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문제 정의
- 갈근(Radix puerariae, 15%)과 죽력 (Ckfizse in Liquamen Phyllostachyos, 1%)을 함유한 음료가 알코올을 투여한 생쥐에 미 치는 영향을 구명 하고자 하였다. 대조군은 생쥐 에 대조군은 생 쥐 에 알코올(40% alcohol, 8.
가설 설정
- 3)NS: not significant compared with control group.
제안 방법
- 핵 분핵을 제거하기 위해 4℃에서 2,000xg로 5분 동안 원심분리하였으며, 다시 4℃의 22, 000Xg에서 30분 동안 원심분리하여 세포질 분획과 미토콘드리 아 분획 으로 분리 하였다. 16, 000 X g에서 10분 동안 원심분리하여 순수 CuZnSOD를 얻었으며, 이 조효소액을 단백질 분석 에 이용하였다. 미토콘드리 아에 분포하는 Mn SOD를 얻기 위해 전단계에서의 pellet에 50 mM phosphate buffer (pH 7.
- 0 mL씩 첨가하고 실온에서 20분간 방치 한 다음 NaOH를 넣어 반응을 중지 시 켰다. 30분 후에 505 nm에서 증류수를 맹 검으로 하여 표준액, 검액 및 대조군의 흡광도를 측정하여 표준액의 검량 곡선으로부터 효소의 활성단위를 환산하여 비교 관찰하였다.
- 실험 1군Exp.De 음료(8.0 mL/kg B.W.)를 투여 한 다음 1시간 간격으로 2회에 걸쳐 대조군과 동일량의 알코올을 투여하고 1시간 후에 채혈과 조직 적출을 하였다. 실험 2군(Exp.
- 적 출한 조직 을 4%의 paraformaldehyde를 사용하여 24시간 동안 고정시킨 다음, paraffin으로 포매한 후 microtome을 사용하여 5 Um 두께로 절편을 제작하였匸}. Periodic-acid Schiff (PAS) 염색을 한 다음 통상적인 방법에 따라 표본을 제작하여 카메라현미 경 (Olympus BX51TF, Japan)을 이용하여 사진을 촬영하였다. 전자현미경 관찰을 위하여 광학현미경 시료와 동일한 부위의 조직을 절취하여 전고정액 속에서 1 mm3 크기로 세절한 후 2.
- 갈근과 죽력을 주 원료로 한 숙취해소 음료의 안전성과 숙취 해소 효능을 구명 하기 위 하여, 생 쥐 가 알코올을 섭 취 하기 전과 후에 음료를 투여한 후 알코올 농도, ALT와 AST의 변화, 간세포의 SOD 활성, 조직학적 및 전자현미경을 통한 미세구조의 변화를 관찰하였다.
- 45 xlO'3 M NBT< 포함한 용액 에서 알루미 늄 호일을 덮어 계속 흔들어 주면서 20분 동안 염색하였다. 다시 젤은 0.05 M KH2PO4(pH 7.8), 1 x IO-4 M EDTA, 0.028 M TEMED, 2.8XlO-5 M 리보플라빈 용액에서 15분동안 2차 염색한 후 15W 형광램프 하에서 단백질 band를 확인하였으며, 그 결과는 densitometerdmageMaster VDS, Pharmacia)를 이용하여 상대적인 밀도를 pixel수의 차이를 통하여 비교분석하였다.
- 미 치는 영향을 구명 하고자 하였다. 대조군은 생쥐 에 대조군은 생 쥐 에 알코올(40% alcohol, 8.0 mL/kg)을 단독 투여 하였으며, 실험 1군은 숙취해소음료(8.0 mL/kg)를 투여한 다음 알코올을 투여하였고, 실험 2군은 알코올을 투여한 다음 동일 음료를 투여 하였다. 실험 1군과 실험 2군의 알코올 농도는 대조군에 비하여 각각 유의 성 있게 감소하였다.
- 대조군은 생쥐에 알코올(40%, 8.0 mL/kg B.W.)을 1시간 간격 으로 2회 투여 한 다음 1시간 후 동일량의 증류수를 투여하였으며, 다시 1시간이 경과한 후에 채혈하고 간 조직을 적출하였다. 실험 1군Exp.
