[국내논문]멸치 젓갈로부터 r-Aminobutyric Acid(GABA)를 생성하는 Lactobacillus 속의 분리.동정 Isolation and Identification of Lactobacillus sp. Produced r-Aminobutyric Acid(GABA) from Traditional Salt Fermented Anchovy원문보기
This study was conducted to investigate the identification of lactic acid bacteria produced ν-aminobutyric acid(GABA) from traditional salt fermented anchovy. There was no appreciable difference in the number of lactic acid bacteria from fermented anchovy. Among the types of lactic acid bacteria, th...
This study was conducted to investigate the identification of lactic acid bacteria produced ν-aminobutyric acid(GABA) from traditional salt fermented anchovy. There was no appreciable difference in the number of lactic acid bacteria from fermented anchovy. Among the types of lactic acid bacteria, three strains of lactic acid bacteria produced ν-aminobutyric acid from those sample were identified temporary as name of Lactobacillus brevis BH-21, Lactobacillus rhamnosus BH-32 and Lactobacillus plantarum BH-38 by using gram positive identification(GPI) card and API 50 kit, respectively. 3 strains of Lactobacillus sp. were found to produce GAB A in the culture of filtrate. Lactobacillus brevis BH-21 produced GABA, some of which yielded 43.2 mg/mL GABA in the medium of 0.1% glucose, 0.1% yeast extract, 0.05% polypeptone, 0.002% MgSO$_4$$.$4H$_2$O, 0.001% FeSO$_4$$.$7H$_2$O, 0.01% NaCl, 0.1% monosodium glutamate, pH 6.0. This result suggests that Lactobacillus brevis BH-21 has the potential to be developed as a strain of GABA production.
This study was conducted to investigate the identification of lactic acid bacteria produced ν-aminobutyric acid(GABA) from traditional salt fermented anchovy. There was no appreciable difference in the number of lactic acid bacteria from fermented anchovy. Among the types of lactic acid bacteria, three strains of lactic acid bacteria produced ν-aminobutyric acid from those sample were identified temporary as name of Lactobacillus brevis BH-21, Lactobacillus rhamnosus BH-32 and Lactobacillus plantarum BH-38 by using gram positive identification(GPI) card and API 50 kit, respectively. 3 strains of Lactobacillus sp. were found to produce GAB A in the culture of filtrate. Lactobacillus brevis BH-21 produced GABA, some of which yielded 43.2 mg/mL GABA in the medium of 0.1% glucose, 0.1% yeast extract, 0.05% polypeptone, 0.002% MgSO$_4$$.$4H$_2$O, 0.001% FeSO$_4$$.$7H$_2$O, 0.01% NaCl, 0.1% monosodium glutamate, pH 6.0. This result suggests that Lactobacillus brevis BH-21 has the potential to be developed as a strain of GABA production.
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문제 정의
이러한 연구의 일환으로 유산균으로부터 뇌 기능성 전달물질로 알려진 v-aminobutyric acid(GABA)을 생성하는 균주를 멸치 젓갈로부터 분리, 동정하고자 한다.
제안 방법
5분간 끓인 후 반응을 정지시킨 다음 생성된 GABA 를 측정하였다. 상기 조건하에서 1분간에 1 µmol의 GABA를 생성하는 효소량을 1단위(U)로 하였다23).
BH-38 균주는 MRS agar에 0.002% bromophenol blue 배지상에서 흰색의 집락을 형성하였고, Voges- pmskauer에서 양성반응을 나타내었고, galactose, glucose, fructose, mannose, sucrose, acetyl glucosamine, cellobiose, melibiose, trehalose, raffinose 및 D-xylose 등의 당을 분해하여 Lactobacillus plantarum BH-38로 잠정 동정하였다.
Column으로부터 유도체를 용출시키기 위해서는 AccQ . Tag Eluent A와 69% aceto- nitrile을 98:2의 비율로 분당 1 mL의 유속으로 흘려 주었다 GABA 및 아미노산 함량은 표준 GABA 및 표준 아미노산의 분석 결과와 비교하여 산출하였다22).
