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문제 정의
- 최근 미네랄의 숙취해소에 관련한 연구는 많이 수행되어 지고 있으나 명확한 메카니즘은 알려져 있지 않으므로, 여기에 대한 과학적인 검증이 필요한 것으로 사료된다. 본 연구에서는 ADH와 ALDH의 활성화를 통해 숙취제거 효과를 나타낼 수 있는 천연 미네랄수(HSMW)와 항산화 효과 및 ADH, ALDH의 활성에 도움을 주는 약용식물 추출물(복분자, 울금, 산수유)을 첨가하여 개선된 숙취효과를 in vivo에서 확인하고자 하며, 숙취 음료 개발을 위한 기초 자료를 제공하고자 한다.
- 항산화 작용에 효과가 있다고 알려진 복분자, 울금, 산수유 추출물과 알코올분해 효소 작용을 촉진시킬 수 있는 천연 미네랄수(HSMW)를 첨가한 복합물(MIX)이 항산화 활성 및 알코올을 투여한 쥐의 혈중 알코올 농도와 체내 알코올 대사에 어떤 영향을 미치는지 검토하였다. 약용식물 추출물에서 복분자, 산수유의 총 페놀 및 플라보노이드 함량이 유의적으로 높게 정량되었으며, DPPH radical scavenging과 SOD 활성에서는 MIX가 유의적으로 높아 항산화 효과를 나타내었다.
가설 설정
- 1)Each point represents the mean±SD for group of six rats.
- 1)Mean±SD in the same column with different superscripts are significantly different at p<0.05.
- 3)Each point represents the mean±SD for group of six rats.
- 3)Sample concentration in the reaction system was 1 mg/mL.
- 6)Mean±SD in the same column with different superscripts are significantly different at p<0.05.
제안 방법
- 1 mL를 cuvette에 넣어 30℃에서 5분간 preincubation 한 후, 5분간 340 nm에서의 흡광도의 변화를 측정하였다. ADH, ALDH 활성은 정상군에 대한 상대활성(%)으로서 측정하였다.
- ADH의 활성 측정은 Bergmeyer의 방법(29)을 변형하여측정하였으며, 흡광도 340 nm에서 NADH의 생성속도를 지표로 사용하였다. 반응액의 조성은 증류수 1.
- 1 mL를 cuvette에 넣어 30℃에서 5분간 preincubation 한 후, 5분간 340 nm에서의 흡광도의 변화를 측정하였다. ALDH의 활성 측정은 Bostian과 Betts의 방법(30)을 변형하여 측정하였으며, 흡광도 340 nm에서 NADH의 생성속도를 지표로 사용하였다. 반응액의 조성은 증류수 1.
- 각 분석용 시료 100 μL에 2% Na2CO3 용액 2 mL를 가한 후 3분간 방치하여 50% Folin-Ciocalteu reagent 100 μL를 가하였다.
- 실험에 앞서 사료 섭취로 인해 나타날 수 있는 위장관을 통한 알코올의 흡수 방해 현상을 배제하기 위해 18시간 동안 절식시켰으며 이때 물은 제한 없이 공급하였다. 각 시료는 알코올 투여 30분전에 경구적으로 10 mL/kg씩 투여하였으며, 알코올 투여는 25% 주정을 체중 kg당 3 g 수준으로 1회 경구 투여하였다. 대조군은 시료 대신 증류수를 경구 투여하였고 정상군은 아무런 조건도 주지 않았다.
- 본 연구에 사용된 약용식물은 동의보감, 본초강목 등의 문헌고찰을 통하여 약리학적으로 간 보호, 숙취 제거 및 항산화 활성에 효능이 있는 복분자(Rubus coreanus), 울금 (Curcuma longa), 산수유(Cornus officinalis)를 서울의 삼홍건재약업사에서 구입하였다. 건조 약용식물은 각각 50 g에 증류수 1 L를 가하여 100℃의 온도에서 3시간 동안 추출하였으며 추출액을 rotary vacuum evaporator(N-1000, Eyela, Tokyo, Japan)를 사용하여 농축한 후 동결건조기(FD5525-01, Ilsin, Gyeonggi, Korea)로 건조하여 분말상태로 만들어 사용하였다. 0.
