결과 83주 중 73주(88%)에서 imA gene에 특이적인 primer에 의하여 521bp의 증폭산물이 확인되었으며 (Fig 1), 24주(28.9%)에서 spvC gene에 특이적인 primer 에 의하여 669bp의 증폭산물이 확인되었다(Fig 2). 또한 15개 분리주는 invA gene과 spvC gene을 모두 보유하고 있었으며, invA gene과 spvC gene 모두에 대하여 음성을 나타내는 균주도 1주(L2%) 이다.
- 5%)는 미동정으로 분류되었다. Salmonella혈청형 중 S typhimurium 의 22종 항생제에 대한 항생제 감수성 검사 결 과 83주 모두가 7종이상의 항생제에 대하여 내성을 나타내는 다제내성균주로 확인되었으며 이 중 20주(241%) 는 ampicillin, chlor- phenicol, streptomycin, sulfonamide, tetra- cycline의 5종 항생제에 대하여 내성을 나타내는 R-type ACSSuT 균주로 확인되었다. 또한 S typhimurium 분리주의 invA 와 spvC 유전자에 대한 PCR 검사 결과, 83주 중 73주(88%)에서 inuA gene의 존재가 확인되었으며 24주에서 spvC gene이 확인되었다.
- 9% 분리율보다 월등히 높았다. 그러나 최 등의 검사 대상이 배설물, 이유자돈, 웅돈, 그리고 토양이나 분변, 야생설치류 등을 포함하고 있어, 상대적으로 낮은 분리율로 나타났으며, 본 실험과 동일한 대상인도축돈의 직장 내용물에서의 분리율은 13.6%로 본 실험의 결과보다는 낮았으나 전체적인 분리율에 비교해서 상당히 높음을 알 수 있었다.
- 이러한 각국의 항생제 내성 증가율은 심각한 공중보건학적 문제점을 제시하고 있다. 그리고 본 연구에서 확인된 7종이상의 항균제에 대한다제약제내성 유형은 국내에서도 무분별한 항생제의 오. 남용이 이루어지고 있다는 것을 추측할 수 있었으며 추후 전국적인 조사연구를 통한 국내의 다제약제 내성에 대한 조사가 필요하다고 생각된다.
- 9%)에서 spvC gene에 특이적인 primer 에 의하여 669bp의 증폭산물이 확인되었다(Fig 2). 또한 15개 분리주는 invA gene과 spvC gene을 모두 보유하고 있었으며, invA gene과 spvC gene 모두에 대하여 음성을 나타내는 균주도 1주(L2%) 이다.
- 9%)에서 SQDCgene의 존재가 확인되었다. 또한 15개 분리주는 invA와 spvC gene을 모두 보유하고 있었으며, 派4와 spvC 모두에 대하여 음성을 나타내는 균주도 1주 (1.2%에서 확인되었다. 지금까지 국내 분리주에 대한 诅以와 spvC gene에 대한 PCR 검사는 실시되지 않아 정확한 분포를 비교할 수는 없으나, 캐나다에서 Abouzeed 등 少의 보고에서 사람과 소에서 분리된 S typhimurium 분리주 전체가 spuC gene을 보유하고 있었던 것과 비교한다면 전남지역 돼지로부터 분리된 S typhimurium에 대하여 실시한 본 실험의 결과 spvC gene의 보유율이 상대적으로 낮은 것을 알 수 있었다.
- Salmonella혈청형 중 S typhimurium 의 22종 항생제에 대한 항생제 감수성 검사 결 과 83주 모두가 7종이상의 항생제에 대하여 내성을 나타내는 다제내성균주로 확인되었으며 이 중 20주(241%) 는 ampicillin, chlor- phenicol, streptomycin, sulfonamide, tetra- cycline의 5종 항생제에 대하여 내성을 나타내는 R-type ACSSuT 균주로 확인되었다. 또한 S typhimurium 분리주의 invA 와 spvC 유전자에 대한 PCR 검사 결과, 83주 중 73주(88%)에서 inuA gene의 존재가 확인되었으며 24주에서 spvC gene이 확인되었다. 15개 분리주에서 invA 와 spuC를 모두 보유하고 있었으며, invA 와 squC모두에 대하여 음성을 나타내는 균주도 1주(1.
- Ciprofloxacin, chloramphencicol, ampicillin 및 sulfonamides 각각 56주(67%), 55주(66%), 48주(58%), 42주(51%)에서 내성을 나타내었다. 또한 ampicillin, chloramphenicol, streptomycin, sulfonamides 및 tetracycline등 의 5종의 항생제에 대하여 동시에 내성을 나타내는 R-type ACSSuT 균주도 20주(24.1%)로 확인되었다. 과거에는 국내에서 분리된 Sal monella 중내성균은 극히 드물게 보고되었으나, 1984년 이후 ampicillin, chloramphenicol 및 tetracycline에 대한 내성균주들이 증가하기 시작하였고, 현재에는 대부분의 Salmonella 분리주가 1종 이상의 항생제에 대하여 내성을 갖는 것으로 보고되고 있다37).
- 6%)로 확인되었으며, 분리주 전체가 streptomycin과 tetracycline에 대하여 내성 을 나타내었다. 또한 이들 내성 균주중 ampicillin, chloramphenicol, streptomycin, sulfonamide 및 tetracycline등의 5종의 항생제에 대하여 동시에 내성을 나타내는 R-type ACSSiiT 균주는 20주(24.1%)로 나타났다 (Table 3).
