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문제 정의
- 이에 따라 본 연구에서는 포도주 가공 중에 발생하는 포도 주 부산물의 항산화활성 검토를 위해 포도주 부산물을 유기 용매로 추출 및 분획하여 총 플라보노이드 및 페놀 함량을 측정하고 포도주 부산물의 항산화 효과를 알아보고자 한다.
제안 방법
- 이 과정을 2회 반복하여 얻은 여액은 40℃ 수욕 상에서 rotary vacuum evaporator (N-1000, EYELA, Japan)로 농축하여 acetone/ methylene chloride (A+M) 추출물을 얻었다. A+M 용매로 추 출되지 않은 성분을 methanol (MeOH)로 추출하고자 남은 잔사에 A+M과 동량의 MeOH을 부어 위와 동일한 방법으로 2회 반복한 후 농축하여 MeOH 추출물을 얻었다. 두 용매로 부터 최대로 수득한 추출물을 혼합하여 다시 용매 극성에 따라 순차적으로 분획하여 n-Hexane, 85% aq.
- 포도주 부산물 추출물 및 분획물의 DPPH 라디칼 소거활 성은 활성산소를 제거할 수 있는 능력인 EDA (electron do- nating ability, %)로 Table 2에 나타내었다. 각 용매별 추출물 및 분획물을 각각 0.05, 0.1, 0.25, 0.5 mg/ml의 농도로 대조군 (L-ascorbic acid, BHT)과 비교하였다. 먼저 추출물들과 비교 했을 때 MeOH 추출물은 A+M 추출물과 비교했을 때 활성산 소 소거능이 우수하였다.
- 포도주 부산물 추출물 및 분획물의 DPPH 라디칼 소거활 성은 활성산소를 제거할 수 있는 능력인 EDA (electron do- nating ability, %)로 Table 2에 나타내었다. 각 용매별 추출물 및 분획물을 각각 0.05, 0.1, 0.25, 0.5 mg/ml의 농도로 대조군 (L-ascorbic acid, BHT)과 비교하였다. 먼저 추출물들과 비교 했을 때 MeOH 추출물은 A+M 추출물과 비교했을 때 활성산 소 소거능이 우수하였다.
- 각 well에 시료를 처리하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 1시간 배양한 후, DCFH-DA을 없애고 세포는 다시 PBS로 씻은 후 500 μM H2O2를 처리하여 시간 별로 DCF fluorescence를 excitation 488 nm, emission 530 nm에서 microplate reader (VICTOR3, Perkin Elmer, USA)로 측정하였다. 대조군들(blank군과 control군)은 시료 대신 PBS를 처리하며, control군은 500 μM H2O2를 처리를 하 고, blank군은 500 μM H2O2 대신 PBS를 처리하여 측정하였다.
- 시료 중 총 플라보노이드(flavonoid) 함량은 Davis 등[3]의 방법을 변형하여 다음과 같이 측정하였다. 포도주 부산물 용 매별 추출물 및 분획물 1 mg을 MeOH 1 ml에 녹여 시험관에 취하고 10 ml의 diethylene glycol을 가하여 잘 혼합한 후 1N NaOH 1 ml 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 반응 시킨다.
- 반응이 끝난 후 UV-visible spectrometer (Helios be- ta, Thermo electron corporation, USA)를 사용하여 750 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 표준물질로 tannic acid를 사용 하였으며 시료와 동일한 방법으로 분석 후 얻은 표준곡선으 로부터 총 페놀성 화합물 함량을 측정하였다.
- 반 응이 끝난 후 UV-visible spectrometer (Helios beta, Thermo electron corporation, USA)를 사용하여 420 nm에서 흡광도 를 측정하였다. 이때 표준물질은 rutin (Sigma Co., USA)을 사용하여 표준곡선에 의해서 총 플라보노이드 함량을 측정하였다.
- , Japan)에서 배양하면서 배양 중인 세포를 일주일에 2번 새로운 배지로 바꿔주었다. 일주일 후 phos- phate buffered saline (PBS)으로 세척한 뒤 0.05% trypsin- 0.02% EDTA (Gibco, USA)로 부착된 세포를 분리하여 원심 분리 한 후 집적된 세포에 배지를 넣고 피펫으로 세포가 골고 루 분산되도록 잘 혼합하여 cell culture flask에 10 ml씩 일정한 수로 분할하여 주입하고, 6~7일마다 계대 배양하면서 실험에 사용하였다.
