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문제 정의
- 본 연구는 어성초 열수 추출물과 연잎 열수 추출물, 녹차씨 70% 에탄올 추출물의 혼합물(MIX)을 대상으로 in vivo에서 급성 에탄올 투여 후 시간 경과에 따른 혈중 에탄올 및 아세트알데히드 농도를 평가하고, 에탄올과 아세트알데히드를 기질로 하는 간 조직의 alcohol dehydrogenase(ADH)와 acetaldehyde dehydrogenase(ALDH) 활성을 평가하여 급성 알코올 섭취에 따른 생화학적 숙취해소 활성을 검증하고자 하였다. 더하여 MIX의 직접적인 ADH 및 ALDH 활성에 미치는 영향을 S9 rat liver fraction 효소원을 활용한 assay로 평가하였다.
- 어성초 열수 추출물, 연잎 열수 추출물, 녹차씨 70% 에탄올 추출물의 혼합물인 MIX가 흰쥐에서 에탄올 투여에 따른 혈중 에탄올 및 아세트알데히드 농도와 에탄올 대사 효소들에 작용하는 효과와 직접적인 에탄올 대사 효소 활성에 미치는 영향을 확인하여 신규 숙취해소 소재로서 MIX의 활용 가능성을 연구하였다. 급성 에탄올을 투여한 EtOH군과 MIX-200군은 혈중 에탄올 농도가 에탄올을 투여하지 않은 NC군보다 높게 나타났고, MIX-200군은 EtOH군에 비교해 혈중 에탄올 농도가 에탄올 투여 3시간부터 감소하였고, 혈중 아세트알데히드의 농도는 에탄올 투여 1시간 이후부터 감소하였다.
제안 방법
- 실험기간 동안 물과 사료는 제한 없이 공급하였다. 1주일 동안 사육환경에 적응시킨 후 3그룹으로 8마리씩 동일한 체중 평균을 갖는 정상대조군(NC), 에탄올군(EtOH), 혼합물투여군(MIX-200)으로 나누었다. 사료 섭취로 인한 위장관의 에탄올 흡수 방해를 막기 위해 시료 및 에탄올 투여 전 18시간 동안 절식시켰다.
- ADH 활성은 증류수, 1.0 M trisHCl buffer(pH 8.8), 20 mM NAD+, 에탄올로 제조한 반응액 250 μL와 150 μg/mL MIX 20 μL를 혼합하고 효소원 S9 rat liver fraction을 30 μL 처리하여 30℃에서 5분간 preincubation 한 후, 340 nm에서 5분간 흡광도의 변화를 측정하였다.
- 사료 섭취로 인한 위장관의 에탄올 흡수 방해를 막기 위해 시료 및 에탄올 투여 전 18시간 동안 절식시켰다. NC군과 EtOH군은 멸균한 증류수를 경구투여 하였고, MIX-200군은 멸균한 증류수에 MIX(200 mg/kg body weight/d)를 준비하여 경구투여 하였다. 멸균 증류수와 MIX를 경구투여 하고 30분이 경과한 후, NC군은 멸균 증류수를 경구투여 하였고, EtOH군과 MIX군은 Jeon 등(11)과 Lee 등(12)이 보고한 바 있는 25% 에탄올(3 g/kg body weight/d)을 10 mL/kg으로 경구투여 하였다.
- , Darmstadt, Germany)을 사용하여 분광광도계(BioTek, Winooski, VT, USA)를 이용하여 측정하였다. 각 군의 에탄올 및 아세트알데히드 함량은 kit에 제시한 계산식을 이용하여 계산하였고, 각 군의 데이터는 EtOH군 1시간의 혈청 에탄올 및 아세트알데히드 함량을 기준으로 한 상대 활성(%)으로 제시하였다.
- 4)를 가하고 빙냉하에서 유리-테프론 분쇄기로 균질화하여 준비하였다. 간조직 균질액의 ADH와 ALDH 활성은 NAD+ 환원에 따른 NADH 생성량을 비색정량하여 측정하는 방법으로 제조된 assay kit(Biovision, Mountain View, CA, USA)을 사용하여 측정하였고, 각 kit에서 제시한 계산식을 이용하여 nmol/min/mL로 제시하였다.