- 생쥐를 마취하여 채혈한 다음 alanine aminotransferase (ALT)와 aspartate aminotransferase(AST) 활성도의 측정은 kit시 약을 사용하여 측정하였다. AST 또는 ALT 기질을 1 mL씩 시험관에 넣고 37℃에서 5분간 배양한 후 증류수로 10배 희석한 혈청 0.
- )를 투여 한 다음 1시간 간격으로 2회에 걸쳐 대조군과 동일량의 알코올을 투여하고 1시간 후에 채혈과 조직 적출을 하였다. 실험 2군(Exp.2)은 대조군(Con)과 동일한 방법으로 알코올(40%, 8.0 mL/kg BW)을 2회 투여 한 다음 1시간 후에 음료(8.0 mL/ kg BW)를 투여하였다.
- 포매된 조직들을 LKB-V 형 ultramicrotome을 사용 1 11m 두께로 절편을 제작하여 1% toluidine blue로 hot plate (60℃)상에서 염색하였다. 염색된 시료를 광학현미경으로 관찰하여 조직을 확인한 다음 동일한 부위에서 60 nm 두께로초박절편을 제작하여 silver grid에 부착하였고, uranyle acetate-^ lead citrate로 이 중 염 색한 다음 Hitachi H-7600 투과형 전자현미경(80 KV)으로 관찰하였다.
- Periodic-acid Schiff (PAS) 염색을 한 다음 통상적인 방법에 따라 표본을 제작하여 카메라현미 경 (Olympus BX51TF, Japan)을 이용하여 사진을 촬영하였다. 전자현미경 관찰을 위하여 광학현미경 시료와 동일한 부위의 조직을 절취하여 전고정액 속에서 1 mm3 크기로 세절한 후 2.5% glutaraldehyde(phosphate buffer, pH 7.4)로 2시간 동안 전고정 하였다. 전고정 이 끝난 조직은 동일 완충액을 사용 10분 간격으로 3회 세척한 후 1% osmium tetroxide(OsO4)로 2시간 후 고정 한 다음 동일 완충액으로 3회 세 척 하였다.
- 간 조직 의 PAS 반응은 대조군에 비하여 실험 1군과 실험 2군에서 높게 나타났다. 전자현미경을 통한 미세구조적 관찰 결과실험 1군과 실험 2군에 비하여 대조군에서 세포소기관의 손상 정도가 심 하였다. 이상의 결과로 보아 갈근과 죽력을 함유한 기능성 음료는 숙취 해소에 안전하고 효과적으로 사용할 수 있을 것이다.
- 학현미경 관찰을 위하여 생쥐의 간 조직을 적출하였다. 적 출한 조직 을 4%의 paraformaldehyde를 사용하여 24시간 동안 고정시킨 다음, paraffin으로 포매한 후 microtome을 사용하여 5 Um 두께로 절편을 제작하였匸}.
대상 데이터
- 체 중 25 g내 외 의 웅성 생 쥐 (ICR strain) 8주령 을 다물 사이언스(주)로부터 구입 한 후 한의 과대학 동물사육실에서 2주간 적응시킨 후 실험에 사용하였다.
데이터처리
- 실험 결과에 대한 통계는 SAS(Statistical Analysis System) 프로그램에 의하여 각 실험군 별로 평균값과 표준오차를 계산하였고 p<0.05 수준에서 유의성을 검증하였다.
이론/모형
- 1 mM EDTA 용액 1 mL를 첨 가하여 부유시 킨 다음 4℃에서 22,000xg로 30분 동안 원심 분리 하여 상층액 만을 분리 한 후 다시 80, 000 X g로 30분간 원심분리하여 순수한 MnSOD를 얻었다. 단백질 정 량은 Bio-Rad assay를 이용하였으며, -70℃의 deep freezer에 보관하면서 실험에 이용하였다.
- 대조군과 실험군 각각의 생쥐로부터 간 조직을 신속히 분리 하여 각각의 간 조직으로부터 동일량을 절취 하여 혼합한 다음 Beauchamp와 Fridovich(17)방법에 따라 SOD를 추출하였다. 채취된 간조직은 0.
성능/효과
- 1). Cu, Zn-SOD의 활성은 실험 1군에서는 대조군에 비하여 약 22% 증가하였으나, 실험 2군에서는 약 14% 감소하였다(Fig. 2). Mn-SOD의 활성 이대 조군에 비하여 실험 군에서 약 70%이상 증가한 것으로 보아 간세포의 미토콘드리아의 보호에 관여하였을 것으로 사료되 었다.