Tanasupawat와 Daengsubha씨는 태국에서 생산되고 있는 어장유 및 젓갈류에서 염농도 6~8%, pH 8, 2와 42 ℃에서 잘 생육하며 당으로부터 산을 생성하는 Pediococcus pentosaceus와 염농도 18%, pH 8.6~9.2에서 생육이 양호하며 당을 분해하여 산을 생성하는 호염성의 Pediococcus halophilus를 분리하였다. Morishita 등즈은 시판 중인 저염 오징어 젓갈에서 젖산균인 Laciobacillus를 분리하였으며 어떤 제품에서는 이 균속이 83%를 점하는 경우도 있었다고 보고하였다.
이때 생육속도도 빠르고, TLC로 같은 조건으로 조작하여 모세관으로 같은 농도를 조절하고 점적하여 TLC 상에서 GABA와 Rf가 같고 spot가 큰 것을 GABA 생성능이 우수한 3균주로 우선 선별하였다. 다시 GABA 생산능이 제일 좋은 3균주를 동일한 방법으로 조작하여 TLC plate 에 점적하여 n-butanol : acetic acid : water(2:3:l)로 전개시킨 후 nimydrin 용액으로 분무하여 BH-21, BH- 32 및 BH-38를 GABA 표준품과 비교한 결과 GABA 표준품의 Rf치와 동일하였고 spot이 가장 컸으므로 BH-21, BH-32 및 BH-38 둥 3균주를 GABA 생산균주로 최종 선별하였다(Fig. 1).
멸치젓갈로부터 Y-aminobutyric acid(GABA)을 생성하는 유산균주를 분리 동정하였다.
젓갈에서 분리한 3 균주들은 gram 양성이고, 운동성이 없으며 포자를 형성하지 않는 통성혐기성의 간균으로 나타났다. 분리된 시료 균주를 MRS medium에 0.02% bromophenol blue를 첨가한 MRS 배지에 도말하여 37℃에서 3일간 배양한 결과 전체적으로 흰색의 집락을 형성하였고, 모양은 환을 형성하였으며, 표면은 매끈하였다.
생성된 colony를 각각 MRS배지에서 배양한 후 배양액을 원심분리한 다음 진공 농축하여 분석에 사용하였다. GABA 및 아미노산의 형광 유도체화를 위해 3.
수종의 멸치 젓갈의 시료를 각각 1 mL씩 취한 후 멸균 증류수를 102, 104 및 106 까지 희석한 다음 MRS 한천배지에 도말하여 배양한 후 생육이 우수한 30여 균주를 2회 계대한 다음 다시 MRS 액체 배지에 접종한 다음 37C 에서 48시간 동안 배양한 다음 생육속도가 빠른 균주의 배양액을 silica gel TLC 상에 점적하여 표준품인 GABA와 Rf 치가 같은 균주를 선별하였다. 이때 분리된 균주는 9종이었다(Table 1).
총균수의 측정은 시료를 단계별로 희석하여 plate count agar 배지로 pour plate 방법에 의해 plate를 만든 후 35 ℃ 에서 48시간 배양하여 colony가 30~300개가 나타나는 평판을 선택하여 산출하였다. 유산균수의 측정은 CaCO3를 함유한 MRS 배지를 적절히 희석시킨 시료와 pour plate 방법에 의해 plate를 만든 후 30 ℃ 에서 48시간 배양하여 주위가 투명한 colony를 산 생성균으로 판정하여 측정하였다.
유산균의 동정은 균을 멸균 swab를 사용하여 2 mL 의 멸균증류수와 5 mL의 현탁배지에 현탁하여 API 50 CHL medium의 gallery에 각각 접종한 후 30 ℃ 에서 4시간 배양하여 각 균주의 배양액을 첨가하고 10분 후 결과를 판독하여 7자리의 숫자로 표시한 다음 API 50 CHL analytical profile index로 동정 하였다. 또한 index에 없거나 혼동될 우려가 있을 때는 24시간 재배양하여 판독하였으며 그 결과를 Bergey's manual19), Balows20), Gibbs와 Skinner21)의 방법에 따라 형태적 , 배양적 및 생리적 특징과 비교, 확인하여 최종 동정하였다.