- 본 연구는 어성초 열수 추출물과 연잎 열수 추출물, 녹차씨 70% 에탄올 추출물의 혼합물(MIX)을 대상으로 in vivo에서 급성 에탄올 투여 후 시간 경과에 따른 혈중 에탄올 및 아세트알데히드 농도를 평가하고, 에탄올과 아세트알데히드를 기질로 하는 간 조직의 alcohol dehydrogenase(ADH)와 acetaldehyde dehydrogenase(ALDH) 활성을 평가하여 급성 알코올 섭취에 따른 생화학적 숙취해소 활성을 검증하고자 하였다. 더하여 MIX의 직접적인 ADH 및 ALDH 활성에 미치는 영향을 S9 rat liver fraction 효소원을 활용한 assay로 평가하였다.
- NC군과 EtOH군은 멸균한 증류수를 경구투여 하였고, MIX-200군은 멸균한 증류수에 MIX(200 mg/kg body weight/d)를 준비하여 경구투여 하였다. 멸균 증류수와 MIX를 경구투여 하고 30분이 경과한 후, NC군은 멸균 증류수를 경구투여 하였고, EtOH군과 MIX군은 Jeon 등(11)과 Lee 등(12)이 보고한 바 있는 25% 에탄올(3 g/kg body weight/d)을 10 mL/kg으로 경구투여 하였다. 에탄올을 경구투여 한 후 1시간, 3시간, 5시간에 미동맥에서 채혈을 실시하였다.
- 8), 20 mM NAD+, 에탄올로 제조한 반응액 250 μL와 150 μg/mL MIX 20 μL를 혼합하고 효소원 S9 rat liver fraction을 30 μL 처리하여 30℃에서 5분간 preincubation 한 후, 340 nm에서 5분간 흡광도의 변화를 측정하였다. 시료를 첨가하지 않은 것을 대조군(Control)으로 하였고, 시료의 ADH 활성은 Control에 대한 상대 활성(%)으로 계산하였다. ALDH 활성은 증류수, 1.
- 33 M2-mercaptoethanol, 1 M acetaldehyde로 제조한 반응액 250 μL와 150 μg/mL MIX를 20 μL 혼합하고 효소원 S9 rat liver fraction을 30 μL 처리하여 30℃에서 5분간 pre-incubation 한 후, 340 nm에서 5분간 흡광도의 변화를 측정하였다. 시료를 첨가하지 않은 것을 대조군(Control)으로 하였고, 시료의 ALDH 활성은 Control에 대한 상대 활성(%)으로 계산하여 제시하였다.
- 시간별로 획득한 혈액은 4℃, 3,000 rpm에서 10분간 원심분리 하여 혈청을 얻었다. 실험동물을 7시간에 이산화탄소로 마취시킨 후 해부하여 간 조직을 적출하였다. 간 조직은 -70℃에 넣어 급속 동결시켜 다음 실험 전까지 보관하였다.
- , Gyeonggi, Korea)하여 어성초 열수 추출물 및 연잎 열수 추출물을 얻었다. 어성초 열수 추출물, 연잎 열수 추출물, 녹차씨 70% 에탄올 추출물 50 g, 25 g, 25 g을 혼합하여 본 연구의 혼합물인 MIX로 사용하였다. MIX는 -20℃에 보관하면서 연구에 사용하였다.
- 어성초, 연잎, 녹차씨 추출물 혼합물인 MIX의 직접적인 에탄올 분해 효소에 작용하는 활성을 평가하기 위해 S9 rat liver fraction에 함유된 ADH 및 ALDH의 활성에 작용하는 MIX의 영향을 평가하고, 그 결과를 Fig. 2에 나타내었다. MIX의 ADH 활성은 Control과 비교하여 통계적으로 유의하게 높은 값(100.
- 멸균 증류수와 MIX를 경구투여 하고 30분이 경과한 후, NC군은 멸균 증류수를 경구투여 하였고, EtOH군과 MIX군은 Jeon 등(11)과 Lee 등(12)이 보고한 바 있는 25% 에탄올(3 g/kg body weight/d)을 10 mL/kg으로 경구투여 하였다. 에탄올을 경구투여 한 후 1시간, 3시간, 5시간에 미동맥에서 채혈을 실시하였다. 시간별로 획득한 혈액은 4℃, 3,000 rpm에서 10분간 원심분리 하여 혈청을 얻었다.
