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문제 정의
- 본 논문은 해조의 고부가가치적 이용을 위해 해조로부터 해조 다당과 올리 고당을 다량으로 함유한 해조 음료 소재 와이를 소재로 기능성 해조 음료를 제조하여 이를 고지혈증 쥐에 투여하여 혈액의 지질 산화에 대한 영향과 혈액 및 혈장응고에 미치는 영향을 시험하였고, 아울러 쥐와 토끼의 소장운동 및 회장에 미치는 영향에 대해 기술하고자 한다.
제안 방법
- 20시간 절식시킨 체중20~25g의 수컷 생쥐(mouse) 10마리를 한 군으로 하여 해조 음료를 경구투여하고 1시간후에 charcoal meal(탄밀 50%, arabia 고무 현탁액)을 0.2 mL/ mouse로 하여 경 구투여 한 다음 30분 후 치 사시 켜 개복하고서 유문부에서 맹장직 전까지 적 출한 후 charcoal meal의 이동 거리 (cm)를 측정하고 아래와 같은 식 에 의해 소장 운동 정도를 비교하였다.
- Quick과 Surprenant 등의 방법 (12, 13)에 준하여 플라스틱 시 험 관을 37C 수조상에 담가두고 plasma 100 J1L, TF stock 을 saline 용액으로 희석한 것 100 uL(saline만 100 UL 넣은 것을 blank로 함)를 가하고 25 mM CaCl2 100 를 넣고 섞은 후 시험 관을 수욕상에서 꺼 내 가만히 기울여보고 다시 담그고 하면서 CaC12를 첨가한 후부터 응고할 때까지의 시간을 채었으며 모두 2회 반복 실시하였다. Salir을 넣지 않고 TF stock만을 넣었을 때의 혈장 응고시간을 100% TF activity 로 정하고 TF stock을 넣지 않고 saline만을 넣은 혈장의 응고 신간을 0%로 하여 농도를 log scale로 x축에, activity %를 y축에 표시하여 standard curved 그렸으며 이 그래프에서 50% TF activity/? 되는 TF의 양을 1 unit로 정하여 tissue factor 활성을 표시하였다.
- 모두 2회 반복 실시하였다. Salir을 넣지 않고 TF stock만을 넣었을 때의 혈장 응고시간을 100% TF activity 로 정하고 TF stock을 넣지 않고 saline만을 넣은 혈장의 응고 신간을 0%로 하여 농도를 log scale로 x축에, activity %를 y축에 표시하여 standard curved 그렸으며 이 그래프에서 50% TF activity/? 되는 TF의 양을 1 unit로 정하여 tissue factor 활성을 표시하였다.
- 1 mM EDTA-2Na] 200L를 넣고 vortex에서 잘 혼합한 다음, 37C water bath에서 40분간 정치 한다. 반응액 에 시 약 C(300 mg of sulfanilic acid/5.0 mg N-1 -naphthyl-ethylenediamine in 500 mL of 16.7% acetic acid) 2.0 m을 넣어 잘 혼합하여 실온에서 20분 동안 정치한다음 550 nm에서 흡광도를 측정하여 표준검 량선에 준하여 혈청 중의 superoxide dismutase 활성을 측정하였다.
- 시료의 투입이 끝난 실험동물에 sodium phenobarbital 200 ㎎/㎏을 복강주사하여 마취 시 킨 후 bleeding time을 측정하였다. 측정 후 이 산화탄소(CO2)로 가볍 게 마취 시 키고 복부대동맥으로부터 혈액을 채취하였고 간장은 0.
- 5% Na-cholic acid를 첨 가 조제한 Table 1과 같은 콜레스테롤 식 이로 6주간 사육하여 고지 혈증을 유도하였다. 실험동물은 고지혈증을 유도하지 않은 1개 그룹과 고지혈증을 유도한 그룹을 실험 시료의 종류에 따라 4개 그룹으로 나누어 총 5개 그룹으로 실험을 행하였다. 실험시료는 A(해조음료), B(해 조음료 소재 ), C(다시 마 추출 음료) 로 10 mL/kg을 경구 투여 하였으며, 대조물질은 cholestyramine resin(CSR, 100 ㎎/㎏, 럭키제약)을 생리식 염수에 현탁하여 고지 혈증 유도 마지 막 2주일간 각각 needle zonde를 사용하여 하루에 한번 씩 경구투여하였다.
