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문제 정의
- Mutans streptococci의 생물형을 결정하기 위하여 다음의 생화학 검사를 시행하였다. 생물형의 판정 기준은 Shklair와 Keen""의 방법을 따랐다(Table 1).
- 또한 근래에는 mutans streptococci의 분자생물학적 방법을 이용한 검출 방법들이 개발되었기 때문에 예전의 연구에 비해 좀 더 정확한 검출 결과를 얻을 수 있게 되었다. 그러므로, 이 연구에서는 Igarash 등脇이 개발한 S. mutans 및 S. so~ brinus를 각각 종-특이적으로 검출할 수 있는 중합 효소 연쇄반응 프라이머를 이용한 중합효연쇄반응법 및 기존의 생화학적 방법을 이용하여, 한국인 소아의 치면세균막에 존재하는 mutans streptococci의 종을 구별하고, 소아의 치아우식 경험지수와의 상관관계를 조사하고자 한다.
- 본 연구는 한국인 소아의 치면세균막에 존재하는 mutans streptococci 종 및 생물형의 발현빈도와 치아우식 경험 지수와 상관 관계를 알아보기 위하여, 조선대학교 치과병원에 내원한 12세 미만의 소아 113명의 치아우식경험지수를 구하고, 이들의 상하악 유전치 및 유구치의 협면 및 설면의 치면세균막 샘플을 채취하여 mutans streptococci를 MSB 배지에서 선택적으로 분리한 다음, 이들의 biotype을 알아보기 위해 생화학적 검사를 실하고, 이들의 종 수준에서의 동정을 위해 dextranase 유전자를 표적으로 하는 중합효소연쇄반응을 시행하여 mutans streptococci의 종의 발현빈도와 그들의 생물형을 비교하여 다음의 결과를 얻었다.
제안 방법
- Arginine dihydrolase의 생성여부를 알아보는 실험으로 먼저 TH broth에서 24시간 mutans streptococci를 배양하고, 이들 세균배양액 20 以를 0.5% yeast extract, 0.5% tryptone, 0.2% K2HPO4, 0.05% dextrose, 0.3% L-arginine hydrochloride가 혼합된 배지 200 同에 접종하여 48 시간 동안 10% CO2가 공급되는 37P 세균 배양기에서 배양하였다. 여기에 20 闻의 Nessler solution(5% KI, 2% HgCh, IN NaOH)을 떨어트려 짙은 갈색을 띠면 양성( + ), 그렇지 않으면 음성 ㈠으로 판정하였다.
- MSB 배지 에서 증식 이 용이 한 자라나는 staphylococci를 제외시키기 위해 catalase test를 시행하였다. 대부분의 staphylococci는 본 검사에 양성 반응을 보이지만, mutans steptococci는 음성이다.
- 대부분의 staphylococci는 본 검사에 양성 반응을 보이지만, mutans steptococci는 음성이다. MSB 배지에서 72 시간 배양한 세균 군락을 조심히 멸균된 백금이로 떼어낸 다음, 이를 3% 과산화수소수에 넣어 산소가 발생할 경우 양성( + ), 그렇지 않을 경우 음성㈠ 으로 판정하였다.
- Mutans streptococci를 종」특이적으로 동정하기 위한 중합 효소 연쇄반응의 주형으로 사용할 세균 지놈 DNA는 G-spin™ Genomic DNA Extraction Kit(iNtRON Inc., Seoul, Korea)를 이용하여 추출하였다. 이를 간략히 설명하자면 다음과 같다.