- 온도(22±2℃), 습도(55±15%), 명암 cycle(07:00 점등~19:00 소등) 및 조도(150~300 Lux)를 유지하는 자동조절 항온항습기 내에서 사육하였다.
- 흰쥐를 이용한 숙취 연구 모델에서 에탄올 섭취 전 MIX의 섭취에 따른 혈중 에탄올 및 아세트알데히드 농도에 미치는 효과를 알아보기 위해 MIX를 200 mg/kg body weight/d의 농도로 경구투여 하고 30분 후 에탄올을 3 g/kg body weight/d를 경구투여 하여 1시간, 3시간, 5시간 경과에 따라 혈청을 획득하여 혈청 내 에탄올 및 아세트알데히드 농도를 측정한 결과는 Fig. 1에 나타내었다. NC군과 EtOH군의 혈청 에탄올 수준은 1시간, 3시간, 5시간에 통계적으로 유의한 차이를 나타내었다(12.
대상 데이터
- 24마리 7주령 Sprague-Dawley rat을 (주)오리엔트바이오(Seongnam, Korea)로부터 구입하였다. 온도(22±2℃), 습도(55±15%), 명암 cycle(07:00 점등~19:00 소등) 및 조도(150~300 Lux)를 유지하는 자동조절 항온항습기 내에서 사육하였다.
- Louis MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. S9 rat liver fraction과 D-PBS는 Thermo Fisher(Waltham, MA, USA)에서 구입하여 사용하였다.
- 어성초, 연잎은 국내산을 구매하여 연구에 사용하였다. 어성초와 연잎을 세절 후 분말화하였고, 녹차씨 70% 에탄올 추출물 분말은 (주)뉴트리플랜(Gyeonggi, Korea)으로부터 제공받았다.
- 어성초, 연잎은 국내산을 구매하여 연구에 사용하였다. 어성초와 연잎을 세절 후 분말화하였고, 녹차씨 70% 에탄올 추출물 분말은 (주)뉴트리플랜(Gyeonggi, Korea)으로부터 제공받았다. 환류냉각관에 부착한 2 L 둥근플라스크에 어성초와 연잎 분말을 50 g 넣고, 중량의 20배(w/v)의 물을 넣어 100°C에서 2시간 동안 환류 추출하였다.
- 환류냉각관에 부착한 2 L 둥근플라스크에 어성초와 연잎 분말을 50 g 넣고, 중량의 20배(w/v)의 물을 넣어 100°C에서 2시간 동안 환류 추출하였다. 추출한 용액은 Whatman No. 6 여과지(Whatman, Maidstone, UK)를 사용하여 감압 여과하고, 회전 진공농축기(EYELA SB1200B; Tokyo Rikakikai Co., Koishikawa, Japan)로 회전 농축한 후 동결건조(FD5510, Ilshin Lab Co., Gyeonggi, Korea)하여 어성초 열수 추출물 및 연잎 열수 추출물을 얻었다. 어성초 열수 추출물, 연잎 열수 추출물, 녹차씨 70% 에탄올 추출물 50 g, 25 g, 25 g을 혼합하여 본 연구의 혼합물인 MIX로 사용하였다.
데이터처리
- 동물실험에서 각 군의 차이 및 혼합물의 대조군의 ADH 및 ALDH 활성은 ANOVA-test로 분석 후 P<0.05 수준에서 Duncan's multiple range test에 의해 검정하였다.
이론/모형
- 시간별로 채취한 혈청의 에탄올 함량은 Bucher과 Redetzki(13) 및 Lundquist(14)의 방법에 따라 제조된 에탄올 및 아세트알데히드 측정용 assay kit(Roche Co., Darmstadt, Germany)을 사용하여 분광광도계(BioTek, Winooski, VT, USA)를 이용하여 측정하였다. 각 군의 에탄올 및 아세트알데히드 함량은 kit에 제시한 계산식을 이용하여 계산하였고, 각 군의 데이터는 EtOH군 1시간의 혈청 에탄올 및 아세트알데히드 함량을 기준으로 한 상대 활성(%)으로 제시하였다.