- 각 시료는 알코올 투여 30분전에 경구적으로 10 mL/kg씩 투여하였으며, 알코올 투여는 25% 주정을 체중 kg당 3 g 수준으로 1회 경구 투여하였다. 대조군은 시료 대신 증류수를 경구 투여하였고 정상군은 아무런 조건도 주지 않았다. 혈청 중 알코올 농도 측정을 위한 채혈은 알코올 투여 후 diethyl ether 마취상태에서 1시간, 3시간 후에는 안와 채혈을 하였으며, 5시간에는 복부정중선을 따라 개복하고 복부 대동맥으로부터 채혈하여 실혈사 시킨 후 간조직을 적출하였다.
- 2 μm의 필터로 걸러낸 미네랄수(HSMW)는 (주)대한심층수로부터 얻어 3차 증류수를 이용하여 농도를 조절해서 각 측정에 사용하였다. 미네랄수와 약용식물 추출물이 함유된 복합물(MIX)에는 Fig. 1과 Table 3의 결과에 의해 가장 활성이 뛰어난 10% HSMW와 복분자, 울금, 산수유 추출 분말 각각 1 mg/mL의 농도로 선정하여 제조하였다. 상업적인 숙취음료(Company Product, CP)에는 글루메이트, 타우린, 효모 추출 혼합 분말, 자리 추출 분말, 기타 첨가물이 함유되어 있다.
- 5 mL의 시료와 혼합하고 20분 후 UV spectrophotometer(Optizen 2120UV, Mecasys, Daejeon, Korea)로 525 nm에서 흡광도를 측정하였다. 음성 대조군으로는 1 mL DPPH에 시료 대신 0.5 mL 증류수를 가한 용액을 사용하였고 양성 대조군으로는 ascorbic acid, BHA를 사용하였고 DPPH에 의한 라디칼 소거활성을 다음 공식으로 계산하였다.
- 대조군은 시료 대신 증류수를 경구 투여하였고 정상군은 아무런 조건도 주지 않았다. 혈청 중 알코올 농도 측정을 위한 채혈은 알코올 투여 후 diethyl ether 마취상태에서 1시간, 3시간 후에는 안와 채혈을 하였으며, 5시간에는 복부정중선을 따라 개복하고 복부 대동맥으로부터 채혈하여 실혈사 시킨 후 간조직을 적출하였다.
- 혈청에 함유되어 있는 알코올 측정은 혈청의 2배 양의 10% trichloroacetic acid로 처리하여 단백질을 변성시켜 4℃, 20,000×g에서 5분간 원심분리 하여 상등액을 취하여 gas chromatography를 이용하여 분석하였다.
대상 데이터
- GC는 HP 5890 series Ⅱ(Hewlett Packard, Palo Alto, CA, USA)를 사용하였고, 칼럼은 HP-FFAP(Cross-Linked PEGTPA 30 m/0.25 mm/0.25 μL)을 사용하였다.
- 동물은 생후 6주령된 체중 200 g 내외의 웅성 Sprague- Dawley rat를 (주)효창사이언스로(Daegu, Korea)부터 구입하여 동물사육실에서 일정한 조건(온도: 22±2℃, 습도:50±5%, 명암: 12시간 light/dark cycle)으로 일주일간 적응 시킨 후 사용하였으며, 실험군은 6마리씩 정상군(normal), 대조군(control), 시료 투여군(MIX) 및 상업적인 숙취음료 제품군(CP)으로 나누었다.