- 즉, 생물형 제 N형으로 조사된 ChDC 1025, ChDC 1051, ChDC 1054, ChDC 1164 균주들과, 제 II 형이라 조사된 ChDC 1139 균주, 그리고, 제 1 형인 ChDC 1143 균주 등은 두 가지 종-특이 프라이머에 의해 아무런 반응이 없었으며 , 제 I 형이라 조사된 ChDC 1111 균주, 제『형인 ChDC 1163 균주들은 두 가지 종■특이 프라이머에 의해 모두 반응물이 증폭되었다(Table 3). 또한, 제 I형인 ChDC 1183, ChDC 1044 균주와 제 V형인 ChDC 1136균주 들은 중합효소연쇄반응 결과 예상과는 반대로 S. sobrinus특이 프라이머만 반응하였다(Table 3). 이와 같이 생물형과 종의 관계가 일치하지 않은 11 균주는 S.
- 세균이 배지 내에 포함되어 있는 특이 당질을 발효시킬 수 있는 능력을 알아보는 실험으로 Phenol red broth(Difco, Lab.) 에 mannitol, sorbitol, raffinose 및 melibiose을 첨가하여 각각 1%가 되도록 하고 이를 통상적으로 가압 멸균한 다음 200 必씩 96-well plate에 분주하였다. 다음 24시간 동안 TH broth에서 배양한 20 问의 세균 배양액을 각각의 well에 접종하고 이를 48 시간동안 10% CO2가 공급되는 37t 세균 배양기에서 배양하였다.
- X 이용하였으며 그 과정은 다음과 같다. 앞에서 추출한 1 ng의 세균 지놈 DNA, 10 pmol 씩의 프라이머 쌍을 넣고 최종 반응 부피가 20 以가 되도록 멸균된 증류수를 넣고 PTC-100™ Programmable Thermal Controller (Model; PTC-100, MJ Research Inc. Watertown, MA, U.S.A)를이 용하여 중합효소연쇄 반응을 시 행 하였다. 이때 중합 효소 연쇄반응 조건은 다음과 같다.
- 3% L-arginine hydrochloride가 혼합된 배지 200 同에 접종하여 48 시간 동안 10% CO2가 공급되는 37P 세균 배양기에서 배양하였다. 여기에 20 闻의 Nessler solution(5% KI, 2% HgCh, IN NaOH)을 떨어트려 짙은 갈색을 띠면 양성( + ), 그렇지 않으면 음성 ㈠으로 판정하였다.
- 5(昭/ml) 한천배지에서 도말하고, 이를 상온의 공기 중에서 24시간 배양한 다음, 다시 3712의 Candle jar에서 48시간 배양하였다. 이때 성장한 세균 군락 중 그 형태가 다른 것을 다른 종으로 생각하고 각각에서 대표적으로 1개씩을 선별하여 3% 과산화수소를 분해할 수 있는 지를 검사하여 음성인 것만을 Todd Hewitt broth (TH broth, Difco, Lab., Detroit, MI. USA)에 접종하여 371 CO2 세균 배양기에서 키운 다음 15%가 되도록 glycero을 넣고 -70℃에서 보관하여 다음의 실험에 사용하였다.
- 94℃에서 2분간 초기 변성을 실시한 다음 94℃에서 1분간 변성, 55℃에서 1분간 annealing, 72t 에서 1분간 extension하는 과정을 27회 반복하여 증폭한 다음 마지막으로 720에서 10분간 extension하였다. 최종 반응물을 2 以씩 1.5% agarose gel에서 전기영동을 실시하여 그 증폭 여부를 확인하였다.
- 조사 대상으로 하였다. 환자의 나이, 성별 및 치아우식 경험지수(dft index)를 조사하고, 상하악 유전치 및 유대구치의 협면 및 설면에서 가압멸균된 큐렛을 이용하여 채취하였다. 각 개인에서 채취한 치면세균막은 500 间의 1XPBS가 넣어진 하나의 eppendorff tube에 담아 실험실로 옮겨 다음의 실험에 사용하였다.
대상 데이터
- 환자의 나이, 성별 및 치아우식 경험지수(dft index)를 조사하고, 상하악 유전치 및 유대구치의 협면 및 설면에서 가압멸균된 큐렛을 이용하여 채취하였다. 각 개인에서 채취한 치면세균막은 500 间의 1XPBS가 넣어진 하나의 eppendorff tube에 담아 실험실로 옮겨 다음의 실험에 사용하였다.