- 실험동물은 고지혈증을 유도하지 않은 1개 그룹과 고지혈증을 유도한 그룹을 실험 시료의 종류에 따라 4개 그룹으로 나누어 총 5개 그룹으로 실험을 행하였다. 실험시료는 A(해조음료), B(해 조음료 소재 ), C(다시 마 추출 음료) 로 10 mL/kg을 경구 투여 하였으며, 대조물질은 cholestyramine resin(CSR, 100 ㎎/㎏, 럭키제약)을 생리식 염수에 현탁하여 고지 혈증 유도 마지 막 2주일간 각각 needle zonde를 사용하여 하루에 한번 씩 경구투여하였다.
- 전보(8)에서 보고한 것처럼 다시마 유기산 분해물을 제조한 다음, 이 분해물에 다양한 첨가물을 첨가하여 해조취나 맛을 교정하여 최종 해조 음료를 제조하였다.
- 9% 생리식염수로 관류시켜 조직 내 혈액을 제거하고 간장, 펴, 뇌, 신장, 비장, 심장을 적출하여 생리식염수에 씻은 후 여지로 가볍게 압박하여 남아있는 혈액 및 생리식염수를 제거하였다. 채취한 혈액의 일부는 실온에서 30분간 방치한 후 3000 rpm에서 10분간 원심분리하여 혈청을 분리하고 지질함량의 측정, lipid peroxide, hydroxy radical 함량 및 superoxide dismutase 활성의 측정 에 사용하였고 나머지는 3.13% sodium citrate 용액이 혈액의 1/10이 되도록 하여 2500rpm에서 10분간 원심분리한 후 혈장(citrated plasma)을 분리하여 plasma clotting time, tissue factor acivity의 측정에 사용하였다. 뇌와 폐 조직은 1 g당 4배량의 0.
- ㎎/㎏을 복강주사하여 마취 시 킨 후 bleeding time을 측정하였다. 측정 후 이 산화탄소(CO2)로 가볍 게 마취 시 키고 복부대동맥으로부터 혈액을 채취하였고 간장은 0.9% 생리식염수로 관류시켜 조직 내 혈액을 제거하고 간장, 펴, 뇌, 신장, 비장, 심장을 적출하여 생리식염수에 씻은 후 여지로 가볍게 압박하여 남아있는 혈액 및 생리식염수를 제거하였다. 채취한 혈액의 일부는 실온에서 30분간 방치한 후 3000 rpm에서 10분간 원심분리하여 혈청을 분리하고 지질함량의 측정, lipid peroxide, hydroxy radical 함량 및 superoxide dismutase 활성의 측정 에 사용하였고 나머지는 3.
- 플라스틱 시험관을 37℃의 수조에 담그고 혈장 100 UL, saline(0.15 M NaCl) 100 uL, 25 mM CaCh 100 11L를 가하고 섞은 후 가만히 흔들어 주면서 CaC12를 가한 후부터 혈장이 응고하기까지의 시간을 측정하였다.
- 해조 음료의 제조는 원료 다시마로부터 0.5% 구연산 용액을 이용하여 120℃에서 60분 이상 추출하여 얻어진 추출액을 음료 소재로 하였으며, 이 음료 소재에 일정 비율의 음료 첨 가물을 첨가하여 해조 음료를 제조하였다(8). 다시 마 추줄물 제품은 시판되는 제품을 실험에 이용하였다.
대상 데이터
- 5% 구연산 용액을 이용하여 120℃에서 60분 이상 추출하여 얻어진 추출액을 음료 소재로 하였으며, 이 음료 소재에 일정 비율의 음료 첨 가물을 첨가하여 해조 음료를 제조하였다(8). 다시 마 추줄물 제품은 시판되는 제품을 실험에 이용하였다.
- 다시 마는 시판되는 건조 다시마를 수협 에서 직접 구입하여 냉수에 수세하여 건조한 다음, 수도수로 5분 이 내로 간단하게 재수세 하여 열풍 건조(45±2℃, Jeio Tech Co., Korea) 하여 수분 함량이 10% 정도로 한 것을 분쇄하여(60~80mesh) 해조 음료 제조용 원료로 이용하였다. 원료 다시마로부터 음료 소재 추출에 이용한 구연산과 음료 제조시 첨가한 벌꿀, 포도당, 비 타민 C, 황산 콘드로이 틴, 당귀추출액, 사과 과즙농축액은 식품 첨가물용으로 시판되는 것을 구입하여 사용하였다.