- 본 연구에 사용된 약용식물은 동의보감, 본초강목 등의 문헌고찰을 통하여 약리학적으로 간 보호, 숙취 제거 및 항산화 활성에 효능이 있는 복분자(Rubus coreanus), 울금 (Curcuma longa), 산수유(Cornus officinalis)를 서울의 삼홍건재약업사에서 구입하였다. 건조 약용식물은 각각 50 g에 증류수 1 L를 가하여 100℃의 온도에서 3시간 동안 추출하였으며 추출액을 rotary vacuum evaporator(N-1000, Eyela, Tokyo, Japan)를 사용하여 농축한 후 동결건조기(FD5525-01, Ilsin, Gyeonggi, Korea)로 건조하여 분말상태로 만들어 사용하였다.
- Na2CO3 용액을 가한 30분 후 반응액의 흡광도 값을 750 nm에서 측정하였다. 표준물질로 tannic acid를 사용하였다. 검량선을 작성한 후 총 폴리페놀 함량은 시료 g 중의 mg tannic acid로 나타내었다.
데이터처리
- 실험한 결과의 통계처리는 SPSS 12.0 program(SPSS, Chicago, IL, USA)을 이용하여 각 실험군의 평균과 표준편차로 나타냈으며, 각 군의 비교는 유의수준 p<0.05에서 oneway ANOVA test로 나타내었으며, 유의성 검증은 t-test 또는 Duncan's multiple range test를 이용하였다.
이론/모형
- Brand-Williams 등(28)의 방법에 의해 0.1 mM DPPH용액 1.0 mL을 취하여 0.5 mL의 시료와 혼합하고 20분 후 UV spectrophotometer(Optizen 2120UV, Mecasys, Daejeon, Korea)로 525 nm에서 흡광도를 측정하였다. 음성 대조군으로는 1 mL DPPH에 시료 대신 0.
- Glutamic oxaloacetic transaminase(GOT), glutamic pyruvic transaminase(GPT)의 활성도는 각 기질과 효소반응을 이용한 비색법에 의해 제조된 assay kit(Asan Pharmaceutical, Seoul, Korea)로 측정하였다.
- SOD활성은 SOD assay kit-WST(Dojindo, Tokyo, Japan) 를 사용하였다. 96 well plate를 이용하여 각각의 시료 20 μL를 WST-1 용액 200 μL, enzyme 용액 20 μL와 반응시키고, blank는 시료 대신 증류수를 첨가하여 37℃에서 20분간 반응시키고 난 후, ELISA reader(Spectra MAX 250, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- The mineral ingredient content of each HSMW and seawater was analyzed by an Adur Outdoor Activities Centre (AOAC) methods.
- 총 폴리페놀 함량은 Dewanto 등(26)의 방법에 따라 Folin- Ciocalteu reagent가 추출물의 페놀성 화합물에 의해 환원된 결과 몰리브덴 청색으로 발색하는 것을 원리로 분석하였다. 각 분석용 시료 100 μL에 2% Na2CO3 용액 2 mL를 가한 후 3분간 방치하여 50% Folin-Ciocalteu reagent 100 μL를 가하였다.
- 총 플라보노이드 함량은 NFRI(27)의 방법으로 측정하였다. 각 분석용 시료 0.
성능/효과
- 1에 나타내었다. 100%, 5% HSMW 투여군은 대조군과 모든 시간에서 유의적인 차이를 나타내지 않았으며, 10% HSMW 투여군은 1시간 후에 대조군의 농도보다 유의적으로 높은 혈중 알코올 농도를 나타내고 그 후에 감소하였다. 따라서 10%의 HSMW 투여군이 혈중 알코올 농도를 저하시키는 효과가 있음을 알 수 있었다.
- 이는 HSMW에 함유되어 있는 미네랄 성분과 약용식물 추출물의 항산화 물질이 서로 동시 효과를 나타나는 것으로 사료된다. CP와 MIX 투여군은 모든 시간 경과 후에 대조군의 농도보다 유의적인 차이를 나타내었다. 대조군의 경우 혈중 알코올 농도가 3시간 후에 최대치를 보이며 그 후 감소하였는데 CP 와 MIX 투여군의 경우 혈중 알코올 농도가 1시간 후에 최대치에 도달하고 3시간부터 급속하게 감소하는 것으로 볼 수 있었다.
