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문제 정의
- 본 실험에서는 항산화효소 활성에 대한 연구의 일환으로 침습성이 강하고 전이가 빠른 악성 흑색종 세포에서 flavonoide 한 종류인 myricetin을 단독 또는 항산화제로 알려져있는 vitamin C, vitamin E 등을 병용 투여하여 그 효과를 알아보았다. 이를 위해 세포 생존률을 알아보기 위한 MTT assay, reactive oxygen species(ROS) level의 변화, 항산화 효소의 활성 변화등을 측정하였다.
- 본 연구에서는 myricetin과 vitamin C나 vitamin E를 병용 처리하여 항산화 효소의 활성, ROS level을 측정하여 항산화 효과에 대해 알아보았다. Myricetin을 단독으로 투여한 경우 농도가 증가할수록 SOD나 GPx의 활성은 감소하였으나 CAT의 활성은 높게 나타났다.
- 증가한 것으로 나타났다. 이에 따라 독성을 나타내지 않는 농도에서 myricetin과 다른 항산화제를 병용 처리하였을 때 항산화 효소계의 변화를 통해 항산화제로서의 역할을 증가시키는가의 여부를 알아보기 위해 실험을 시행하였다. Vitamin C와 vitamin E는 세포 생존율 실험에서 독성을 나타내지 않았던 농도를 최고 농도로 하여 4가지 농도를 선택하여 단독 처리 혹은 myricetin 50piM과 병용 처리하였다.
제안 방법
- - Myricetin과 다른 항산화제의 병용 처리가 CAT의 활성을 더욱 증가시키므로 이 효소의 활성이 직접 활성산소에 제거에 어떠한 영향을 미치는 알아보기 위해 각각의 항산화제를 단독 처리 또는 myricetin 50pM과 병용 처리하여 ROS level을 측정하였다. 실험에 사용된 vitamin C, vitamin E는 각각 myricetin과 병용 처리시 항산화 효소 활성을 가장 높이는 농도인 1mM, 50μM을 사용하였다.
- 10% heat-inactivated fetal bovine serum, 항생제 (10, 000 units/m/ penicillin G sodium, 10, 000 |ig/m/ streptomycin sulfate), 1 mM sodium pyruvate를 포함하는 RPMI 1640 배지를 배양액으로 하여 37℃, humidified 5% CO2 incubator에서 배 양하였다. 25 cm3 tissue culture flask나 75 cm3 tissue culture flask에서 계대 배양하고 confluent 되었을 때 cell dissociation solutioir을 처리하여 실험에 이용하였다.
- 25 - 100(1M의 농도 범 위 에서 실험을 시 행 하였다. Myricetin 50 μM과 병용 처리한 결과 세포 생존율이, vitamin C는 1 mM 에서 62%, vitamin E는 50 μM에서 52.5%에서 59.9%로 세포 독성을 나타내지 않았으므로 이 농도를 최고 농도로 하여 실험을 시행하였다(Fig. 1).
- 이에 따라 독성을 나타내지 않는 농도에서 myricetin과 다른 항산화제를 병용 처리하였을 때 항산화 효소계의 변화를 통해 항산화제로서의 역할을 증가시키는가의 여부를 알아보기 위해 실험을 시행하였다. Vitamin C와 vitamin E는 세포 생존율 실험에서 독성을 나타내지 않았던 농도를 최고 농도로 하여 4가지 농도를 선택하여 단독 처리 혹은 myricetin 50piM과 병용 처리하였다. 24시간 후에 이들 sample에서 protein을 얻어 실험하였다.
- 관찰하였다. 병용 처리하는 myricetin의 농도는 세포독성을 나타내지 않는 최고 농도인 50|iM로 동일하게 처리 하였으며 vitamin C는 0.125-8 mM, vitamin E는 6.25 - 100(1M의 농도 범 위 에서 실험을 시 행 하였다. Myricetin 50 μM과 병용 처리한 결과 세포 생존율이, vitamin C는 1 mM 에서 62%, vitamin E는 50 μM에서 52.
