Bacillus sp.유래 ${\\beta}-mannanase$에 의한 $Gal^3Man_4(6^3-mono-{\\alpha}-D-galacto-pyranosyl-{\\beta}-mannotetraose)$ 조제 및 장내세균에 대한 생육활성 Preparation of $Gal^3Man_4(6^3-mono-{\\alpha}-D-galacto-pyranosyl-{\\beta}-mannotetraose)$ by Bacillus sp. ${\\beta}-mannanase$ and Growth Activity to Intestinal Bacteria원문보기
Bacillus sp. 유래 ${\beta}-mannanase$의 brown copra meal에 대한 기질 특이성을 규명하기 위하여 정제효소 150 ml를 0.5% 기질에 $50^{\circ}C$, 24 hrs 가수분해후 TLC, FACE로 비교 검토한 결과 2종류의 galactosyl mannooligosaccharide로 구성되어 1차 activated carbon column chromatography을 이용해 250 ml/hr 유속으로 tube당 50ml씩 ethanol$0{\sim}30%$ linear gradient로 당을 분리하였다. Activated carbon column chromatography에 의한 당용액 0.2 ml와 5% phenol 0.2 ml를 가하여 혼합 후 $Conc.H_2SO_4$ 1 ml를 가하여 혼합한 후 20분간 방치하여 490 nm로 흡광도를 측정하여 TLC로 pattern을 검토한 후 $Gal^3Man_4$ 및 DP 7의 galactosyl manooligosaccharide의 fraction을 회수하여 2차 activated carbon column chromatography를 이용해 1차와 동일한 조전에서 분리 회수하여 중합도 5는 $Gal^3Man_4(63-mono-{\alpha}-D-galactopyranosyl-{\beta}-mannotetraose)$로 동정되었고, 중합도 7은 현재 동정중에 있다. Bifidobacterium속 균주(B. longum, B. bifidum)에 대한 생육활성을 비교 검토하기 위하여 MRS media에서 탄소원을 dextrose대신에 조제된 $Gal^3Man_4$를 첨가후 측정한 결과 $Gal^3Man_4$이 첨가되지 않은 MRS broth에 비해 생육촉진 활성을 보였다. 특히 B. longum에 대해서는 $Gal^3Man_4$를 dextrose대체 탄소원으로 처리시 10배의 생육활성이 증가하였다.
Bacillus sp. 유래 ${\beta}-mannanase$의 brown copra meal에 대한 기질 특이성을 규명하기 위하여 정제효소 150 ml를 0.5% 기질에 $50^{\circ}C$, 24 hrs 가수분해후 TLC, FACE로 비교 검토한 결과 2종류의 galactosyl mannooligosaccharide로 구성되어 1차 activated carbon column chromatography을 이용해 250 ml/hr 유속으로 tube당 50ml씩 ethanol $0{\sim}30%$ linear gradient로 당을 분리하였다. Activated carbon column chromatography에 의한 당용액 0.2 ml와 5% phenol 0.2 ml를 가하여 혼합 후 $Conc.H_2SO_4$ 1 ml를 가하여 혼합한 후 20분간 방치하여 490 nm로 흡광도를 측정하여 TLC로 pattern을 검토한 후 $Gal^3Man_4$ 및 DP 7의 galactosyl manooligosaccharide의 fraction을 회수하여 2차 activated carbon column chromatography를 이용해 1차와 동일한 조전에서 분리 회수하여 중합도 5는 $Gal^3Man_4(63-mono-{\alpha}-D-galactopyranosyl-{\beta}-mannotetraose)$로 동정되었고, 중합도 7은 현재 동정중에 있다. Bifidobacterium속 균주(B. longum, B. bifidum)에 대한 생육활성을 비교 검토하기 위하여 MRS media에서 탄소원을 dextrose대신에 조제된 $Gal^3Man_4$를 첨가후 측정한 결과 $Gal^3Man_4$이 첨가되지 않은 MRS broth에 비해 생육촉진 활성을 보였다. 특히 B. longum에 대해서는 $Gal^3Man_4$를 dextrose대체 탄소원으로 처리시 10배의 생육활성이 증가하였다.
For the elucidation of substrate specificity to the brown copra meal by Bacillus sp. ${\beta}-mannanase.$, the enzymatic hydrolysate after 24 hr of reaction was heated in a boiling water bath for 10 min, and then centrifuged to remove the insoluble materials from hydrolysates. The major h...