- 미네랄수와 약용식물 추출물 함유된 복합물(MIX)과 상업적인 숙취음료 제품(CP)에 대한 DPPH radical scavenging 및 SOD 활성 측정 결과는 Table 3과 같다. DPPH radical scavenging 활성 결과에서는 MIX가 CP보다 유의적으로 활성이 높았으며, MIX의 SOD 활성은 대조물질인 ascorbic acid와 합성 항산화제인 BHA보다 높은 항산화 활성의 효과를 나타내었다.
- HSMW의 수질분석은 Table 1과 같이 나트륨의 함량은 낮은 반면 칼슘, 망간, 아연의 함량은 높게 나타나 해수와는 다른 물성을 가지고 있는 것을 알 수 있었다. 해양성 심층수는 건강 및 의료용 소재, 화장품, 식품, 양식업 등에 널리 이용될 수 있는 것으로 알려져 있으며, 이러한 다양한 미네랄들이 중요한 생리활성(15-17)을 나타내는 것으로 추정되고 있다.
- 혈중 알코올 농도를 측정한 결과에서 10% HSMW 투여군이 대조군의 농도보다 유의적인 차이를 나타내었다. MIX와 CP 투여군은 모든 시간 경과 후에 대조군의 농도보다 유의적인 차이를 나타내었으며 두 군 간의 유의적인 차이는 나타나지 않았지만 고농도가 저농도에 비해 5～10% 더 감소하였다. MIX와 CP 투여군의 간 균질액의 ADH 활성은 정상군에 비해 유의적인 차이를 볼 수 없었으며, ALDH 활성은 MIX와 CP 투여군이 유의적으로 높았다.
- 대조군은 정상군에 비해 알코올의 분해 활성이 유의적으로 낮아진 것으로 보아 알코올 섭취 후 간에서 ADH, ALDH가 작용하였음을 알 수 있었다. MIX와 CP 투여군의 ADH 활성은 정상군에 비해 유의적인 차이를 볼 수 없었으며, ALDH 활성은 CP 투여군이 유의적으로 높았는데 이는 CP의 주성분 중에 쌀눈 발효 추출물인 글루메이트가 체내 알코올 분해를 활성화시키는 것으로 생각되어진다. 숙취의 원인물질로 알려진 아세트알데히드는 ADH의 작용에 의하여 생성되는 분해산물로 ADH의 활성이 높아지면 혈액 중의 알코올 농도를 감소시킬 수 있으나 아세트알데히드가 계속 축적되어 숙취가 오래 갈 수 있다.
- MIX와 CP 투여군은 모든 시간 경과 후에 대조군의 농도보다 유의적인 차이를 나타내었으며 두 군 간의 유의적인 차이는 나타나지 않았지만 고농도가 저농도에 비해 5～10% 더 감소하였다. MIX와 CP 투여군의 간 균질액의 ADH 활성은 정상군에 비해 유의적인 차이를 볼 수 없었으며, ALDH 활성은 MIX와 CP 투여군이 유의적으로 높았다. 또한 혈청 중 간 기능 지표 효소인 GOT, GPT 활성은 MIX 투여군이 정상군과 비슷한 활성을 보여 간 손상이 적었음을 알 수 있었다.
- 이는 Park 등(41)과 Jung 등(42)의 결과와 유사한 경향을 나타내었다. 농도에 따른 CP와 MIX 투여군의 알코올 농도는 모든 시간에서 비슷한 양상을 보이며 크게 감소하였으며, 두 군간의 유의적인 차이는 나타나지 않았지만 고농도가 저농도에 비해 1시간 후를 제외한 나머지 시간에서 5～10% 더 감소하였다.