- 실험 동물은 대 한실험 동물센터 로부터 분양받아 동물 사육실에서 일정한 조건(온도 : 22±1℃, 습도 : 55±3%, 명암 : 12 시 간 light/dark cycle)으로 1주 동안 고형 사료로 적 응시 킨 체중 200± 10 g의 Sprague-Dawley계 수컷 흰쥐 및 ICR계 생쥐(20±2 g)를 사용하였다. 식이성 고지혈증 model의 유도는 1%의 cholesterol과 0.
- , Korea) 하여 수분 함량이 10% 정도로 한 것을 분쇄하여(60~80mesh) 해조 음료 제조용 원료로 이용하였다. 원료 다시마로부터 음료 소재 추출에 이용한 구연산과 음료 제조시 첨가한 벌꿀, 포도당, 비 타민 C, 황산 콘드로이 틴, 당귀추출액, 사과 과즙농축액은 식품 첨가물용으로 시판되는 것을 구입하여 사용하였다.
데이터처리
- 실험 결과는 평균치 표준편차로표시하였고각군의 유의성 검정은 ANOVA로 검증한 후 실험군간의 통계적 유의성 검증은 Duncan's multiple range test를 시행하였다.
이론/모형
- Han 등의 방법(14)에 의하여 마취된 실험동물을 꼬리 끝에서 0.3 cm 자른 후 곧 37.5C saline 용액의 꼬리 를 5 cm 담그고 지혈될 때까지의 시간을 측정하였다.
- Hydroxy radical의 측정 은 Kobatake 등의 방법 (10)에 따라 혈 청 34.8에 0.54 M NaCl, 0.1 M potassium phosphate buffer(pH 7.4), 10 mM NaN$ 7 mM deoxyribose, 5 mM ferrous ammonium sulfate 및 증류수로서 333.3가 되도록 첨가하여 vortex에서 잘 혼합하여 37C에서 15분간 정치 한다. 혈청 67 를 취하고 여기에 8.
- 단백질 함량은 Lowry 등의 방법 (15)에 준하여 bovine serum albumin(Sigma, Fr.V)을 표준품으로 하여 측정하였다.
- 혈중 superoxide dismutase(SOD) 활성의 측정은 Oyanagui의 방법(11)에 따라 정량하였다. 혈청을 potassium phosphate buffer로써 100배 희 석 하여 그 중의 100를 시험 관에 넣고 여 기 에 증류수 500L, 시약 A(3 mM hydroxyamine/3 mM hypoxanthine) 200 11L 및 시 으 B[7.
- 혈청중 lipid peroxide의 함량은 Yagi의 방법(9)에 따라 혈청 에 1/12 N H2SO4 10% phosphotungstic acid를 가하여 25C에서 5분간 preincubation한 후 원심분리 하여 침전 물인 혈청 단백질만 취 해서 다시 1/12 N H2SO4와 10% phosphotungstic acid를 가하여 원심분리한 후 침전물만을 취하여증류수 1 mL와 0.67% thiobarbituric acid와 50% acetic acid 를 가하여 95℃에서 50분간 반응시켜 실온에서 냉각 후 n-BuOH을 5 mL 첨가하여 10분간 원심분리하여 생성된 홍색의 n-BuOH 층을 취하여 형광스펙트로미터를 사용하여(Ex: 515 nm, Em: 553 nm) 흡광도를 측정하여 표준곡선에서 그 함량을 혈청 1 mL 당 malondialdehyde nm로 표시하였다.
성능/효과
- 4에 나타내었다. 고지 혈증 유도군이 105.7초로 정상군의 234.5초에 비해 44% 정도 감소하였던 것이 해조 음료 식이로 정상군의 75~80% 정도까지 plasma clotting time을 회복시키는 효과가 있는 것으로 확인되었다. 한편, tissue factor (thromboplastin)의 활성 에 미치는 해조 올리고당 음료의 영향을 살펴본 결과(Table 5), 정상 식이군의 뇌에서의 tissue factor의 활성이 3.