- 2). Mn-SOD의 활성 이대 조군에 비하여 실험 군에서 약 70%이상 증가한 것으로 보아 간세포의 미토콘드리아의 보호에 관여하였을 것으로 사료되 었다.
- 간 조직의 지방간 이영양증은 질병, 독소, 약물등에 의해서 나타나며, 임상적으로는 과음, 당뇨, 비만 등과 관련성이 있다고 하였다(23). 본 실험 결과대조군 생쥐 간의 중심정맥 주위의 간 조직은 PAS에 미 약한 반응을 보였으며 (Fig. 3A), 실험 1군 (Fig. 3B)과 실험 2군(Fig. 3C)에서는 중심 정 맥 주변 에서 매우 높은 PAS 양성반응을 보여주었다. 전자현미경관찰 결과대조군의 간세포는 핵의 핵막이 둥글고 핵질은 발달해 있었다.
- 활성은 감소한다(7). 본 실험에서는 대조군과 실험군 사이에 ALT 활성 의 차이는 없었다. AST는 대조군에 비하여 실험 1군과 실험 2군 모두에서 다소 높게 나타났으나 유의성은 없는 것으로 보아(Table 2) 음료의 독성은 없는 것으로 사료되었으나, 숙취해소와 더불어 간을 보호하는 효과를 얻기 위해서는 앞으로 갈근과 죽력의 투여 량과 배합 비율에 대한 연구가 진행되어야 할 것으로 생각된다.
- 갈근과 갈화의 물 추출물은 알코올을 투여한 흰 쥐의 간에서 Cu, Zn-SOD와 cat- alase의 활성은 증가시 키어 간을 보호한다고 하였다(15). 본 연구 결과 갈근과 죽력을 함유한 음료를 투여한 결과, 실험 1군에서 Mn-SOD의 활성은 대조군에 비하여 약 70%, 실험 2군은 약 73% 증가하였다(Fig. 1). Cu, Zn-SOD의 활성은 실험 1군에서는 대조군에 비하여 약 22% 증가하였으나, 실험 2군에서는 약 14% 감소하였다(Fig.
- 더 낮게 나타났다고 하였다(1, 13, 21). 본 연구 결과 생쥐의 혈액 내 알코올 농도는 대조군에 비하여 실험군에서 보다 낮게 나타났는데 특히 실험 2군의 혈중 알코올농도가 17% 낮게 나타났다(Table 1). 이와 같은 결과는 숙취 해소 효능이 있는 갈근과 혈액의 순행을 상승시켜 주는 죽력의 작용으로 사료되었다.
- 본 연구자들은 선행 연구를 통하여 갈근 추출액과 죽력 이 혈중 알코올 농도를 감소시킴을 확인한 바 있다(13). 알코올의 과량 섭 취 또는 중독에 따른 간 손상의 병 원성 기 작을 밝히 기 위하여 알코올을 장기 적으로 투여 한 쥐 에 비 타민 E(14)나 갈근과 갈화(15)를 투여한 결과 SOD의 활성이 증가되 었으며 지질과산화는 감소하였다.
- 3C)에서는 중심 정 맥 주변 에서 매우 높은 PAS 양성반응을 보여주었다. 전자현미경관찰 결과대조군의 간세포는 핵의 핵막이 둥글고 핵질은 발달해 있었다. 세포질에서는 전자밀도가 비교적 낮은 커다란 지방방울들과 전자밀도가 높은 용해소체들이 다수 관찰되었다.
후속연구
- 본 실험에서는 대조군과 실험군 사이에 ALT 활성 의 차이는 없었다. AST는 대조군에 비하여 실험 1군과 실험 2군 모두에서 다소 높게 나타났으나 유의성은 없는 것으로 보아(Table 2) 음료의 독성은 없는 것으로 사료되었으나, 숙취해소와 더불어 간을 보호하는 효과를 얻기 위해서는 앞으로 갈근과 죽력의 투여 량과 배합 비율에 대한 연구가 진행되어야 할 것으로 생각된다.
- 전자현미경을 통한 미세구조적 관찰 결과실험 1군과 실험 2군에 비하여 대조군에서 세포소기관의 손상 정도가 심 하였다. 이상의 결과로 보아 갈근과 죽력을 함유한 기능성 음료는 숙취 해소에 안전하고 효과적으로 사용할 수 있을 것이다.
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