이때 분리된 균주는 9종이었다(Table 1). 이때 생육속도도 빠르고, TLC로 같은 조건으로 조작하여 모세관으로 같은 농도를 조절하고 점적하여 TLC 상에서 GABA와 Rf가 같고 spot가 큰 것을 GABA 생성능이 우수한 3균주로 우선 선별하였다. 다시 GABA 생산능이 제일 좋은 3균주를 동일한 방법으로 조작하여 TLC plate 에 점적하여 n-butanol : acetic acid : water(2:3:l)로 전개시킨 후 nimydrin 용액으로 분무하여 BH-21, BH- 32 및 BH-38를 GABA 표준품과 비교한 결과 GABA 표준품의 Rf치와 동일하였고 spot이 가장 컸으므로 BH-21, BH-32 및 BH-38 둥 3균주를 GABA 생산균주로 최종 선별하였다(Fig.
9% NaCl 용액)로 적절히 희석하고, 가급적 50~100개의 집락(colony)이 형성되도록 도말한 후 30℃ 배양기 내에서 48시간 배양하였다. 일단 배지 상에 형성된 집락에 대하여 외관의 모양이 유사하고 출현 빈도가 많은 것을 우선적으로 선별하고, 동일 배지에 2~3회 도말 배양하여 순수 분리한 후 MRS broth 중에서 30℃로 배양 후 5℃로 냉장 보관하면서 사용하였다.
총균수의 측정은 시료를 단계별로 희석하여 plate count agar 배지로 pour plate 방법에 의해 plate를 만든 후 35 ℃ 에서 48시간 배양하여 colony가 30~300개가 나타나는 평판을 선택하여 산출하였다. 유산균수의 측정은 CaCO3를 함유한 MRS 배지를 적절히 희석시킨 시료와 pour plate 방법에 의해 plate를 만든 후 30 ℃ 에서 48시간 배양하여 주위가 투명한 colony를 산 생성균으로 판정하여 측정하였다.
대상 데이터
부산시 소재 기장 시장에서 제조원이 서로 다른 10 여종의 멸치 젓갈로부터 유산균을 분리하였다.
이론/모형
유산균의 동정은 균을 멸균 swab를 사용하여 2 mL 의 멸균증류수와 5 mL의 현탁배지에 현탁하여 API 50 CHL medium의 gallery에 각각 접종한 후 30 ℃ 에서 4시간 배양하여 각 균주의 배양액을 첨가하고 10분 후 결과를 판독하여 7자리의 숫자로 표시한 다음 API 50 CHL analytical profile index로 동정 하였다. 또한 index에 없거나 혼동될 우려가 있을 때는 24시간 재배양하여 판독하였으며 그 결과를 Bergey's manual19), Balows20), Gibbs와 Skinner21)의 방법에 따라 형태적 , 배양적 및 생리적 특징과 비교, 확인하여 최종 동정하였다.
유산균의 분리는 Miyao와 Ogawa의 방법18)에 따라 Lactobacilli의 분리 동정을 위하여 MRS agar(Difco, Detroit, USA)에서 전형적인 colony로 유산균을 분리하여 동정하였다. 멸치젓의 발효숙성 중 생성된 유산균을 분리 동정하기 위하여 제조 직후, 맛이 좋아지는 시기인 발효 2개월 후에 각각 액즙 1 mL를 취하였다.
성능/효과
Lactobacillus brevis BH-21의 배양기간 동안 GABA의 생산은 glutamic ac너의 탈탄산에 의하여 이루어지므로 glutamic acid의 감소가 뚜렷이 나타나고 있다, 이들 3균증 Lactobacilli brevis BH-21은 24시간 배양시에 GABA의 생성량이 증가하면서 glutamic acid가 감소하였고, glutamic acid decarboxylase(GAD)활성은 24시간 이후에 증가하다가 약간 감소하는 경향을 나타내고 있다.
멸치젓갈로부터 분리한 9종의 유산균 중 GABA 생산능이 우수한 균주를 순수분리하여 형태학적 특성과 gram positive identification(GPI) card 와 API 50kit로 동정한 결과 Lactobacillus brevis BH-21, Lactobacillic rhamnosus BH-28 및 Lactobacillus plantarum BH-38로 동정하였다. 이들 Lactobacillus 속 균주중 Lactobacillus brevis BH-21이 GABA 생성능력이 제일 우수하였고, GABA 생성함량은 배지(0.