- 과산화 지질 함량은 고지혈증 유발 식이를 급여한 실험군이 42.9 nmole/mL로 정상 식이 실험군의 23.3 nmole/mL 보다 2배 가량 증가하는 것으로 확인되었으며, 혈중의 hydroxy radical의 함량도 2배 이상 증가하는 것으로 나타났다. 한편, 해조 음료를 투여한 실험군의 경우, 정상 식이군에는 미치지 못했으나 과산화 지질의 함량과 hydroxy radical의 함량을 낮추는 효과가 있다는 것을 확인하였고, 다시 마 추출음료도 비슷한 경향을 나타내었다.
- 해조 올리고당 음료와 다시마 추출 음료를 식이한 결과고지 혈증 유도군에 비해 약 30% 정도 감소하였다. 또한 폐의 tissue factor 활성은 고지 혈증 유도군이 20.4 unit/mL이 었고, 정 산군의 활성 8.56 unit/mL 의 2.3배 에 달하였으나 해조 올리고당 음료를 식이한 결과 25% 정도의 tissue factor를 저 하시키는 것으로 나타났다.
- 일반적으로 lipid peroxide의 생성은 병태생리 현상이나 조직의 손상 정도를 나타내는 지표로 생체막 구성 성분인 인지질의 불포화 지방산은 활성 산소종과 같은 free radical에 의해 과산화 반응이 시작되어 연쇄적으로 진행되며(16, 17), 지질의 과산화 반응은 세포막의 투과성을 항진시킬 뿐만 아니라 전반적인 세포독성 을 초래 하여 노화 현상이 나 이에 따른 여러가지 질환의 병리 현상을 초래하는 것으로 알려져 있으며 해독 기구의 작용으로 무독화된다고 한다(18, 19). 본 실험에서 식이성 고지혈증을 유발시킨 후 해조 올리고당 함유 음료를 처리하고서 흰쥐의 혈중 hydroxy radical의 생성과 superoxide dis-mutase(SOD)의 활성을 측정하였던 바 고지혈증유도로 증가되 었던 hydroxy radical이 해조 음료 및 다시 마 추출 음료의 투여로 감소되었으며, 생 체내 해독 체계중의 하나인 SOD 의 활성은 오히려 증가되었다. 이러한 결과는 해조 음료 및다시 마 추출 음료가 혈중의 지질 과산화를 억 제한다는 것을 시사하고 있으며, 아울러 혈중 지질함량 및 콜레스테롤 함량을 감소시키므로 혈관계 질환의 예방에 효과가 있다는 것을 나타내고 있다.
- 나타내었다. 식이성 고지혈증 쥐의 bleeding timee 115.4초로 정상군의 267.2초에 비해 약 44% 감소되 었으나, 식 이성 고지 혈증 쥐 에 해조 음료를 투여한 결과 bleeding time이 115.4초에서 236.7 초로 정상 식 이군에 근접한 결과를 나타내었으며, 다시 마 추출 음료도 200.7초로 bleeding time이 연장되는 것이 확인되었다. 이러한 결과는 해조 올리고당 음료나 다시마 추출 음료가 혈중의 혈액 응고를 방지할 수 있다는 것을 시사하는 결과로 판단된다.
- 한편, 해조 음료를 투여한 실험군의 경우, 정상 식이군에는 미치지 못했으나 과산화 지질의 함량과 hydroxy radical의 함량을 낮추는 효과가 있다는 것을 확인하였고, 다시 마 추출음료도 비슷한 경향을 나타내었다. 아울러 superoxide dis-mutase(SOD) 활성 에 미치는 영향에서는 고지혈증 유도 실험군의 경우는 1.99 unit/mg protein로 혈중 SOD의 활성 이정 상 실험 군 3.09 unit/mg protein에 비해 약 34% 억 제 되 었으며, 반면 해조 음료 및 다시마 추출 음료의 투여로 정상 실험군에는 미치지 못하지만 2.56 unit/mg protein로 증가하는 것으로 나타났다. 한편, 지 질 과산화 반응은 생 리 조건이 정 상인 상태 에서는 방어 체 계의 조절에 의하여 free radical의 생성과 억제의 균형이 유지되어 지질과산화 반응으로 기인된 손상은 일어나지 않지만, 세포 내 산화적 자극이 증가하여 free radical의 생 성 증가나 방어 체 계 능력 의 감소가 일 어 났을 때는 생 체 에 심 각한 독성을 나타내 게 된다.