For the elucidation of substrate specificity to the brown copra meal by Bacillus sp. ${\beta}-mannanase.$, the enzymatic hydrolysate after 24 hr of reaction was heated in a boiling water bath for 10 min, and then centrifuged to remove the insoluble materials from hydrolysates. The major hydrolysates composed of D.P 5 and 7 galactosyl mannooligosaccharides. For the separate of galactosyl mannooligosaccharides, the supernatant solution of 150 ml was put on a first activated carbon column. The column was then washed with 5 l of water to remove mannose and salts. The oligosaccharides in the column were eluted by a liner gradient of $0{\sim}30%$ ethanol, at the flow rate of 250 ml per hour. The sugar composition in each fraction tubes was examined by TLC and FACE analysis. The combined fraction from F3 was concentrated to 30 ml by vacuum evaporator. Then put on a second activated carbon column. The oligosaccharides in the column were eluted by a liner gradient of $0{\sim}30%$ ethanol (total volume: 5 l), at the flow rate of 250 ml per hour. The eluent was collected in 8 ml fraction tubes, and the total sugar concentration was measured by method of phenol-sulfuric acid. The major component of F2 separated by 2nd activated carbon column chromatography were identified $Gal^3Man_4(6^3-mono-{\alpha}-D-galactopyranosyl-{\beta}-mannotetraose)$. To investigate the effects of brown copra meal galactomannooligosaccharides on growth of Bifidobacterium longum, B. bifidum were cultivated individually on the modified-MRS medium containing carbon source such as $Gal^3Man_4$, compared to those of standard MRS medium.
For the elucidation of substrate specificity to the brown copra meal by Bacillus sp. ${\beta}-mannanase.$, the enzymatic hydrolysate after 24 hr of reaction was heated in a boiling water bath for 10 min, and then centrifuged to remove the insoluble materials from hydrolysates. The major hydrolysates composed of D.P 5 and 7 galactosyl mannooligosaccharides. For the separate of galactosyl mannooligosaccharides, the supernatant solution of 150 ml was put on a first activated carbon column. The column was then washed with 5 l of water to remove mannose and salts. The oligosaccharides in the column were eluted by a liner gradient of $0{\sim}30%$ ethanol, at the flow rate of 250 ml per hour. The sugar composition in each fraction tubes was examined by TLC and FACE analysis. The combined fraction from F3 was concentrated to 30 ml by vacuum evaporator. Then put on a second activated carbon column. The oligosaccharides in the column were eluted by a liner gradient of $0{\sim}30%$ ethanol (total volume: 5 l), at the flow rate of 250 ml per hour. The eluent was collected in 8 ml fraction tubes, and the total sugar concentration was measured by method of phenol-sulfuric acid. The major component of F2 separated by 2nd activated carbon column chromatography were identified $Gal^3Man_4(6^3-mono-{\alpha}-D-galactopyranosyl-{\beta}-mannotetraose)$. To investigate the effects of brown copra meal galactomannooligosaccharides on growth of Bifidobacterium longum, B. bifidum were cultivated individually on the modified-MRS medium containing carbon source such as $Gal^3Man_4$, compared to those of standard MRS medium.
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제안 방법
bifidunfe 대한 생육활성을 비교하기 위하여 MRS media에서 탄소원을 dextrose 대신에 조제된 중합도 5의 Gal3Man4 를 첨가한후 측정하였다.% 중합도 5의 galactomannooligosaccharide 를 회수하여 진공농축시킨후 121℃, 15분간 autoclave한후 DNS 법을 이용하여 동일한 환원당량으로 조절 한후 modified MRS m* edia 조제하여, 108匹로 희석한후 혐기적 조건하에서 37℃, 48 hr 평판배양한 후 colony수를 비교하였다.23, 껴
0.5% brown copra meal 를 함유하는 효소액를 가하여 5(TC에서 24시간 가수분해 반응을 진행하고, 5분간 비등에 의해 반응을 정지시킨 후 양이 온수지(USA amberHte IR-120, Sigma Chemical Co.)와 음이 온수지 (USA amberlite IRA-400, Sigma Chemical Co.)에 침지하여 반응액의 당조성을 TLC에 의해 분석하였다(Fig. 1).
2). Activated carbon column chromatography0]] 의한 당용액 0.2 W와 5% phenol 0.2 ml를 가하여 혼합 후 conc.eSQ 1ml를 가하여 혼합한 후 20분간 방치하여 490 nm로 흡광도를 측정하여 TLC로 pattern을 검토한 후 GaPMaie의 fraction(F3) 을 회수하여 2차 activated carbon column chromatography을이용해 250 mZ/hr유속으로 tube당 8mZ씩 용출하였으며 ethanol 0~30%의 gracHent method로 Gal3Man4(63-mono-ot-D-galactopyranosyl- P-mannotetraose)^ 분리하였다(Fig. 3).