- 포도주 부산물의 유기용매 추출을 위하여 acetone:methyl- ene chloride를 1:1 비율로 혼합하여 포도주 부산물이 충분히 잠기도록 하여 24시간 방치한 후 추출하였다. 이 과정을 2회 반복하여 얻은 여액은 40℃ 수욕 상에서 rotary vacuum evaporator (N-1000, EYELA, Japan)로 농축하여 acetone/ methylene chloride (A+M) 추출물을 얻었다.
대상 데이터
- 02 ml를 혼합하여 암소에서 10분간 방치 후 UV-visi- ble spectrophotometer 732 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대 조군으로는 천연항산화제인 L-ascorbic acid와 합성항산화제 인 BHT를 사용하였다. 포도주 부산물의 ABTS+ 라디칼 소거 활성은 다음의 식에 따라 계산하였다.
- 본 실험에 사용된 포도주 부산물은 까브스토리(경상북도 영천시)로부터 제공받아 사용하였다. 포도주 부산물을 자연 건조시킨 후, 실험 사용 전까지 -70℃의 deep freezer (NF-400 SF, NIHON FREEZER, Japan)에 냉동 보관하였다.
- 9 ml를 섞은 후 10분 후 UV-visi- ble spectrophotometer (Helios beta, Thermo electron corpo- ration, USA)로 518 nm에서 측정하였다. 이때 대조군은 천연 항산화제인 L-ascorbic acid와 합성항산화제인 2, 6-Ditertbutyl- 4-methylpheno (BHT)를 사용하였다. 포도주 부산물의 DPPH 라디칼 소거활성은 다음의 식에 따라 계산하였다.
- 한국 세포주 은행(서울의대)으로부터 인체 섬유종세포(HT- 1080)를 분양받아 본 실험실에서 배양하면서 실험에 사용하였다. HT-1080 세포는 100 units/ml의 penicillin-streptomycin (Gibco, USA)과 10% Fetal bovine serum(FBS, Corning cell- gro, USA)가 함유된 RPMI 1640 (Lonza, USA)을 사용하여 37 ℃, 5% CO2 incubator (MCO-15AC, SANYO Electric Bio- medical Co.
데이터처리
- 실험결과는 Mean±SEM (Standard Error of Mean)으로 나 타내었고 분석된 실험 데이터는 대조군과 각 시료로부터 얻 은 실험 자료로부터 one-way ANOVA를 실시하여 유의성을 검증하였다.
이론/모형
- 세포 내 활성산소종은 DCFH-DA (2‘, 7’-dichlorodihydro- fluorescin diacetate) assay [19]로 측정하였다. DCFH-DA (Sigma, USA)는 세포 내 활성산소종과 반응하여 형광물질 (dichlorofluorescein, DCF)을 만들어 내는 것으로 이 시약을 세포 속에 넣어 발생하는 형광을 측정함으로써 세포 내의 활 성산소종을 측정할 수 있다.
- 총 페놀(phenol) 화합물 함량은 Folin-Denies법[28]을 응용 하여 측정하였다. 추출물 및 분획물 1 mg을 MeOH 1 ml에 녹이고, 10배 희석한 희석액 2 ml에 2배 희석한 Folin-Ciocal- teu's phenol reagent 2 ml을 첨가하여 혼합한 다음 3분 동안 방치한 후 10% Na2CO3 용액 2 ml을 넣고 1시간 동안 반응 시킨다.
- 포도주 부산물에 대한 ABTS+ 라디칼 소거활성은 Re등의 방법[27]으로 측정하였다. 7 mM의 ABTS+와 2.
성능/효과
- 1 mg/ml의 농도로 인체 섬유육종세포(HT-1080)에 처리하여 세포 내 활성 산소종을 측정한 결과 두 추출물들 모두 측정시간 120분이 지남에 따라 높은 세포 내 활성산소종 억제효과를 나타내었다. MeOH 추출물의 경우 A+M 추출물과 비교 하였 을 때 세포 내 활성산소종을 상대적으로 크게 억제하였으며 특히 MeOH 추출물 0.1 mg/ml 농도에서는 대조군과 비교하여 64%의 억제효과를 나타내었다(Fig. 1). 포도주 부산물 추 출물을 n-Hexane, 85% aq.