- MIX의 경구투여에 의한 알코올 분해 효소의 활성을 측정한 결과는 정상군의 활성을 100%로 하였을 때 각각의 시료 투여군의 상대적인 활성도(%)를 Table 4에 나타내었다. 대조군은 정상군에 비해 알코올의 분해 활성이 유의적으로 낮아진 것으로 보아 알코올 섭취 후 간에서 ADH, ALDH가 작용하였음을 알 수 있었다. MIX와 CP 투여군의 ADH 활성은 정상군에 비해 유의적인 차이를 볼 수 없었으며, ALDH 활성은 CP 투여군이 유의적으로 높았는데 이는 CP의 주성분 중에 쌀눈 발효 추출물인 글루메이트가 체내 알코올 분해를 활성화시키는 것으로 생각되어진다.
- CP와 MIX 투여군은 모든 시간 경과 후에 대조군의 농도보다 유의적인 차이를 나타내었다. 대조군의 경우 혈중 알코올 농도가 3시간 후에 최대치를 보이며 그 후 감소하였는데 CP 와 MIX 투여군의 경우 혈중 알코올 농도가 1시간 후에 최대치에 도달하고 3시간부터 급속하게 감소하는 것으로 볼 수 있었다. 이는 Park 등(41)과 Jung 등(42)의 결과와 유사한 경향을 나타내었다.
- 100%, 5% HSMW 투여군은 대조군과 모든 시간에서 유의적인 차이를 나타내지 않았으며, 10% HSMW 투여군은 1시간 후에 대조군의 농도보다 유의적으로 높은 혈중 알코올 농도를 나타내고 그 후에 감소하였다. 따라서 10%의 HSMW 투여군이 혈중 알코올 농도를 저하시키는 효과가 있음을 알 수 있었다. 이는 10%의 HSMW에 함유되어있는 최적 미네랄 함량이 알코올분해 효소를 촉진시키는 것으로 생각된다.
- MIX와 CP 투여군의 간 균질액의 ADH 활성은 정상군에 비해 유의적인 차이를 볼 수 없었으며, ALDH 활성은 MIX와 CP 투여군이 유의적으로 높았다. 또한 혈청 중 간 기능 지표 효소인 GOT, GPT 활성은 MIX 투여군이 정상군과 비슷한 활성을 보여 간 손상이 적었음을 알 수 있었다. 따라서 MIX에 함유된 미네랄수(HSMW)인 Zn, Ca, Mg, Mn 등이 알코올 분해 효소 활성을 조절함과 동시에 약용식물 추출물이 항산화 작용을 하여 음주로 인해 발생하는 숙취 증상과 산화적 스트레스를 효과적으로 완화시킬 수 있으며, 체내 알코올 대사에 직·간접적으로 작용해 간 기능의 저하를 방지하는 기능성 숙취 음료로 사용될 것이라고 사료되어진다.
- 본 연구에서는 약용 식물들을 검토하여 그중 우수한 효과를 보이는 복분자, 울금, 산수유의 총 페놀 및 플라보노이드 함량을 Table 2에 나타내었다. 복분자, 산수유는 울금에 비해 총 페놀 및 플라보노이드 함량이 유의적으로 높았다. 특히 복분자, 산수유의 총 페놀 함량은 Park(32)이 보고한 여러 한약재들보다 많은 것을 알 수 있었다.
- 따라서 GOT 및 GPT의 순환계로의 많은 방출은 알코올에 의한 독성화 과정 동안에 간 조직막에 심각한 손상이 있었음을 의미한다. 본 연구에서 대조군은 정상군에 비해 유의적으로 다소 증가하였으며 이는 rat에 알코올을 투여하면 혈청 GOT, GPT 양의 상승을 초래하였다는 것으로 알코올 투여에 의한 간 독성효과가 나타남을 알 수 있었다. CP 투여군은 대조군에 비해 유의적인 차이가 없었다.
- 2에 나타내었다. 시간 경과에 따른 혈중 알코올 농도의 변화는 HSMW 투여군과 비슷한 양상을 나타내었으며, MIX 투여군이 HSMW 투여군보다 혈중 알코올 농도가 15～20% 더 감소하였음을 알 수 있었다. 이는 HSMW에 함유되어 있는 미네랄 성분과 약용식물 추출물의 항산화 물질이 서로 동시 효과를 나타나는 것으로 사료된다.