본 실험에서 보는 바와 같이 유산균 중에서도 Lactobacillus brevis BH-21과 같이 glutamic acid를 탈탄산 하는 glutamic acid decarboxylase( GAD) 활성이 높으면 GABA의 생성이 가능하지만 Lactobacillus plantarum BH-38과 같이 glutamic acid decarboxylase(GAD)활성이 낮으면 GABA의 생성이 미미한 것으로 나타났다.
선별된 균주의 생화학적 특성을 보면 Table 3에 나타낸 바와 같이 일반적인 특성은 BH-21, BH-32 및 BH-38 균주 모두 15℃ 및 37℃ 에서 생육이 좋았다. BH-21은 알기닌으로부터 암모니아를 생성하였으나, BH-32 및 BH-38은 알기닌으로부터 암모니아를 생성하지 못하였다.
이들 균주는 모두 glycerol, erythritol를 모두 쉽게 자화하지 못하였고, L-xylose를 BH-21 와 BH-32는 자화하지 못하였으나, BH-38은 자화하였고, adonitol과 6-methylxylose는 모든 균주가 자화하지 못하였다. 세균주가 galactose, glucose, fruc- tose, mannose, sucrose 등의 반응이 양성으로 나타났으며, BH-21 균주는 manntiol과 gentibiose, gluconate 을, BH-32 균주는 sorbitol, cellobiose 및 raffinose에 대하여 양성반응으로 각각 나타나 BH-21은 Lacto-bacillus brevis BH-21로 BH-28은 Lactobacillus rha-mnosus BH-28로 동정하고 잠정적으로 명명하였다.
멸치젓갈로부터 분리한 9종의 유산균 중 GABA 생산능이 우수한 균주를 순수분리하여 형태학적 특성과 gram positive identification(GPI) card 와 API 50kit로 동정한 결과 Lactobacillus brevis BH-21, Lactobacillic rhamnosus BH-28 및 Lactobacillus plantarum BH-38로 동정하였다. 이들 Lactobacillus 속 균주중 Lactobacillus brevis BH-21이 GABA 생성능력이 제일 우수하였고, GABA 생성함량은 배지(0.1% glucose, 0.1% yeast extracts, 0.05% polypeptone, 0.002% MgSQ* , 4H2O, 0.001% FeSO4 - 7H2O, 0.01% NaCl, 0.1% monosodium glutamate, pH 6.0)에서 Lactobacillus brevis BH-21 을 배양하였을 때, 배양 24시간에 43.2mg/mL의 GABA을 생성하였다.
1mg/mL이었다. 이와 같이 이들 3균주 중에서 Lactobacillus brevis BH-21 이 glutamic acid에서 GABA로 전환하는 생성력이 제일 좋았고, 그 다음이 Lactobacillus plantarium BH-32가 높았으며, lactobacillic rhamnosus BH-28이 제일 낮았다.
선별된 3균주들의 형태학적, 배양학적 특성을 검토한 결과는 Table 2와 같다. 젓갈에서 분리한 3 균주들은 gram 양성이고, 운동성이 없으며 포자를 형성하지 않는 통성혐기성의 간균으로 나타났다. 분리된 시료 균주를 MRS medium에 0.
