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문제 정의
- 본 연구는 붓꽃속 식물의 형태적 특성 조사와 RAPD 분석을 통해 유전적 다양성과 근연성을 밝히고 유전자 도입을 위한 기초적인 자료를 얻기 위하여 실시하였다. RAPD를 이용하여 국내에서 수집한 자생붓꽃종의 DNA 다형성을 조사한 결과 40 개의 primer중 8개의 유용한 primer가 선발되었고 이들 primer는 108 개의 밴드를 나타내었다.
- 본 실험은 국내에서 자생되고 있는 붓꽃속 식물을 수집하여 형태적인 생육 특성을 조사하고 RAPD 분석을 통하여 유전적인 다양성과 계통간 근연성을 분석하여 붓꽃 유전자원의 평가와 선발을 위한 기초자료를 얻고자 수행하였다.
제안 방법
- 붓꽃의 DNA 분리는 Brunel (1992) 등의 방법을 변형하여 이용하였다. 유엽 1g을 채취하여 1.
- PCR 반응은 Perkin Elmer DNA thermal cycler 2400을 사용하였고, RAPD를 위한 PCR 반응은 pre-denaturation 94℃ 5분, 1 cycle 후, denaturation 94℃ 1분, annealing 35℃ 2분, extension 72℃ 2분 30초로 총 40 cycle을 시행하였으며 postextensione 72℃ 에서 10분 동안 수행하였다. 증폭된 DNA는 EtBr 존재하에 1.
- 72℃ 에서 10분 동안 수행하였다. 증폭된 DNA는 EtBr 존재하에 1.2% Agarose gel에서 전기영동 후 반응물은 UV광선하에서 사진 촬영하여 분석에 사용하였다.
- PCR 결과 얻어진 밴드는 모든 붓꽃 수집종에 대하여 존재하는 polymorphic 밴드의 유무에 의해 계산하였다. 수집 종간의 비유사도(dissimilarity(l-SJ))는 Jaccard's coefficient [SJ=w/(w+x+y)]를 기초로 하여 두 수집종 (A, B)에 모두positive (존재하는 밴드)한 것을 w, A 만 positive하고 B는 negative (존재하지 않는 밴드)한 것을 x, A는 negative 하고 B만 positive한 것을 y로 하였다 (Rickwood and Hames 1993).
- 0 kb이하로써 작게 나타났다 다형성은 agarose gel상의 밴드의 유무로 판정하였으며 유연 관계를 밝히기 위하여 Jaccard's coefficient(SJ)에 의해 비유 사도(1-SJ)를 구하였다. 1-SJ에 의한 RAPD 분석은 108 개의 다형성 밴드를 사용하였으며, 각 수집종간에 유연관계를 비교하기 위한 비유사도는 Phentree의 Nearest Neighbor Program에 의한 dendrogram 작성에 사용하였다. 평균적인 비유사도는 0.
대상 데이터
- 공시재료는 전국각지에서 자생하고 있는 붓꽃속 식물을 15개 장소에서 수집하여 교내 포장에 재식하였으며 수집종 중에서 9 종을 공시재료로 하여 개화일, 화경장, 엽장, 엽폭, 삭과장, 외화피장, 화색에 대하여 조사하였다. 각 수집종의 형태적 특성 조사는 종별 10 개체를 조사하고 평균과 표준편차로 나타냈으며 조사방법은 농촌진흥청 조사기준에 준하였다.
- 로부터 구입한 random primer를 사용하였다. Primer 선발에 의하여 총 40개의 primer들 중 polymorphism이 나타나지 않는 primer를 제외한 8종류의 primer를 선발하였다 (Table 1).
데이터처리
- 수집 종간의 비유사도(dissimilarity(l-SJ))는 Jaccard's coefficient [SJ=w/(w+x+y)]를 기초로 하여 두 수집종 (A, B)에 모두positive (존재하는 밴드)한 것을 w, A 만 positive하고 B는 negative (존재하지 않는 밴드)한 것을 x, A는 negative 하고 B만 positive한 것을 y로 하였다 (Rickwood and Hames 1993). Dendrogram 작성을 위한 통계적 분석은 Dissimilarity matrix 법에 기초한 Phentreenearest neighbor program을 사용하여 분석하였다.
