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문제 정의
- 오매가 갈증을 없애는 것이 신맛에 의한 것일 수도 있지만 당뇨병을 완화하여 혈당을 저하시키고 갈증을 없 애 주는 것 일 수도 있다. 그러 므로 본 연구에서는 오매가 인슐린 작용을 향상시 키는 인슐린 민감성 효과, 인슐린처럼 작용하는 인슐린성 물질로서 의 효과 그리 고 a -glucoam- ylase의 억제제로의 효과가 있는 지 여부를 조사하였다. 이 연구 결과로 오매가 당뇨병에 미치는 영향을 알았기에 이를 보고하고자 한다.
- column으로 분획하였다. 본 연구에서는 3T3-L1 섬유아세포와 지방세포에서 오매의 추출 분획물이 인슐린처럼 작용하는 인슐린성 물질이거나, 인슐린 작용을 향상시키는인슐린 민감성 물질이 거나, 또는 a -glucoamylase 활성을 억제하는 물질로 작용하는 지 여부를 조사하였다. 오매 분획물은 인슐린성 물질로 작용하지 않았다.
- 본 연구에서는 3T3-L1 지방세포에 소량의 인슐린인 1 ng/mL과 오매의 분획 물을 처 리 하였을 때 50 ng/mL 인슐린을 처리하였을 때와 마찬가지로 포도당의 흡수를 증가시키는 지를 조사하였다. 저농도의(0.
- 3T3-L1 섬유아세포는 인슐린, DEX와 I3MX로 조성 된 분화유도물질을 첨가하였을 때 지방세포로 전환되는데(14, 15), 이 기전은 아직 확실하게 알려지지는 ??았다. 본 연구에서는 오매 분획물에 인슐린성 물질로 작용하는 물질이 함유되어 있는 지를 조사하기 위하여 3T3-L1 섬유아세포에 분화 유도물질 중 인슐린을 제외한 DEX와 I3MX와 함께 오매 의 메 탄올 분획 물을 각각 100 11g/ mL의 농도로 처 리하였을 때 그리고 인슐린을 포함한 분화유도물질과 함께 오매 분획물을 각각 100 Ug/nmL로 처리하였을 때 지방세포로의 분화정도를 축적된 중성지방 함량으로 결정하였다. 인슐린성 물질의 존재 여부는 분화를 인슐린을 제외한 유도분화 물질과 함께 오매 분획물을 첨가하였을 때 중성지방 생성량이 대조군인 DMSO를 처리한 것보다 많은 경우에 오매 추출물에 인슐린성 물질이 함유되어 있다고 간주하였다.
- 그러 므로 본 연구에서는 오매가 인슐린 작용을 향상시 키는 인슐린 민감성 효과, 인슐린처럼 작용하는 인슐린성 물질로서 의 효과 그리 고 a -glucoam- ylase의 억제제로의 효과가 있는 지 여부를 조사하였다. 이 연구 결과로 오매가 당뇨병에 미치는 영향을 알았기에 이를 보고하고자 한다.
제안 방법
- 5 N NaOH로 세포를 분해하였다. 분해된 세포를 초산으로 중화시키고 함유된 "c의 함량을 베타 counter(Tri-Carb 2100TR, Packard Bioscience, Boston, MA, US A) 로 측정하였다.
- 한편 오매 분획 층 중 60%, 80% 그리 고 100% 메 탄올 분획 층은 3T3- L1 지방세포에서 인슐린 작용을 향상시키는 인슐린 민감성 제로 작용하였다. In vitro 실험 에서 20 그리고 40% 메탄올 분획 층은 a -glucoamylase-2] 활성 을 저 하시 켜 말토스와 dextrin의 분해 를 방해하였다. 그러 나 in uiuo에서 는 오매 에탄올 추출물을 말토스나 dextrin을 투여하기 10분전에 투여하였을 때 최고혈당 값과 area under the curve 값은 대조군과 차이 가 없었다.