5% brown copra me시을 24 시간 가수분해하여 TLC 및 FACE로 partem을 검토한 후 1차 activated carbon column chromatography을 이용해 250ml/hr 유속으로 tube당 50mZ씩, ethanol 0-30% linear gradient법으로딩을 분리하였다. Activated carbon column chromatography에 의한 당용액 0.2 m/와 5% phenol 0.2 ml를 가하여 혼합 후 conceSO, lm/> 가하여 혼합한 후 20분간 방치하여 490 nm로 흡광도를 측정하여 TLC 및 FACE로 pattene 검토한 후 GaFMaq을 포함하는 당용액을 회수하여 2차 activated carbon column chromatography을 이용해 250 m//hr 유속으로 tube당 8 mZ씩 용줄하였으며 ethanol 0~30%의 gradient method로 Gal3Man4(63-mono-a-D-galactopyranosyl-p-mannotetraose) fractiori을 최종 분리, 회수하여 TLC의 Rf value level 및 FACE법에 의한 중합도의 크기 및 band위치에 따른 homo, hetero type을 결정하고, 최종적으로 R purpurogenume A. niger 및 M. vinacea I유래 a-galactosidase의 GaFMaiL에 대한 기질특이성 차이점을 이용하여 구조를 동정하였다.
B. longum, B. bifidunfe 대한 생육활성을 비교하기 위하여 MRS media에서 탄소원을 dextrose 대신에 조제된 중합도 5의 Gal3Man4 를 첨가한후 측정하였다.% 중합도 5의 galactomannooligosaccharide 를 회수하여 진공농축시킨후 121℃, 15분간 autoclave한후 DNS 법을 이용하여 동일한 환원당량으로 조절 한후 modified MRS m* edia 조제하여, 108匹로 희석한후 혐기적 조건하에서 37℃, 48 hr 평판배양한 후 colony수를 비교하였다.
vinacea I 유래 a-galaclosidasR 의 기질특이성 차이점을 이용하였다. P. purpurogenum 및 A. niger 유래 효소는 환원말단에서 3번째 위치한 maimose에 결합되어 있는 galactose를 가수분해하여 TLC 상에서 galactose의 spot이 출현되지만, M. vinacea I유래 효소는 galactose를 유리하지 못하여 galactose spot이 출현되지 않는 기질특이성 차이점을 이용하였다(자료미제시). 2차적으로는 FACE에 의해 authentic mannooligosaccharidesel band와 비교해볼 때 homo type과는 달리 hetero type에서 나타나는 특징적 band가 homo type의 authentic 중합도 4 mannotetraosee 중합도 5 marmopentaose사이에 나타남으로써 hetero type의 중합도 5의 올리고당임이 입증되었다(Fig.
분리회수된 당용액 (F2 fraction)의 구조를 확인하기위하여 본연구에서는 P. purpurogenum, A. niger 및 M. vinacea I 유래 a-galaclosidasR 의 기질특이성 차이점을 이용하였다. P.
Bacillus sp. 유래 정제 p-mannanase> 이용하여 copra cake가수분해 올리고당중 Gal3Man4(63-mono-cx-D-galacto- pyranosyl-p-mannotetraose)s 분리 조제하고, 미생물유래 효소의 기질특이성의 차이점을 이용하여 구조를 동정하였으며, Bifidobacterium spp에 대한 생육활성을 기존의 MRS배지내 탄소 원과 Gal3Man4(63-mono-a-D-galacto-pyranosyl-p-mannotetraose) 대체 탄소원의 활성을 비교검토하였다.
수행하였다. 즉, mannose를 함유한 가수분해물 0.1 mZ와 DNS시약 1.0 mZ를혼합하여 10min간 물중탕을 하여 냉각시킨 후 희석하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준곡선은 D-mannose를 0.
효소액 300 mZ에 대해 0.5% brown copra meal을 24시간 가수분해해 TLC로 pattern을 검토한 후 1차 activated carbon column 아iromatography을 이용해 250 ml/hr유속으로 tube당 50mZ씩 ethanol 0-30% linear gradient법으로 당을 분리하였다 (Fig. 2). Activated carbon column chromatography0]] 의한 당용액 0.
효소액 300 mZ에 대해 0.5% brown copra me시을 24 시간 가수분해하여 TLC 및 FACE로 partem을 검토한 후 1차 activated carbon column chromatography을 이용해 250ml/hr 유속으로 tube당 50mZ씩, ethanol 0-30% linear gradient법으로딩을 분리하였다. Activated carbon column chromatography에 의한 당용액 0.