- 본 실험에 대조군으로 사용한 mutans streptococci는 Streptococcus mutans KCTC 3065, S. sobrinus KCTC 3088, S. downei KCTC 3634, S. rattus KCTC 3655 및 S. cricetus KCTC 3640이었으며 , 이들은 한국유전자은행 (KCTC, Daejeon, Korea)에서 구입하여 사용하였다. 위에서 채취한 치면세균막 샘플은 수 차례 vortexing한 후 멸균된 면봉을 이용하여 mutans streptococci를 선택적으로 배양할 수 있는 20% 자당이 함유된 mitis salivarius-bacitracin(MSB ; bacitracin 농도는 0.
- 본 연구에서 113명의 환자 중에서 mutans streptococci가 검출된 환자는 63명에 불과하였다. 이러한 이유는 내원한 아동이 잇솔질 등을 미리 하고 왔기 때문인 것으로 사료된다.
- sobrinus를 검출하기 위한 중합 효소 연쇄반응에 사용된 프라이머는 Table 2와 같다. 이들 프라이머는 바이오니아사(Bioneer Corp., Seoul, Koera)에 주문하여 제작하였다 . 중합효소연쇄반응은 AccuPower™ PCR Premix (Bioneer corp.
- 조선대학교 치과병원에 내원한 환자 중 12세 미만의 소아 113명을 조사 대상으로 하였다. 환자의 나이, 성별 및 치아우식 경험지수(dft index)를 조사하고, 상하악 유전치 및 유대구치의 협면 및 설면에서 가압멸균된 큐렛을 이용하여 채취하였다.
데이터처리
- 必test와 Student T test를 이용하여 각 종간의 유의성을 분석하고 사후 검증으로 ANOVA(Scheffe) test를 사용하였다.
이론/모형
- 검사를 시행하였다. 생물형의 판정 기준은 Shklair와 Keen""의 방법을 따랐다(Table 1).
성능/효과
- 1. 113명의 환자 중 40명의 치면세균막에서 40 균주의 mutans streptococci가 검줄되었다.
- 2. 40 균주의 mutans streptococci 중 생물형 제 I 형 (45%) 이 가장 많이 검출되었으며 , 그 다음으로 제 N형 (32.5%), 제 D 형(15%), 제 V형 (5%), 제 皿형(2.5%) 순으로 검출되었다.
- 3. 40 균주의 mutans streptococci를 중 특이 프라이머를 이용한 중합효소연쇄반응법에 의한 종 수준에서의 동정을 시도한 결과, 29 균주가 기존에 알려진 생물형과 종이 일치하였며 , 이 중 S. mutanse 69%, S. sobrinus는 31%였다.
- 4. Mutans streptococci 종 또는 생물형에 따른 환자의 치 아우 식경험 지수 간의 통계학적 유의성은 없었다(p>0.05).
- mutans 가 가장 높았으며 생물형으로는 제 I 형이 가장 빈번하게 검출되었다. 또한 이들과 치아우식경험지수간의 상관관계가 없는 것으로 조사되었으며, 이는 치아우식증이 세균학적 요소만이 아닌 기타 여러 원인 요소에 의해 발병된다는 여러 연구 결과와 일치함을 알 수 있었다.
- 05)(Table 4, 7), 이는 Kim 등”)의 결과와도 같았다. 또한, mutans streptococci의 종과 치아우식경험지수 간의 관계도 역시 유의한 차이는 보이지 않았다(Table 5). 이러한 결과는 치아우식증이 mutans streptococci 뿐만 아니라 사람의 타액 완충능, 타액의 점도, 타액의 분비량, 식이습관, 구강위생 관리능력 등 다른 여러 요인에 의해 영향을 받기 때문인 것으로 사료된다.