- 측정하였다(13). Sprague Dawley 숫컷 백서 (중앙 실험 동물, Seoul, Korea)를 16시간 동안 금식시킨 후 오매 추출물 500 mg/kg 체중을 투여하고 10분 뒤 에 포도당 대신 dextrin 또는 말토스를 투여 하여 讥勇uo에 서 a-glucoamylase효소의 활성 을 조사하였다. 물론 경구 당부하 검사는 췌장의 베타세포에서의 인슐린 분비 정도와 체내 인슐린 민감성과 밀접하게 연관되어 있지 만, 말토스나 dextrin은 포도당과는 달리 소화하는 과정 이더 필요하므로 말토스나 dextrin을 투여한 후 초기 에 혈당 상승은 소화 흡수와 관련이 있는 것으로 간주하였다.
- 물론 경구 당부하 검사는 췌장의 베타세포에서의 인슐린 분비 정도와 체내 인슐린 민감성과 밀접하게 연관되어 있지 만, 말토스나 dextrin은 포도당과는 달리 소화하는 과정 이더 필요하므로 말토스나 dextrin을 투여한 후 초기 에 혈당 상승은 소화 흡수와 관련이 있는 것으로 간주하였다. 경구당 부하 검 사에서 2 g 말토스나 dextrin/kg B.W.을 경구투여한 후 0, 1), 20, 30, 45, 60, 90, 120 min에 꼬리로부터 혈액을 채취하여 혈청 포도당 농도를 측정하였다. 실험 동물 수는 각 군마다 8마리로 하였다.
- 실험 동물 수는 각 군마다 8마리로 하였다. 대조군으로 500 mg의 셀룰로즈를 투여하였다. 경구 당부하 검사에서 혈당 변화는 area under the curve를 계산하여 혈당이 상승하는 정도를 나타내는 지표로 사용하였다.
- 대조군으로 인슐린 0, 1 그리고 50 ng/mL를 사용하였다. 모든 실험은 3 반복하였고, 실험결과는 인슐린과 오매 분획물을 모두 처리하지 않은 것의 값에 대한 비로 나타내었다 (12).
- 반응 후생성 되는 유리 포도당 양을 측정하여 a-glucoamylase의 활성을 측정하였다. 대조군은 오매 분획층의 용매 인 DMSO만을 처리한 것에서 생성되는 유리 포도당 양으로 결정하였다. 결과는 DMSO만을 처리하였을 때 생성되는 유리 포도당 양에 비 해 오매 분획층을 넣었을 때 유리 포도당의 생성이 감소되는 정도를 백분율(%)로 계산하였다.
- 2 M 초산 용액을 넣어주었다. 반응 후생성 되는 유리 포도당 양을 측정하여 a-glucoamylase의 활성을 측정하였다. 대조군은 오매 분획층의 용매 인 DMSO만을 처리한 것에서 생성되는 유리 포도당 양으로 결정하였다.
- Louis, MO, USA)와 함께 오매 분획물을 각각 100 Ug/mL 첨가하여 5일간 배양하였다. 배양 후 3T3- L1 섬유아세포가 지방세포로 분화되는 정도를 조사하였다. 또한 인슐린을 첨가한 유도 분화물질과 함께 오매 분획 물을 처리하여 5일간 배양하였다.
- 않다(1-3). 본 연구팀은 동의보감에서 당뇨병의 처방에 많이 사용하는 50여종의 약초들을 중심 으로 먼저 3T3-L1 섬 유아세포와 지방세포를 사용하여 讥 I戒ro에서 인슐린 민감성이나 인슐린 유사성 물질을 탐색하였다. 효과가 있는 한약재의 분획 층은 더 분리하여 단일 물질로 분리하고 있으며, 이 물질들의 효과는 백서 에 장기간 투여하였을 때 인슐린 민감성이나 인슐린 분비능의 변화를 조사하고 있다.
- Media를 제거 하고 HEPES 용액 에서 37°에서 30분 동안 배양한 후 1 liCi/mL의 ["C]2-deoxyglucose와 1 mM 포도당을 첨가하여 22°C에서 30분 동안 배양할 때 포도당이 세포 내로의 섭 취 정도를 세포내 에 함유된 "c의 양으로 결정하였다. 비 특이 적 인 포도당 섭 취 를 배 제 하기 위 해서 glucose transporter 4(GLUT4)의 작용을 억 제 하는 cyto B와 함께 배양하였을 때의 포도당 이 동량을 빼고 세포내로 이 동한 포도당의 양을 측정 하였다. 세포는 10 mM 포도당이 함유한 PBS 으로 세척하고 0.