대상 데이터
Copra의 oil 추출 부산물인 brown copra meale Fuji Oil Co., Ltd (Japan)으로부터 공급을 받았으며, Copra meale 72% HzSCQ로 30℃, 30분간 가수분해하였으며, total sugar 및 component sugar는 Somogyi법과 gas liquid chromatography에 의해 분석하였다, Copra meale 66.0% mannose, 5.8% galactose, 22.5% glucose, 4.0% arabinose 및 1.7% xylose로 구성 된 47.7% total sugar® 함유한다. p-1, 4-mannooligosaccharidese 이미 보고된 방법 ⑹과 같이 Streptoinyces sp.
이론/모형
TLC는 McCleary법"에 따라 다음과 같은 조건하에서 전개 후 UV조사 및 spray reagent로 분무하여 140℃에서 5분간 가열하여 당을 분석하였다. TLC plate: 20X 20 cm silica gel 60 F254(Merck, Germany), 전개 용매 : n-propanol: methanol: water = 5:2: 3(v/v), 발색 시 약: 30% sulfuric acid-ethanol.
DNS 환원당 정량법에 의하여 수행하였다. 즉, mannose를 함유한 가수분해물 0.
당을 전기영동하여 분석하기 위해서 Jackson의 방법에 따라 ANTS에 의한 유도체를 한다. 당용액 50ul을 동결건조한 후 15% acetic acid에 0.
효소생산 배지조성 및 방법과 효소정제법은 저자에 의해 보고된 방법⑺에 의하여 효소액을 생산하였다.
성능/효과
TLC 및 FACE(자료미제시) 결과에서 gum류 및 copra meal 의 가수분해 pattern을 비교해본 결과 locust bean gume 가수분해가 진행되어 24시간에 GaPMa%와 p-l, 4-mannobiose, DP 7인 galactomannooligosaccharide로 가수분해되었고, guar 응ume 24시간에 GaPMaq와 DP 7인 galactomannooligosaccharide로가수분해 되었으며, copra meale 가수분해가 진행되어 24시간에 소량의 mamiose와 주요 가수분해산물은 중합도 5와 7인 galactosyl mannooligosaccharide로 구성되었다. 기질로서 사용된 locust bean gum과 guar gume 구조적으로 유사하여 (locust bean gume galactose: mannose =1:4, guar gume* galactose: mannose =1: 2) 주요 가수분해 올리고당이 중합도 5와 7로 공통점 을 보이고 있으나, copra cake유래 기 질(galactose: mannose = 1:14)은 가수분해가 더 진행되어 단당류를 포함하는가 수분 해의 차이점을 보이고 있다.
균주(B. longum, B. bifudum에 대한 생육 활성을 비교 검토하기 위하여 MRS media에서 탄소원을 dextrose 대신에 조제된 G시'Maq를 첨가후 측정한 결과 GafMaq이 첨가되지 않은 MRS broth에 비해 생육촉진 활성을 보였다. 특히 B.
기질로서 사용된 locust bean gum과 guar gume 구조적으로 유사하여 (locust bean gume galactose: mannose =1:4, guar gume* galactose: mannose =1: 2) 주요 가수분해 올리고당이 중합도 5와 7로 공통점 을 보이고 있으나, copra cake유래 기 질(galactose: mannose = 1:14)은 가수분해가 더 진행되어 단당류를 포함하는가 수분 해의 차이점을 보이고 있다. 공통적으로 gum류와 copra meal의 galactomanman의 가수분해 pattern으로서는 주요 생성물이 중합도 5와 7로 구성되어 있음이 확인되었다.
4). 본 연구에서 분리 조제된 중합도 5의 구조식은 상기 미생물유래 효소의 특이성의 차이점, TLC 및 FACE 의 결과에 따라 Gal3Man4(63-mono-oc-D-galactopyranosyl-P-mannotetraose)^ 동정되었다. 본 연구실에서는 현재 중합도 7의 galactosylmannooligosaccharidesel 구조를 동정 중에 있으나 Gal23Man5, Gal34Man5, Gal2.
후속연구
올리고당중 중합도 7에 해당하는. 올리고당을"purity 및 yield가 높은 방법으로 회수하여 정확한 구조 식을 동정 중에 있으며 차후 동정된 중합도 7의 올리고당이 Bifidobacterium속 균주에 미치는 영향을 비교검토할 예정으로있다.
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