- 이 화합물은 H2O2나 superoxide에 의해 산화될 때 형광을 나타낸다. 산회 된 DCF 의 형광성은 485 nm 의 excitation wavelength 와 530nm의 emission wavelength에서 측정하였다.19)
- 시료를 농도별로 처리한 후 배지를 제거하고 PBS로 2번 세척해준다. 상온에서 50 μM DCF-DA(2', 7'-dichlorofluorescein diacetate; Eastman Kodak, Rochester, NY USA)를 처리 한 후 Cytofluor 2350 plate reader(Millipore, Bedford, MA, USA)를 이용하여 5분간격으로 측정하였다. DCF-DA는 세포 투과성 염료로 ROS 의 세포 내 변화를 볼 때 일반적으로 사용된다.
- 세포 생존율 측정 - B16F10 세포에 myricetine vitamin C나 vitamin E와 병용 투여하여 MTT assay를 통해 세포의생존률을 관찰하였다. 병용 처리하는 myricetin의 농도는 세포독성을 나타내지 않는 최고 농도인 50|iM로 동일하게 처리 하였으며 vitamin C는 0.
- 5) 1 m에 각각의 sampled 50 μl씩 가하고 5분 동안 prein- cubation시킨다. 여기에 5 mM hematoxylin을 30μl을 가한 후 phosphate bulfer를 blank로 하여 UV/visible spectropho-iometer를 사용해 568 nm에서 흡광도를 측정 하고 4분 후 다시 흡광도의 변화를 측정하였다.
- 1 m/을 각각 은후 5분간 preincubaKon시킨다. 여기에 각각의 sample을 가하여 UV/visible spectrophotometer로 340nm에서 흡광도를 측정하고 5분 후 다시 흡광도를 측정하였다.
- 5)만든다. 이 substrate solution 1 ml에 각 sample 50 μl를 가한 후 43.6 M-1cm-1의 exitinction coefficiem를 사용하여 UV/visible spectrophotometer로 240 nm 에서 phosphate buffer를 blank로 하고 30초마다 1분 동안 홉광도를 측정하였다.
- 이를 위해 세포 생존률을 알아보기 위한 MTT assay, reactive oxygen species(ROS) level의 변화, 항산화 효소의 활성 변화등을 측정하였다.
대상 데이터
- 10% heat-inactivated fetal bovine serum, 항생제 (10, 000 units/m/ penicillin G sodium, 10, 000 |ig/m/ streptomycin sulfate), 1 mM sodium pyruvate를 포함하는 RPMI 1640 배지를 배양액으로 하여 37℃, humidified 5% CO2 incubator에서 배 양하였다. 25 cm3 tissue culture flask나 75 cm3 tissue culture flask에서 계대 배양하고 confluent 되었을 때 cell dissociation solutioir을 처리하여 실험에 이용하였다.
- 세포배양 - mouse melanoma cell로부터 유래된 B16F10 celle 한국 세포주 은행 (Korean Cell Lines Bank)으로부터 분양받았다. 10% heat-inactivated fetal bovine serum, 항생제 (10, 000 units/m/ penicillin G sodium, 10, 000 |ig/m/ streptomycin sulfate), 1 mM sodium pyruvate를 포함하는 RPMI 1640 배지를 배양액으로 하여 37℃, humidified 5% CO2 incubator에서 배 양하였다.
- level을 측정하였다. 실험에 사용된 vitamin C, vitamin E는 각각 myricetin과 병용 처리시 항산화 효소 활성을 가장 높이는 농도인 1mM, 50μM을 사용하였다. Vitamin C의 경우 단독 처리와 병용 처리한 실험군이 control 에 비해 각각 42%(P=0.
데이터처리
- set로 세 차례 이상 수행하였다. 각 sample의 통계적 유의성에 대한 검증은 Z-Student test를 시행하여 계산하였다.
- 통계처리 - 본 연구의 그래프와 표의 모든 수치는 각 실험 횟수에 대한 평균과 표준오차로 표시하였으며, 모두 triplicate set로 세 차례 이상 수행하였다. 각 sample의 통계적 유의성에 대한 검증은 Z-Student test를 시행하여 계산하였다.
이론/모형
- Catalase(CAT)의 활성측정은 hydrogen peroxide의 분해를 따라 감소하는 흡광도를 측정하는 Aebi 방법을 이용하였다,5) 50 mM phosphate buffer(pH 7.0)에 30% H2O2S 넣어 10.5 mM substrate solution(A240=0.5)만든다. 이 substrate solution 1 ml에 각 sample 50 μl를 가한 후 43.