- In 疵。에서 오매 추출물이 탄수화물의 소화 흡수에 미치는 영향은 경구 당부하 검사를 변형시켜 측정하였다(13). Sprague Dawley 숫컷 백서 (중앙 실험 동물, Seoul, Korea)를 16시간 동안 금식시킨 후 오매 추출물 500 mg/kg 체중을 투여하고 10분 뒤 에 포도당 대신 dextrin 또는 말토스를 투여 하여 讥勇uo에 서 a-glucoamylase효소의 활성 을 조사하였다.
- 0R, Golden Valley, MN, USA)하여 상등액을 회전 진공 농축기(Bchi R-114, Essen, Germany)로 35°C에서 감압 농축한 후 동결건조(Ilshin Freeze dryer, Seoul, Korea) 하여 분말 추출시료를 만들었다. 열수분말추출시료 1 g을 증류수 10 mL에 현탁시 켜 현탁액으로 만든 후, amberlite XAD-4 gel을 충진한 유지 컬럼(직 경: 30 mm, 길이: 300 mE으로 정제하였다. 이때 용출액은 메탄올의 양을 증량시켜 극성을 변화시키면서 H2O(Fr.
- 오매 1 kg에 70% 에탄올 10 L을 넣고 2시간 열수로 2회 반복 추출한 후 거즈로 여과하고 450xg로 원심 분리 (Meg- afuge 1.0R, Golden Valley, MN, USA)하여 상등액을 회전 진공 농축기(Bchi R-114, Essen, Germany)로 35°C에서 감압 농축한 후 동결건조(Ilshin Freeze dryer, Seoul, Korea) 하여 분말 추출시료를 만들었다. 열수분말추출시료 1 g을 증류수 10 mL에 현탁시 켜 현탁액으로 만든 후, amberlite XAD-4 gel을 충진한 유지 컬럼(직 경: 30 mm, 길이: 300 mE으로 정제하였다.
- 오매를 70% 에탄올로 추출하여 동결건조시 킨 추출물이 in uiuo에 서 a -glucoamylase 활성 을 억 제 하여 식 후 혈 당을 저하시키는 지를 조사하기 위해서 398土62 点 숫컷 백서에게 500 mg/kg B.W의 오매 추출물 또는 셀룰로즈를 공급하고 10분 후에 2 gAg B.W.의 말토스 또는 dexEn을 공급하여 당부하검사를 하였을 때 혈당 변화를 나타내었다. 말토스를 기질로 공급하였을 때 경구 당 부하검사 결과는 최고 혈당값 그리고 혈당 변화 그래프로부터 계산한 area under the curve는 오매 추출물을 투여 한 군과 셀룰로즈를 투여한 대조군 사이 에 차이가 거의 없었다(Fig.
- 오매의 분획물에 인슐린성 물질이 함유되어 있는 지를 조사하기 위하여(11) 유도 분화물질 중 인슐린을 제외한 0.25 RM의 dexamethasone(DEX, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)과 0.5 mM의 l-methyl~3-isobutylxanthine(IBMX, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)와 함께 오매 분획물을 각각 100 Ug/mL 첨가하여 5일간 배양하였다. 배양 후 3T3- L1 섬유아세포가 지방세포로 분화되는 정도를 조사하였다.
- 오매의 분획층이 인슐린 민감성 물질이 함유되어 있는 지의 여부를 조사하기 위해서 3T3-L1 지방세포에 인슐린 1 ng/mL과 함께 각 분획층을 넣고 1시간 동안 배양한 후에 포도당 섭취 정도를 인슐린 50ng/m丄를 처리한 결과와 비교하였다. 대조군으로 인슐린 0, 1 그리고 50 ng/mL를 사용하였다.