참고문헌 (30)
Metchnikoff, E. : The prolongation of life, Arnopress, New York (1908)
Gilliland, S.E. : 5th. International symposium for lactic acid bacteria and health, Korea. 3-17 (1987)
Aguirre, M. and Collins, M. D. : Lactic acid Bacteria and human clinical infection, J. Appt. Bacteriol., 75.95-107 (1993)
Speck, M.L. : Interactions among Lactobacilli andMan, J. Dairy Sci., 59. 336-343 (1976)
Salminen, S. and Tanaka. M. : Annual review oncultured milks and probiotics, IDF Nutr. News letter,4. 47-50 (1995)
Goldin, B.R. : Health benefits of probiotics, Br. J.Nurt., 80 (Suppl. 2), S203-S207 (1998)
Daeschel, M.A. : Antimicrobial substances from lactic acid bacteria for use as food preservatives, Food Technol., 43. 164-167 (1989)
Gilliand, S.E. : Beneficial interrelationships between certain microorganisms and humans: Candidate microorganisms for use as dietary adjuncts, J. Food protect, 42. 164-167 (1979)
Havenaar, R. and Huis In't Veld, J. H. J. : Probiotics, A general view. In: The Lactic Acid Bacteria in Health and Disease, pp. 151-170. Ed. Wood, B. J. B. Elsevier Applied Science, London and New York(1992)
Huit In't Veld, J. H. J. and Havenaar, R. : Probiotics and health in man and animal, J. Chem. Technol. Biotechnol., 51. 562-567 (1991)
Kirjavainen, P.V., Ouwehand, A.C., Isolauri, E. and Salminen, S.J. : The ability of probiotic bacteria to bind to human intestinal mucus, FEMS Microbiol. Lett., 167. 185-189 (1998)
Gasser, F. : Safety of lactic acid bacteria and their occurrence in human clinical infection, Bull. Inst. Pasteur., 92. 45-67 (1994)
Tamime, A.Y. and Robinson, R.K. : In Yoghurt ; science and technology, 2nd Ed. pp. 358-360. CRC Press, N.Y. (1999)
Miyao, S. and Ogawa, T. : Selective media for enumberating lactic acid and bacteria grouts from fermented pickles, Nippon Shokuhihin Gakkaish, 35. 610-617 (1998)
Kandler, O. and Weiss, N. : In Regular, nonsporing gram positive, rods. In Bergeys's Manual of Systematic Bacterioloey. Sneath, P.H.A., Mair, N.S., Shairpe, M.E. and Holt, J.G. (eds.) Vol. I, Williams and Wilkins, Baltimore. p. 1208 (1986)
Balows, A., Truper, H.G., Dworkin, M., Harder, W. and Schelifer, K.H. : In Ther Prokaryotes, 2nd ed. Vol. II, Springer-Verlag, New York. p.1564 (1992)
Gibbs, B.M. and Skinner, F.A. : In Identification methods for microbiology, London, A. P. New York. p. 180-186 (1966)
Kitaka, A., Dosya, T. and Dakenori, O. : Development of a super GABA by lactic acid fermentation, Food & Develop., 36(6). 12-14 (2000)
Bown, A.W. and Shelp, B.J. : The metabolism and function of ${\gamma}$ -aminobutyric acid, Plant Physiol., 115. 1-5 (1997)
Tanasupawat, S. and Daeugsubha, W. : Pediococcus specie and related bacteria found in fermented foods and related materials in Thailand, J. Gen. Appl. Microbiol., 29. 487-491 (1983)
Morishita, K., Otakasaka, W., Yamazaki, K., Kawai, Y. and Inoue, N. : Chemical 'Shiokara', Rep. Fac. Fish Hokkido Univ. 45. 100-105 (1994)
Toshinobu, M. and Tojiro, T. : Conversion of glutamic acid to ${\gamma}$ -aminobutyric acid in tea leaves under anaerobic conditions, Agric. Biol. Chem., 51. 2865 (1972)
Satya Narayan, V. and Nair, P.M. : Metabolism enzymology and possible roles of 4-aminobutyrate in higher plants, Phytochemistry, 29. 367-375 (1990)
Nomura, M., Kimofo, H., Someya, Y., Furukawa, S., and Suzaki, I. : Production of ${\gamma}$ -aminobutnc acid by cheese starters during cheese ripening, J. Dairy Sci., 81. 1486-1491 (1998)
Yokoyama, S., Hiramatsu, J.I., and Hayakawa, K. : Production of ${\gamma}$ -aminobutric acid from alcohol distillery lees by Lactobacillus brevis IF0-12005, J. Biosci. Biotech., 93(1). 95-97 (2002)
Pelletier, C., Bouley, C., Cayuela, C., Bouttier, S., Bourlious, P. and Bellom-Fontaine, M.N. : Cell surface characteristics of Lactobacillus casei subsp. casei, Lactobacillus paracasei subsp. paracasei, and Lactobacillus rhamnosus strains, Appl. Environ. Microbiol., 63, 1725-1731 (1997)
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