- The cells were exposed to various concentrations of (A) vitamin C or (B) vitamin E in the presence of 50 μM myricetin for 24 hr. Percentage of cell viability was determined by MTT assay. Results are expressed as percentage of control.
- Superoxide dismutase (SOD)의 활성 측정은 hematoxylin을 이용한 Mattin의 방법을 사용하였다.17) Hematoxyline 자연 상태에서 붉은색인 hematin으로 자가 산화한다.
성능/효과
- 면역에 중요한 역할을 한다.7) 잎이 무성한 야채, 과일 외에도 와인, 차, 맥주와 같은 음료와 씨앗, 땅콩, 곡류, 향신료, 약용 식물 등에 널리 분포한다. Flavonoid는 항박테리아, 항바이러스, 항혈전증, 항염증, 항알레르기, 항암 효과, 항산화, antimutagenic 활성 등의 다양한 생물학적 효과를 발휘하는 것으로 알려져 있다.
- Catalase 활성에 미치는 영향은 항산화제를 단독 처리한 경우와 myricetin 50μM과 병용 처리한 경우 모두 다 농도가 증가할수록 활성이 증가하였다. 또한 항산화제를 단독처리한 경우보다 myricetin 50μM과 병용 처리한 실험군의 활성이 더 높았다.
- Glutathione peroxidase 활성에 미치는 영향은 항산화제를 단독 처리한 경우, vitamin C와 vitamin E에서는 농도가 증가할수록 활성이 증가함을 알 수 있었으나 myricetin인 경우는 감소하여 SOD와 같은 양상을 나타내었다. Control에 비해 vitamin C가 1 mM일 때 1.
- 효과에 대해 알아보았다. Myricetin을 단독으로 투여한 경우 농도가 증가할수록 SOD나 GPx의 활성은 감소하였으나 CAT의 활성은 높게 나타났다.
- Superoxide dismutase 활성에 미치는 영향은 vitamin C, vitamin E는 농도가 증가할수록 활성이 증가하였으나 myricetin 경우에는 감소하였다. Control에 비해 vitamin C가 1 nM일때 1.
- Myricetin 50 μM과 병용 처리한 경우는 vitamin C나 vitamin E를 각각 처리한 실험군보다 활성이 감소하였다. 각 항산화제를 단독 처리 한 실험 군에 비해 vitamin C가 1 mM일 때 9.5%, vitamin E 50 μM 일 때 10.6% 감소하였다. 그러나 이들은 myricetin 50 μM 을 단독 처리한 경우보다는 증가하였다(Fig.
- 증가할수록 활성이 증가하였다. 또한 항산화제를 단독처리한 경우보다 myricetin 50μM과 병용 처리한 실험군의 활성이 더 높았다. Vitamin C의 경우 1 mM일 때 단독 처리와 병용 처리한 실험군이 control에 비해 각각 187배, 2.
- 위의 실험결과 Myricetin을 단독으로 투여한 경우 농도가 증가할수록 SOD나 GPx의 활성은 감소시키나 CAT의 활성은 증가시키는 것으로 보아 myricetin의 항산화작용은 SOD 나 GPx 보다는 CAT의 활성을 증가시킴으로서 항산화 작용을 나타내며 vitamin C나 vitamin E를 병용 투여함으로써 ROS level을 더 감소시키는 것으로 사료된다.
- 이상의 실험 결과 myricetin 단독으로 투여하는 것 보다 항산화제의 병용 처리가 세포 독성에는 영향을 미치지 않으면서 ROS level을 감소시키는 것으로 나타났다.
- 항산화 효소 활성에 미치는 영향 - Myricetin을 단독 처리하였을 때 SOD, GPx의 활성은 감소하였으나 CAT의 활성은 증가한 것으로 나타났다. 이에 따라 독성을 나타내지 않는 농도에서 myricetin과 다른 항산화제를 병용 처리하였을 때 항산화 효소계의 변화를 통해 항산화제로서의 역할을 증가시키는가의 여부를 알아보기 위해 실험을 시행하였다.
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