- 열수분말추출시료 1 g을 증류수 10 mL에 현탁시 켜 현탁액으로 만든 후, amberlite XAD-4 gel을 충진한 유지 컬럼(직 경: 30 mm, 길이: 300 mE으로 정제하였다. 이때 용출액은 메탄올의 양을 증량시켜 극성을 변화시키면서 H2O(Fr. 1), 20% 메탄올(Fr. 2), 40% 메탄올(Fr. 3), 60% 메 탄올(Fr. 4), 80% 메 탄올(Fr. 5) 및 100% 메탄올 (Fr. 6)으로 나누어 분획하여 감압농축 후 동결건조하여 사용하였다. 각각의 분획 층은 10% DMSO에 1 mg/mL로 녹인 후 sonicator로 20초 동안 진탕하여 침전물 없이 모두 용해시켰다.
- 지방세포로의 분화정도는 생성된 중성지 방의 함량으로 측정 하였다. 중성 지 방의 농도는 중성 지 방 측정 kit(영동제약, 서울, 한국)로 측정하였다.
- 이 두 경우 모두에서 대조군은 오매 분획물이 함유되 지 않은 DMSO를 오매 분획물 대신 첨가하여 배양하였다. 지방세포로의 분화정도는 생성된 중성지 방의 함량으로 측정 하였다. 중성 지 방의 농도는 중성 지 방 측정 kit(영동제약, 서울, 한국)로 측정하였다.
- 한의 학에서 당뇨병 (소갈) 처 방으로 사용되는 생진양혈탕 (生津養血湯)과 황금탕(黃苓湯) 처 방 성 분 중의 하나인 오매의 포도당 이용에 대한 효과를 조사하기 위 해서 오매를 70% 에탄올로 추출한 후 메탄올과 물을 섞은 용액으로 단계별로 XAD-4 column으로 분획하였다. 본 연구에서는 3T3-L1 섬유아세포와 지방세포에서 오매의 추출 분획물이 인슐린처럼 작용하는 인슐린성 물질이거나, 인슐린 작용을 향상시키는인슐린 민감성 물질이 거나, 또는 a -glucoamylase 활성을 억제하는 물질로 작용하는 지 여부를 조사하였다.
대상 데이터
- 본 실험 에 사용한 오매는 서울 경동시장에서 2002년 8월에 구입한 후 한국한의학연구원에서 엄격하게 감별하고 선정한 것을 사용하였고, 일련 번호를 붙이고 한국한의학연구원 표본실에 보관하고 있다.
- 본 연구에서 사용한 3T3-L1 섬유아세포는 생물학적 특성이 잘 밝혀져 있고, 인슐린과 같은 유도물질의 존재하에서는 지방세포로 분화되는 특성을 갖고 있어 분화를 촉진하는 물질인 인슐린과 유사한 물질(인슐린성 물질)의 존재 여부를 탐색하는 실험에 사용한다. 3T3-L1 섬유아세포는 인슐린, DEX와 I3MX로 조성 된 분화유도물질을 첨가하였을 때 지방세포로 전환되는데(14, 15), 이 기전은 아직 확실하게 알려지지는 ??았다.
- 을 경구투여한 후 0, 1), 20, 30, 45, 60, 90, 120 min에 꼬리로부터 혈액을 채취하여 혈청 포도당 농도를 측정하였다. 실험 동물 수는 각 군마다 8마리로 하였다. 대조군으로 500 mg의 셀룰로즈를 투여하였다.
데이터처리
- 오매 추출물의 세포의 분호-능 효과와 in d泊■。에 서 a -glucoamylase 활성 에미치는 영향은 대조군과의 비를 백분율로 계산하여 one sample t-test 방법으로 통계적 유의성을 검증하였다. In 房&에서의 포도당 섭취 실험 에서도 오매의 효과를 셀룰로즈를 공급한 정 상 대조군과 비 교하여 two sample t-test로 통계적 유의성을 검증하였다. 모든 통계 처리의 유의성 검증은 a =0.
- 대조군은 오매 분획층의 용매 인 DMSO만을 처리한 것에서 생성되는 유리 포도당 양으로 결정하였다. 결과는 DMSO만을 처리하였을 때 생성되는 유리 포도당 양에 비 해 오매 분획층을 넣었을 때 유리 포도당의 생성이 감소되는 정도를 백분율(%)로 계산하였다.