- Figure 1과 Figure 2에서 보는 바와 같이 증폭된 DNA 단편의 크기는 대부분 2.0 kb이하로써 작게 나타났다 다형성은 agarose gel상의 밴드의 유무로 판정하였으며 유연 관계를 밝히기 위하여 Jaccard's coefficient(SJ)에 의해 비유 사도(1-SJ)를 구하였다. 1-SJ에 의한 RAPD 분석은 108 개의 다형성 밴드를 사용하였으며, 각 수집종간에 유연관계를 비교하기 위한 비유사도는 Phentree의 Nearest Neighbor Program에 의한 dendrogram 작성에 사용하였다.
이론/모형
- 외화피장, 화색에 대하여 조사하였다. 각 수집종의 형태적 특성 조사는 종별 10 개체를 조사하고 평균과 표준편차로 나타냈으며 조사방법은 농촌진흥청 조사기준에 준하였다.
- 수집 종간의 비유사도(dissimilarity(l-SJ))는 Jaccard's coefficient [SJ=w/(w+x+y)]를 기초로 하여 두 수집종 (A, B)에 모두positive (존재하는 밴드)한 것을 w, A 만 positive하고 B는 negative (존재하지 않는 밴드)한 것을 x, A는 negative 하고 B만 positive한 것을 y로 하였다 (Rickwood and Hames 1993). Dendrogram 작성을 위한 통계적 분석은 Dissimilarity matrix 법에 기초한 Phentreenearest neighbor program을 사용하여 분석하였다.
성능/효과
- 기초적인 자료를 얻기 위하여 실시하였다. RAPD를 이용하여 국내에서 수집한 자생붓꽃종의 DNA 다형성을 조사한 결과 40 개의 primer중 8개의 유용한 primer가 선발되었고 이들 primer는 108 개의 밴드를 나타내었다. 이들 중 다형성 밴드는 107 개였다.
- mssii)이 4월 22일 가장 일찍 개화하기 시작하였으며, 꽃창포는 6월 9 일로 가장 늦게 개화하였다. 개화시기가 빠른 노랑무늬붓꽃, 각시붓꽃과 금붓꽃은 다른 종들에 비해 화경, 엽장, 엽폭, 삭과장이 작게 나타났다. 엽장은 노랑꽃창포가 가장 길었으며 꽃창포는 82 cm로 나타났으며 한국 특산종인 노랑무늬붓꽃은 각시붓꽃과 같이 28 cm로 나타났다.
- 꽃창포의 경우에 있어서는 자생지가 다른 태백산과 봉화 종의 외화피장으로 본 생육 특성은 차이를 보였다. 꽃의 형태는 외화피 3 장과 내화피 3 장으로 구분되며 꽃의 크기는 꽃창포가 가장 컸으며 제비붓꽃, 연미붓꽃, 노랑 꽃창포, 타래붓꽃, 붓꽃, 각시붓꽃, 노랑무늬붓꽃 금붓꽃 순으로 나타났다. 개화수정 후에 성숙된 삭과장의 크기는 타래붓꽃이 가장 길었고, 꽃창포는 3 cm 내외로 원형에 가까운 둥근형으로 나타나 삭과장의 형태가 종에 따라 상이하게 나타났다.
- 국내 자생지에서 수집한 붓꽃 9 종과 8 개의 primer를 이용하여 PCR한 결과 증폭된 총 밴드수는 108 개가 관찰되었으며 각 primer마다 증폭된 밴드수는 11 개에서 17 개까지 나타났으며 primer당 나타난 평균 밴드 수는 13.5 개였다. 증폭된 밴드에 의해 나타난 종간의 다양성은 99%로 나타났으며 이와 같은 결과는 RAPD를 이용한 마늘의 유연관계분석 (Leeet al.