- 4)는 그렇지 않는 경우보다 낮게 나타났다(Table 6). 또한, 종 수준에서 동정이 된 29 균주들의 생물형에 따른 각각의 환자들의 치아우식 경험지수를 비교한 결과 표본수가 1개인 제 V형을 제외한 나머지 제 I형, 제 D형 및 제 N형에 따른 치아우식 경험지수의 차이는 보이지 않았다(Table 7)(p>0.05).
- 본 연구 결과 소아환자의 치면세균막에 존재하는 mutans streptococci 중 S. mutans 종의 발현 빈도가 S. sobrinus의발현 빈도보다 약 2.2배 정도 높았으며, 생물형으로는 제 I 형 (45%)과 제 N형(32%)이 대부분을 차지하는 것으로 조사되었다(Table 4, 5). 이러한 결과는 Kim 등项이 한국인의 소아에서 동일인의 구강 내에서 제 I 형이 59.
- 본 연구에 참여한 113명의 환자의 치면세균막 샘플을 mutans streptococci를 선택적으로 배양할 수 있는 20% 자당이 함유된 MSB 한천 배지에서 배양한 결과 63명의 환자 샘플에서 세균이 배양되었다. 이들 중 한 한천배지에서 세균 군락이 서로 다른 것 들 중 대표적인 것들을 선택하여 catalase test 결과 모두 음성임을 확인하고 본 연구의 결과를 얻는 데까지 보존된 균주는 총 68 균주였다.
- 본 연구에서 분리한 mutans streptococci 중 생물형 제 L형 (45%)이 가장 많이 검출되었으며 , 그 다음으로 제 N형 (32.5%), 제 I[형(15%), 제 V형(5%), 제 皿형(2.5%) 순으로 검출되었다(Table 3, 4). 생물형과 숙주의 치아우식 경험지수와의 관계에서는 생물형 제 I[형이 분리된 환자의 치아우식 경험지수가 가장 높았으며, 제 형, 제 V형 제 V형 제 II형을 가진 숙주일수록 낮게 나오는 경향을 보였다(Table 4).
- 본 연구에서는 그 분포가 희귀하다고 알려진项 생물형 제 皿형이 1 균주(ChDC 1163) 검출되었다. 이러한 제 皿형은 호 기성배양 시 mannit이로부터의 산생성이 억제되므로 다른 생물형과 구분이 가능하다고 알려져 있다囘 그러나 ChDC 1163 균주의 종 수준에서의 동정은 확실히 이루어지지 않았다.
- 5%) 순으로 검출되었다(Table 3, 4). 생물형과 숙주의 치아우식 경험지수와의 관계에서는 생물형 제 I[형이 분리된 환자의 치아우식 경험지수가 가장 높았으며, 제 형, 제 V형 제 V형 제 II형을 가진 숙주일수록 낮게 나오는 경향을 보였다(Table 4). 그러나 이들의 표준 편차 값이 크고, 표본수가 적기 때문에 통계학적 유의성을 검증하기는 어려웠다(p>0.
- 소아의 치면세균막에서 분리된 mutans streptococci 생물형과 치아우식경험지수 간에 유의한 차이는 보이지 않았으며 (p>0.05)(Table 4, 7), 이는 Kim 등”)의 결과와도 같았다. 또한, mutans streptococci의 종과 치아우식경험지수 간의 관계도 역시 유의한 차이는 보이지 않았다(Table 5).
- 이 연구에서 분리된 40균주의 mutans streptococci를 종-특이 프라이머를 이용한 중합효소연쇄반응법에 의한 종 수준에서의 동정을 시도한 결과, 29균주가 기존에 알려진 생물형과 종이 일치하였다(Table 3). 즉, 생물형 제 N형으로 조사된 ChDC 1025, ChDC 1051, ChDC 1054, ChDC 1164 균주들과, 제 II 형이라 조사된 ChDC 1139 균주, 그리고, 제 1 형인 ChDC 1143 균주 등은 두 가지 종-특이 프라이머에 의해 아무런 반응이 없었으며 , 제 I 형이라 조사된 ChDC 1111 균주, 제『형인 ChDC 1163 균주들은 두 가지 종■특이 프라이머에 의해 모두 반응물이 증폭되었다(Table 3).