- 본 조사에서 분리된 Salmonella 혈청형의 분리율은 21.4%로서 1986년 최 등36)이 대구, 경북, 경남 및 충남의 7개 양돈장과 대구의 도축장으로부터 실시한 Salmonella의 분포검사 결과의 2.9% 분리율보다 월등히 높았다. 그러나 최 등의 검사 대상이 배설물, 이유자돈, 웅돈, 그리고 토양이나 분변, 야생설치류 등을 포함하고 있어, 상대적으로 낮은 분리율로 나타났으며, 본 실험과 동일한 대상인도축돈의 직장 내용물에서의 분리율은 13.
- Salmonella의 장상피세포 침입에 관여하는 주요 병원성 유전자로 알려진 invA gene과 세망내피계 세포 내에서 Salmonella의 생존과 증식을 가능하게 하는 주요 병원성 유전자인 spvC gene40>에 대한 PCR 검사를 실시하였다. 분리된 S typhimurium 83주 중 한 결과, 73주(88.0%)에서 invA gene의 존재가 확인되었으며, 24주(28.9%)에서 SQDCgene의 존재가 확인되었다. 또한 15개 분리주는 invA와 spvC gene을 모두 보유하고 있었으며, 派4와 spvC 모두에 대하여 음성을 나타내는 균주도 1주 (1.
- 본 실험에서는 돼지에서 분리된 S typhimurium 에 대한 약제 내성 양상 및 주요 내성형인 STDT 104형에 속하는 ampicilUn, chloramphenicol, streptomycin, sulfonamides 및 tetracycline에 대한 동시 내성균주의 존재 유무 및 분포 정도를 확인하고자 S typhi- munZm에 대한 항생제 내성검사를 실시하였다. 분리주 모두 22종의 항생제 중 7종이상의 항균제에 대하여 내성을 나타내는 다제약제내 성균으로 확인되었다. 분리주 83주 중 63주(76%)는 10개 이상의 항생제에 대하여 다제내성을 나타내었으며 이 중 한 개 균주는 20개 이상의 항생제에 대하여 내성을 나타내었다.
- 2%에서 확인되었다. 지금까지 국내 분리주에 대한 诅以와 spvC gene에 대한 PCR 검사는 실시되지 않아 정확한 분포를 비교할 수는 없으나, 캐나다에서 Abouzeed 등 少의 보고에서 사람과 소에서 분리된 S typhimurium 분리주 전체가 spuC gene을 보유하고 있었던 것과 비교한다면 전남지역 돼지로부터 분리된 S typhimurium에 대하여 실시한 본 실험의 결과 spvC gene의 보유율이 상대적으로 낮은 것을 알 수 있었다. 그러나 spvC gene은 사람의 병원성 유전인자로 그 중요성이 높게 평가되고 있는 점을 외국의 경우와 비교해 국내 분리주에 대한 폭넓은 조사연구가 필요한 실정이다.
- 분리주 83주 중 63주(76%)는 10개 이상의 항생제에 대하여 다제내성을 나타내었으며 이 중 한 개 균주는 20개 이상의 항생제에 대하여 내성을 나타내었다. 항생제 별로 내성유형을 조사한 결과 amo- xacillin, streptomycin, norfloxacin, polymyxin B, tetracycline, tiamulin 및 ceftiofur는 분리균주 전체에서 내성을 나타내었으며, amikacin은 68주(82%), tylosin은 65주(78%)에서 내성이 확인되었다. Ciprofloxacin, chloramphencicol, ampicillin 및 sulfonamides 각각 56주(67%), 55주(66%), 48주(58%), 42주(51%)에서 내성을 나타내었다.
- 83주 중 63주(76%)는 10개 이상의 항생제에 대하여 내성을 보였고 이중 한균주는 20개 이상의 항생제에 대하여 내성을 나타내었다. 항생제별 유형을 조사한 결과 amoxacillin/clavulanic acid, streptomycin, norfloxacin, ploymyxin B, tetracycline, tiamulin, ceftiofur 등에는 전균주가 내성을 나타내었으며, amikacin에는 68주(82%), tylosin에는 65주(78%)가 내성을 보였다. Ciprofloxacin, chloramphenicol, ampicillin 및 sulfamethoxasol/trEmethoprim에는 각각 56주(67%), 55주(66%), 48주(58%), 42주(51%)에서 내성을 나타내었다.
후속연구
- 그리고 본 연구에서 확인된 7종이상의 항균제에 대한다제약제내성 유형은 국내에서도 무분별한 항생제의 오. 남용이 이루어지고 있다는 것을 추측할 수 있었으며 추후 전국적인 조사연구를 통한 국내의 다제약제 내성에 대한 조사가 필요하다고 생각된다.
- 그러나 spvC gene은 사람의 병원성 유전인자로 그 중요성이 높게 평가되고 있는 점을 외국의 경우와 비교해 국내 분리주에 대한 폭넓은 조사연구가 필요한 실정이다. 본 실험에서 얻어진 결과는 Salmonella 감염증의 예방을 통한 청정돈육생산으로 국가경쟁력을 유도하고, 오염된 식품을 통하여 식중독을 일으키는 요인을 효과적으로 제거함으로써 식육의 안전성을 확보할 수 있는 기초자료를 제공할 수 있었다.
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