성능/효과
- 4%로 나타났다. EtOH군과 비교하여 MIX-200군의 혈청 에탄올 수준은 3시간과 5시간에 통계적으로 유의하게 16.1%, 22.6% 감소한 것을 확인할 수 있었다.
- MIX-200군은 63.4±0.7%, 55.7±3.3%, 41.8±2.5%로 나타났고, MIX-200군은 EtOH군과 비교하여 1시간에, 3시간, 5시간 모두 통계적으로 유의하게 36.6%, 11.1%, 14.9% 감소한 것을 확인할 수 있었다.
- MIX의 ADH 활성은 Control과 비교하여 통계적으로 유의하게 높은 값(100.0±1.1% v.s 131.6±9.9%)을 나타내었다.
- MIX의 ALDH 활성은 Control과 비교하여 통계적으로 유의하게 높은 값(100.0±6.7% v.s 135.7±8.5%)을 나타내었다.
- NC군과 EtOH군의 1시간, 3시간, 5시간의 혈청 아세트알데히드 수준은 통계적으로 유의하게 차이가 나타났다(44.9±1.4%, 53.8±2.6%, 39.7±2.7% v.s 100.0±2.5%, 66.8±1.8%, 56.7±1.1%).
- NC군과 EtOH군의 혈청 에탄올 수준은 1시간, 3시간, 5시간에 통계적으로 유의한 차이를 나타내었다(12.3±1.1%, 15.6±0.7%, 13.2±0.8% v.s 100.0±7.2%, 76.5±1.3%, 55.8±8.0%, P<0.05).
- 어성초 열수 추출물, 연잎 열수 추출물, 녹차씨 70% 에탄올 추출물의 혼합물인 MIX가 흰쥐에서 에탄올 투여에 따른 혈중 에탄올 및 아세트알데히드 농도와 에탄올 대사 효소들에 작용하는 효과와 직접적인 에탄올 대사 효소 활성에 미치는 영향을 확인하여 신규 숙취해소 소재로서 MIX의 활용 가능성을 연구하였다. 급성 에탄올을 투여한 EtOH군과 MIX-200군은 혈중 에탄올 농도가 에탄올을 투여하지 않은 NC군보다 높게 나타났고, MIX-200군은 EtOH군에 비교해 혈중 에탄올 농도가 에탄올 투여 3시간부터 감소하였고, 혈중 아세트알데히드의 농도는 에탄올 투여 1시간 이후부터 감소하였다. 에탄올과 아세트알데히드를 분해하는 효소인 ADH와 ALDH의 활성은 MIX-200군에서 EtOH군보다 높게 나타났다.
- Cho 등(23)과 Hong 등(16)의 연구에서 식물 추출물들과 추출물의 혼합물이 ADH 및 ALDH 효소의 활성을 증가시켜 숙취 제거 활성을 갖는다고 보고하였다. 따라서 에탄올 투여에 의해 간 조직의 ADH와 ALDH 활성이 감소하였으나 MIX 투여에 의해 그 활성이 증가하였고, 에탄올 투여 3시간 이후 혈중 에탄올의 농도 감소와 에탄올 투여 1시간부터 혈중 아세트알데히드 농도의 감소가 나타난 것은 MIX의 투여에 따른 효과로 판단할 수 있었다. 더하여 ADH 활성보다 상대적으로 높은 ALDH 활성 증가는 빠른 아세트알데히드 감소에 MIX가 작용하였을 것으로 추정할 수 있고, 혈중 아세트알데히드 분해에 MIX가 효과적으로 작용하는 숙취해소 식품 소재가 될 수 있을 것으로 판단되었다.
- MIX를 섭취한 쥐에서 혈청 에탄올 및 아세트알데히드 함량이 3시간 이후부터 EtOH군과 비교하여 감소한 결과를 나타내어 MIX는 숙취해소 활성을 갖는 식품 소재로 활용할 수 있을 것으로 판단되었다. 또한, 에탄올 섭취 후 1시간부터 숙취의 주요한 원인이 되는 아세트알데히드 농도를 유의하게 감소시키는 것을 확인하였고, 이는 에탄올 분해에 1차대사 산물로 생성되는 아세트알데히드의 제거에 MIX가 효과적으로 작용할 수 있음을 추정할 수 있었다.