- 이들의 생물형을 결정하기 위하여 생화학 검사를 실시한 결과, 40 균주만이 mutans streptococci임을 알 수 있었다(Table 3). 이들 40 균주는 각각의 균주가 40명 (남아 20명, 여아 20명)에서 유래된 것으로 1명당 한 종류의 mutans streptococci0] 검출되었다(Table 3). 즉, 본연구에서는 연구 대상 환자의 치면세균막에서 35.
- 세균이 배양되었다. 이들 중 한 한천배지에서 세균 군락이 서로 다른 것 들 중 대표적인 것들을 선택하여 catalase test 결과 모두 음성임을 확인하고 본 연구의 결과를 얻는 데까지 보존된 균주는 총 68 균주였다. 이들의 생물형을 결정하기 위하여 생화학 검사를 실시한 결과, 40 균주만이 mutans streptococci임을 알 수 있었다(Table 3).
- 이들 중 한 한천배지에서 세균 군락이 서로 다른 것 들 중 대표적인 것들을 선택하여 catalase test 결과 모두 음성임을 확인하고 본 연구의 결과를 얻는 데까지 보존된 균주는 총 68 균주였다. 이들의 생물형을 결정하기 위하여 생화학 검사를 실시한 결과, 40 균주만이 mutans streptococci임을 알 수 있었다(Table 3). 이들 40 균주는 각각의 균주가 40명 (남아 20명, 여아 20명)에서 유래된 것으로 1명당 한 종류의 mutans streptococci0] 검출되었다(Table 3).
- 또한 이와는 반대로두 가지 종■특이 프라이머 모두에 반응을 하지 않은 균주도 6 균주 존재하였다(Table 3). 이러한 결과는 첫째 본 연구에서 사용된 종■특이 프라이머의 특이성이 떨어지거나, 둘째 한국인에서 분리되는 mutans streptococci의 dextranase 유전자 핵산 염기서열이 기존에 알려진 다른 인종에서 분리된 균주들과 상이하거나, 셋째 생물형이 mutans streptococci와 같지만, 다른 그룹의 연쇄상구균이 분리되었기 때문일 것으로 생각된다. 첫번째 및 두번째가 원인인 경우 dextranase 유전자 이외의 다른 유전자를 표적으로 해서 다시 프라이머를 설계하거나, 한국인에서 분리된 mutans streptococci의 dextranase 유전자를 클로닝 하여 핵산염기서열을 밝혀서 다시 종-특이 프라이머를 설계해야 할 것이고, 세번째가 원인일 경우 각각의 균주들을 16S rDNA 핵산염기서열법을 이용하여 재동정하여야 할 것으로 생각된다.
- 이상의 결과를 종합하여 볼때, 한국인의 소아의 구강 내에 존재하는 mutans streptococci 종의 발현빈도는 S. mutans 가 가장 높았으며 생물형으로는 제 I 형이 가장 빈번하게 검출되었다. 또한 이들과 치아우식경험지수간의 상관관계가 없는 것으로 조사되었으며, 이는 치아우식증이 세균학적 요소만이 아닌 기타 여러 원인 요소에 의해 발병된다는 여러 연구 결과와 일치함을 알 수 있었다.
- sobrinus특이 프라이머만 반응하였다(Table 3). 이와 같이 생물형과 종의 관계가 일치하지 않은 11 균주는 S. mutans 및 S. sobrinus 종에서 제외하여 실험결과를 분석한 결과, S. mu£ans(69%)가 S. sobrinus(31%)보다 발현 빈도가 2.2배 정도 높았다 (Table 5). 그러나 두 종의 존재에 의한 치아우식 경험지수에는 차이가 거의 없었다(Table 5).