- 본 실험에서 식이성 고지혈증을 유발시킨 후 해조 올리고당 함유 음료를 처리하고서 흰쥐의 혈중 hydroxy radical의 생성과 superoxide dis-mutase(SOD)의 활성을 측정하였던 바 고지혈증유도로 증가되 었던 hydroxy radical이 해조 음료 및 다시 마 추출 음료의 투여로 감소되었으며, 생 체내 해독 체계중의 하나인 SOD 의 활성은 오히려 증가되었다. 이러한 결과는 해조 음료 및다시 마 추출 음료가 혈중의 지질 과산화를 억 제한다는 것을 시사하고 있으며, 아울러 혈중 지질함량 및 콜레스테롤 함량을 감소시키므로 혈관계 질환의 예방에 효과가 있다는 것을 나타내고 있다.
- 정상식 이 군에서 는 charcoal meal의 이동 거리 가 63.4%이 던 것 이해조 음료 투여 로 78.2%의 이동거리 를 나타내 어 비 율로 보면 24% 정도 더 이동한 것으로 확인되었으며, 다시 마 추출 음료의 경우 이동거 리가 86.4%로 정 상 식 이군에 비해 36% 정도 더 이동한 것으로 나타났다. 이러한 결과는 해조 음료가 소장내의 음식물의 이동을 촉진시켜 배변 효과를 높일 수 있는 가능성이 있다는 것을 나타내는 결과라고 생각된다.
- 5초에 비해 44% 정도 감소하였던 것이 해조 음료 식이로 정상군의 75~80% 정도까지 plasma clotting time을 회복시키는 효과가 있는 것으로 확인되었다. 한편, tissue factor (thromboplastin)의 활성 에 미치는 해조 올리고당 음료의 영향을 살펴본 결과(Table 5), 정상 식이군의 뇌에서의 tissue factor의 활성이 3.12unit/mL인데 비해 식이성 고지혈증 유도 군의 활성 은 6.78unit/m로 정 상군에 비해 1.9 증가하였다. 해조 올리고당 음료와 다시마 추출 음료를 식이한 결과고지 혈증 유도군에 비해 약 30% 정도 감소하였다.
- 3 nmole/mL 보다 2배 가량 증가하는 것으로 확인되었으며, 혈중의 hydroxy radical의 함량도 2배 이상 증가하는 것으로 나타났다. 한편, 해조 음료를 투여한 실험군의 경우, 정상 식이군에는 미치지 못했으나 과산화 지질의 함량과 hydroxy radical의 함량을 낮추는 효과가 있다는 것을 확인하였고, 다시 마 추출음료도 비슷한 경향을 나타내었다. 아울러 superoxide dis-mutase(SOD) 활성 에 미치는 영향에서는 고지혈증 유도 실험군의 경우는 1.
- 9 증가하였다. 해조 올리고당 음료와 다시마 추출 음료를 식이한 결과고지 혈증 유도군에 비해 약 30% 정도 감소하였다. 또한 폐의 tissue factor 활성은 고지 혈증 유도군이 20.
후속연구
- 한편, 실험 에 사용한 해조 음료 및 다시 마 추출 음료를 첨 가하므로서 용량 의존적으로 토끼의 장관의 수축력이 증가 되었다(Table 7). 이는 해조 음료가 토끼의 장관을 자극하여서 장관의 운동을 촉진시키는 효과가 있을 수 있다는 중거라고 판단되며, 소장내의 charcoal meal의 이동 거리 결과와 함께 해조음료는 장관의 운동을 촉진하여 배변을 원활하게 함으로서 체내 다양한 성인병의 예방에 기여를 할 수 있을 것으로 생각된다.
- 이상의 bleeding time, plasma clotting time 및 tissue factore] 미치는 해조 올리고당 음료의 효과로 판단해 볼 때, 혈관의 혈액 응고에 의한 고혈압 또는 동맥경화 및 심장 질환과 같은 성인병 예방에도 효과가 있을 것으로 여겨진다.
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