- 5 개였다. 증폭된 밴드에 의해 나타난 종간의 다양성은 99%로 나타났으며 이와 같은 결과는 RAPD를 이용한 마늘의 유연관계분석 (Leeet al. 1996)과 PCR 기술을 이용한 산마늘의 종내변이 (Kimetal. 1997)와 RAPD법을 이용한 수박의 유전변이 탐색 (Shin et al. 1996), 증폭된 DNA 다변성에 의한 삼지구엽초의 종내변이(Yoo et al. 1997)와 비교해 볼 때 다양한 종간의 변화 양상을 알 수 있고, RAPD를 이용한 마늘의 유연 관계분석 (Lee et al. 1996)과 RAPD 방법을 이용한 구기자의 분류 및 동정 (Park 1996)에서 나타난 속간 분석의 밴드 양상보다 훨씬 다양함을 알 수 있다. Primer 8 종류로 10 개의 total genomic 붓꽃 DNA 를 PCR로 증폭하여 얻어진 밴드의 다양한 패턴에서 (Figure 1,2) primer 2는 Lane 1과 3, lanes 11과 15에서 유사한 밴드패턴을 볼 수 있었고, primer 3은 lane 6 과 15, primer 4는 lane 1 과 3, primer 6은 lane 1 과, 3, primer 7은 lane 3과 7, primer 11은 lane 2와 4, primer 14은 lane 1 과, 3, lane 2와 4, lane 11과 15에서 유사한 밴드가 2개 이상 2.
- 1996)과 RAPD 방법을 이용한 구기자의 분류 및 동정 (Park 1996)에서 나타난 속간 분석의 밴드 양상보다 훨씬 다양함을 알 수 있다. Primer 8 종류로 10 개의 total genomic 붓꽃 DNA 를 PCR로 증폭하여 얻어진 밴드의 다양한 패턴에서 (Figure 1,2) primer 2는 Lane 1과 3, lanes 11과 15에서 유사한 밴드패턴을 볼 수 있었고, primer 3은 lane 6 과 15, primer 4는 lane 1 과 3, primer 6은 lane 1 과, 3, primer 7은 lane 3과 7, primer 11은 lane 2와 4, primer 14은 lane 1 과, 3, lane 2와 4, lane 11과 15에서 유사한 밴드가 2개 이상 2.0 kb이하에서 다양하게 나타났다. 유사한 밴드의 유무와 형태적인 생육 특성을 함께 고려해보았을 때, primer 2.
- 1-SJ에 의한 RAPD 분석은 108 개의 다형성 밴드를 사용하였으며, 각 수집종간에 유연관계를 비교하기 위한 비유사도는 Phentree의 Nearest Neighbor Program에 의한 dendrogram 작성에 사용하였다. 평균적인 비유사도는 0.252 로 나타났으며, 각 수집종간의 비유사도는 0.095 에서 0.699로 다양하게 나타났다. 가장 낮은 비유사정도는 노랑꽃창포와 노랑무늬붓꽃간의 0.
- Ⅰ 군에는 연미붓꽃, Ⅱ 군에는 타래붓꽃, 제비붓꽃, 노랑꽃창포, 노랑무늬붓꽃이 속하였고, Ⅲ 군에는 금붓꽃, 각시붓꽃, 꽃창포, 붓꽃으로 나타났다. 이상의 RAPD 분석의 결과로 수집된 붓꽃의 유전적 연관 관계를 규명할 수 있었다.
후속연구
- 본 실험의 결과 붓꽃 개량에 있어 자생 붓꽃 유전자원의 다양한 정보는 매우 중요하며 종간의 유전적 평가는 새로운 유전자 도입을 위한 기초자료로 활용될 수 있다. 또한 본 실험을 기초로 종간 교잡의 결과 F1 식물에서 나타나는 유전적 변이 양상의 연구로써 모본과 부본의 유전적 특성을 가지는 새로운 표지인자를 찾을 수가 있을 것으로 생각되었다.
- 도입을 위한 기초자료로 활용될 수 있다. 또한 본 실험을 기초로 종간 교잡의 결과 F1 식물에서 나타나는 유전적 변이 양상의 연구로써 모본과 부본의 유전적 특성을 가지는 새로운 표지인자를 찾을 수가 있을 것으로 생각되었다.
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