- 93 mg/g으로 가장 높은 플라보노이드를 함 유하는 것으로 나타났으며, 다음으로 n-BuOH, Water 및 n- Hexane 분획물 순이었다. 각 용매별 추출물 및 분획물의 총 페놀 함량 또한 MeOH 추출물(4.35±0.04 mg/g)이 A+M 추출 물(0.38±0.004 mg/g)보다 높은 페놀을 함유하는 것으로 나타 났으며 분획물들 중에서 n-BuOH 분획물이 5.47±0.04 mg/g 으로 가장 높게 함유하는 것으로 나타났다. 이에 따라 총 플라 보노이드 및 페놀 함량은 MeOH 추출물, 85% aq.
- 5 mg/ml의 농도로 대조군 (L-ascorbic acid, BHT)과 비교하였다. 먼저 추출물들과 비교 했을 때 MeOH 추출물은 A+M 추출물과 비교했을 때 활성산 소 소거능이 우수하였다. 이는 앞서 MeOH 추출물의 높은 총 플라보노이드 및 총 페놀 함량과 연관있는 것으로 여겨진다.
- 이는 앞서 MeOH 추출물의 높은 총 플라보노이드 및 총 페놀 함량과 연관있는 것으로 여겨진다. 분획물들 중 n-BuOH 분획물은 실험한 모든 농도에서 대조군 인 BHT보다 EDA값이 높게 나타났으며, 0.5 mg/ml의 농도 에서 71.8%의 소거능을 나타냄으로써 합성항산화제인 BHT (70.2%)보다 높은 라디칼 소거 효과를 나타내었다. 이 또한 n-BuOH 분획물의 높은 함량의 총 플라보노이드 및 페놀과 연관되어 있다고 여겨진다.
- 또한 Choi [6]등은 동물실험에서 포 도씨 공급은 혈청 지질산화물 생성을 감소시켰고 catalase 및 glutathione-S-transferase 활성을 상승시켰다고 보고하였다. 이상의 결과들로부터 포도주 부산물으로부터 얻어진 추출물 은 MeOH 추출물의 총 플라보노이드 및 페놀 함량이 높게 나타났고 이는 높은 활성산소 소거능과 연관이 있었으며 분 획물들 중에서는 n-BuOH 분획물의 항산화 효과 및 총 플라 보노이드 및 페놀 함량이 높게 나타났다. 따라서 포도 및 포도 씨와 비교했을 때 포도주 부산물의 경우 총 플라보노이드 및 총 페놀 함유량은 다소 낮게 나타났지만 항산화 효과는 지속 되는 것으로 여겨지므로 향후 포도주 부산물의 응용이 기대 되어진다.
- 포도주 부산물의 용매별 추출물 및 분획물들의 총 플라보 노이드 및 총 페놀 함량은 Table 1에 나타내었다. 포도주 부산 물 A+M 및 MeOH 추출물들의 총 플라보노이드 함량은 각각 26.4±0.77 및 56.1±1.87 mg/g으로 MeOH 추출물의 총 플라보 노이드 함량이 높았다. 분획물들 중에서는 85% aq.
- 포도주 부산물의 A+M 및 MeOH 추출물을 0.05 및 0.1 mg/ml의 농도로 인체 섬유육종세포(HT-1080)에 처리하여 세포 내 활성 산소종을 측정한 결과 두 추출물들 모두 측정시간 120분이 지남에 따라 높은 세포 내 활성산소종 억제효과를 나타내었다. MeOH 추출물의 경우 A+M 추출물과 비교 하였 을 때 세포 내 활성산소종을 상대적으로 크게 억제하였으며 특히 MeOH 추출물 0.
후속연구
- 이상의 결과들로부터 포도주 부산물으로부터 얻어진 추출물 은 MeOH 추출물의 총 플라보노이드 및 페놀 함량이 높게 나타났고 이는 높은 활성산소 소거능과 연관이 있었으며 분 획물들 중에서는 n-BuOH 분획물의 항산화 효과 및 총 플라 보노이드 및 페놀 함량이 높게 나타났다. 따라서 포도 및 포도 씨와 비교했을 때 포도주 부산물의 경우 총 플라보노이드 및 총 페놀 함유량은 다소 낮게 나타났지만 항산화 효과는 지속 되는 것으로 여겨지므로 향후 포도주 부산물의 응용이 기대 되어진다.
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