- 항산화 작용에 효과가 있다고 알려진 복분자, 울금, 산수유 추출물과 알코올분해 효소 작용을 촉진시킬 수 있는 천연 미네랄수(HSMW)를 첨가한 복합물(MIX)이 항산화 활성 및 알코올을 투여한 쥐의 혈중 알코올 농도와 체내 알코올 대사에 어떤 영향을 미치는지 검토하였다. 약용식물 추출물에서 복분자, 산수유의 총 페놀 및 플라보노이드 함량이 유의적으로 높게 정량되었으며, DPPH radical scavenging과 SOD 활성에서는 MIX가 유의적으로 높아 항산화 효과를 나타내었다. 혈중 알코올 농도를 측정한 결과에서 10% HSMW 투여군이 대조군의 농도보다 유의적인 차이를 나타내었다.
- CP 투여군은 대조군에 비해 유의적인 차이가 없었다. 하지만 MIX 투여군의 GOT, GPT 활성은 대조군과의 유의적인 차이가 있었는데, 이는 알코올의 1회 투여로는 간 손상의 생화학적으로 지표의 변화가 크게 관찰되지는 않았음을 시사하며 정상군과 비슷한 활성을 보여 간 손상이 적었다는 것을 알 수 있었다.
- 약용식물 추출물에서 복분자, 산수유의 총 페놀 및 플라보노이드 함량이 유의적으로 높게 정량되었으며, DPPH radical scavenging과 SOD 활성에서는 MIX가 유의적으로 높아 항산화 효과를 나타내었다. 혈중 알코올 농도를 측정한 결과에서 10% HSMW 투여군이 대조군의 농도보다 유의적인 차이를 나타내었다. MIX와 CP 투여군은 모든 시간 경과 후에 대조군의 농도보다 유의적인 차이를 나타내었으며 두 군 간의 유의적인 차이는 나타나지 않았지만 고농도가 저농도에 비해 5～10% 더 감소하였다.
후속연구
- 또한 혈청 중 간 기능 지표 효소인 GOT, GPT 활성은 MIX 투여군이 정상군과 비슷한 활성을 보여 간 손상이 적었음을 알 수 있었다. 따라서 MIX에 함유된 미네랄수(HSMW)인 Zn, Ca, Mg, Mn 등이 알코올 분해 효소 활성을 조절함과 동시에 약용식물 추출물이 항산화 작용을 하여 음주로 인해 발생하는 숙취 증상과 산화적 스트레스를 효과적으로 완화시킬 수 있으며, 체내 알코올 대사에 직·간접적으로 작용해 간 기능의 저하를 방지하는 기능성 숙취 음료로 사용될 것이라고 사료되어진다.
- 이와 같은 효과는 이미 보고된 바와 같이 지질의 산화, 활성산소의 소거 및 산화적 스트레스를 막는 역할을 함으로써 노화방지, 암 및 심장질환 등을 예방하거나 지연하는 효과로 오늘날 식품, 의약품, 화장품 등 많은 분야에서 이들 효과를 활용하고 있다. 따라서 미네랄수와 약용식물 추출물이 함유된 MIX는 페놀성 화합물 및 다량의 무기질이 생체 내에서 일어나는 산화적인 스트레스 및 손상의 예방에 유용할 것으로 사료되어진다.
- 최근 미네랄의 숙취해소에 관련한 연구는 많이 수행되어 지고 있으나 명확한 메카니즘은 알려져 있지 않으므로, 여기에 대한 과학적인 검증이 필요한 것으로 사료된다. 본 연구에서는 ADH와 ALDH의 활성화를 통해 숙취제거 효과를 나타낼 수 있는 천연 미네랄수(HSMW)와 항산화 효과 및 ADH, ALDH의 활성에 도움을 주는 약용식물 추출물(복분자, 울금, 산수유)을 첨가하여 개선된 숙취효과를 in vivo에서 확인하고자 하며, 숙취 음료 개발을 위한 기초 자료를 제공하고자 한다.
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