- 본 실험의 결과는 평균±표준오차(mean±SE)로 나타내었다.
- 급성 에탄올을 투여한 EtOH군과 MIX-200군은 혈중 에탄올 농도가 에탄올을 투여하지 않은 NC군보다 높게 나타났고, MIX-200군은 EtOH군에 비교해 혈중 에탄올 농도가 에탄올 투여 3시간부터 감소하였고, 혈중 아세트알데히드의 농도는 에탄올 투여 1시간 이후부터 감소하였다. 에탄올과 아세트알데히드를 분해하는 효소인 ADH와 ALDH의 활성은 MIX-200군에서 EtOH군보다 높게 나타났다. 또한, MIX는 높은 alcohol dehydrogenase 및 acetaldehyde dehydrogenase 활성을 나타내었다.
후속연구
- Yang(15)과 Hong 등(16)의 연구에서 에탄올 섭취 30분 전 식물추출물 및 추출물의 혼합물의 섭취는 3시간의 경과에서 모두 혈중 에탄올 및 아세트알데히드 농도를 빠르게 감소시켰고, 이들 추출물과 혼합물을 숙취해소 활성을 갖는 소재들로 소개한 바 있다. MIX를 섭취한 쥐에서 혈청 에탄올 및 아세트알데히드 함량이 3시간 이후부터 EtOH군과 비교하여 감소한 결과를 나타내어 MIX는 숙취해소 활성을 갖는 식품 소재로 활용할 수 있을 것으로 판단되었다. 또한, 에탄올 섭취 후 1시간부터 숙취의 주요한 원인이 되는 아세트알데히드 농도를 유의하게 감소시키는 것을 확인하였고, 이는 에탄올 분해에 1차대사 산물로 생성되는 아세트알데히드의 제거에 MIX가 효과적으로 작용할 수 있음을 추정할 수 있었다.
- 따라서 에탄올 투여에 의해 간 조직의 ADH와 ALDH 활성이 감소하였으나 MIX 투여에 의해 그 활성이 증가하였고, 에탄올 투여 3시간 이후 혈중 에탄올의 농도 감소와 에탄올 투여 1시간부터 혈중 아세트알데히드 농도의 감소가 나타난 것은 MIX의 투여에 따른 효과로 판단할 수 있었다. 더하여 ADH 활성보다 상대적으로 높은 ALDH 활성 증가는 빠른 아세트알데히드 감소에 MIX가 작용하였을 것으로 추정할 수 있고, 혈중 아세트알데히드 분해에 MIX가 효과적으로 작용하는 숙취해소 식품 소재가 될 수 있을 것으로 판단되었다.
- 또한, MIX는 높은 alcohol dehydrogenase 및 acetaldehyde dehydrogenase 활성을 나타내었다. 따라서 MIX는 에탄올 대사 효소들의 활성 증가에 직･간접적으로 작용해 알코올 섭취 후 혈중 알코올 및 아세트알데히드를 감소시키는 숙취해소 작용을 갖는 신규 식품 소재로 사용될 수 있을 것으로 생각한다.
- Kang 등(24), Hwang 등(25), Sung 등(26), Lee 등(12)은 식품 소재들의 높은 ADH 활성 및 ALDH 활성을 보고한 바 있고, 각 연구에서 식품 시료들의 ADH 및 ALDH 활성의 증가는 에탄올의 분해 및 대사산물들의 제거 활성에 기여할 것으로 보고하였다. 따라서 MIX의 경우도 에탄올 분해 및 아세트알데히드 등의 대사산물 제거 활성을 갖는 식품 소재가 될 수 있을 것으로 판단되었다.
- 향후 MIX의 만성 에탄올 투여에 따른 보호 활성 연구를 수행하여 급성 및 아만성 에탄올 섭취에 따른 MIX의 다중 활성 및 관련 연구가 진행되어야 할 것으로 생각한다.
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