- 이들 40 균주는 각각의 균주가 40명 (남아 20명, 여아 20명)에서 유래된 것으로 1명당 한 종류의 mutans streptococci0] 검출되었다(Table 3). 즉, 본연구에서는 연구 대상 환자의 치면세균막에서 35.4%라는 낮은 분리 빈도를 보였다. 이러한 40명 환자의 연령은 2년 3개월에서 9년 7개월까지 다양하였으며, 이들의 평균 연령은 4년 3개월이었다.
- 일치하였다(Table 3). 즉, 생물형 제 N형으로 조사된 ChDC 1025, ChDC 1051, ChDC 1054, ChDC 1164 균주들과, 제 II 형이라 조사된 ChDC 1139 균주, 그리고, 제 1 형인 ChDC 1143 균주 등은 두 가지 종-특이 프라이머에 의해 아무런 반응이 없었으며 , 제 I 형이라 조사된 ChDC 1111 균주, 제『형인 ChDC 1163 균주들은 두 가지 종■특이 프라이머에 의해 모두 반응물이 증폭되었다(Table 3). 또한, 제 I형인 ChDC 1183, ChDC 1044 균주와 제 V형인 ChDC 1136균주 들은 중합효소연쇄반응 결과 예상과는 반대로 S.
- 이러한 결과는 치아우식증이 mutans streptococci 뿐만 아니라 사람의 타액 완충능, 타액의 점도, 타액의 분비량, 식이습관, 구강위생 관리능력 등 다른 여러 요인에 의해 영향을 받기 때문인 것으로 사료된다. 하지만, 생물형으로는 mutans streptococci이지만, 본 연구에서 이용한 중합효소연쇄반응법으로는 종 수준에서 동정이 안된 11 균주를 갖고 있는 소아의 치아우식경험지수는 2.5 정도더 낮게 나왔다(Table 6). 이러한 결과는 이들 11 균주가 mutans streptococci가 아닐 경우도 있다는 것을 내포하고, 이럴 경우, mutans streptococci가 검출되지 않은 환자는 치아우식증이 발병할 가능성이 낮다는 것을 의미하기도 한다.
후속연구
- 실제로 환자의 치면세균막으로부터 샘플을 채취할 때 치면 세균막이 거의 보이지 않았던 것들도 존재하였다. 그 외 또다른 요인으로 샘플링 후 실험실로 옮겨진 시간이 길어서 회복율이 떨어졌을 가능성도 있을 것으로 사료된다. 또한 최근의 보고에 의하면, 본연구에서 사용한 MSB 선택배지가 S.
- sobrinus의 성장을 억제하는 보고도 있다攻 본 연구에서도 지속적인 계대배양을 하면 회복되지 않고 소실되는 균주들도 존재하였다. 그러므로 mutans streptococci의 성장을 억제하지 않고 선택적으로 배양할 수 있는 배지의 개발이 앞으로의 역학조사를 위해서는 필요하리라 생각된다.
- 이러한 결과는 첫째 본 연구에서 사용된 종■특이 프라이머의 특이성이 떨어지거나, 둘째 한국인에서 분리되는 mutans streptococci의 dextranase 유전자 핵산 염기서열이 기존에 알려진 다른 인종에서 분리된 균주들과 상이하거나, 셋째 생물형이 mutans streptococci와 같지만, 다른 그룹의 연쇄상구균이 분리되었기 때문일 것으로 생각된다. 첫번째 및 두번째가 원인인 경우 dextranase 유전자 이외의 다른 유전자를 표적으로 해서 다시 프라이머를 설계하거나, 한국인에서 분리된 mutans streptococci의 dextranase 유전자를 클로닝 하여 핵산염기서열을 밝혀서 다시 종-특이 프라이머를 설계해야 할 것이고, 세번째가 원인일 경우 각각의 균주들을 16S rDNA 핵산염기서열법을 이용하여 재동정하여야 할 것으로 생각된다.
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