- 모든 결과는 세 번 반복에 대한 평균과 표준편차로 계산하여 나타나었다. 지방세포 3T3-L1 에서 포도당 섭취가 증가하는 정도는 인슐린 1 ng/m丄만을 넣고 측정한 값과 인슐린 1 ng/mL와 오매 분획 물을 함께 넣고 측정 한 값을 two sam ple t-test로 통계적 유의 성 을 검증하였다.
- 지방세포 3T3-L1 에서 포도당 섭취가 증가하는 정도는 인슐린 1 ng/m丄만을 넣고 측정한 값과 인슐린 1 ng/mL와 오매 분획 물을 함께 넣고 측정 한 값을 two sam ple t-test로 통계적 유의 성 을 검증하였다. 오매 추출물의 세포의 분호-능 효과와 in d泊■。에 서 a -glucoamylase 활성 에미치는 영향은 대조군과의 비를 백분율로 계산하여 one sample t-test 방법으로 통계적 유의성을 검증하였다. In 房&에서의 포도당 섭취 실험 에서도 오매의 효과를 셀룰로즈를 공급한 정 상 대조군과 비 교하여 two sample t-test로 통계적 유의성을 검증하였다.
- 나타나었다. 지방세포 3T3-L1 에서 포도당 섭취가 증가하는 정도는 인슐린 1 ng/m丄만을 넣고 측정한 값과 인슐린 1 ng/mL와 오매 분획 물을 함께 넣고 측정 한 값을 two sam ple t-test로 통계적 유의 성 을 검증하였다. 오매 추출물의 세포의 분호-능 효과와 in d泊■。에 서 a -glucoamylase 활성 에미치는 영향은 대조군과의 비를 백분율로 계산하여 one sample t-test 방법으로 통계적 유의성을 검증하였다.
성능/효과
- 즉, 오매 분획 층 Fr. 4, 5, 6은 인슐린의 필요량을 30〜50배 감소시 킨다는 것을 알 수 있었다. 그 중에서도 Fr.
- 5). 그러나 dextrin을 투여하여 경구 당부하 검사를 한 경우에 혈당이 급격하게 증가하지 않고 15분에서 60분까지 거의 일정한 농도를 유지 하는 것으로 보아 q-shicoamylase의 활성을 억 제하여 dextrin 이 천천히 분해되 어 혈당이 급격하게 상승하는 것을 방지한 것으로 추정된다.
- 5가 포도당 흡수를 가장 많이 증가시 켰다. 그러므로 메탄올 60%, 80% 그리고 100%에서 용출된 분획층에 인슐린 민감성 물질이 함유되어있다는 것을 알 수 있었고, 인슐린 민감성 물질의 후보자들은 비 극성 에 가까운 양쪽성 물질 일 가능성 이 높다고 예측하고 있다.
- 001)로 유의성 있게 분화를 촉진시 켰다. 또한 분화유도 물질과 함께 분화유도물질을 첨가하였을 때도 1 Ug/mL에서는 122.3土5.3%(p<0.05)로 분화를 촉진시켜 인슐린성 물질로 작용한다는 것을 알 수 있었다. 또한 Kameda 등(18)은 인슐린은 지 방세포에서 지 방분해를 저해하고 지방합성을 촉진 하는 호르몬으로 인슐린처럼 지방합성을 촉진 시키든지 지방분해를 억제하는 물질을 인슐린성 물질이라고 정의하였고, 로얄제 리 로부터 불포화지방산 trans-10-hydroxy-2- decanoic acid와 마황에서 non-pseudoephedrine이 인슐린 성 물질임을 확인하였다.
- 본 연구의 Fig. 1에서 보여준 것처럼 3T3-L1 지방세포에 처리한 인슐린 농도가 50 ng/mL까지는 인슐린 농도가 높아짐에 따라 포도당 섭취가 증가하였으나 그 후에는 인슐린 농도가 높아져도 포도당 섭취가 증가하지 않았다. 즉, 50 ng/ mL 인슐린 농도가 인슐린 수용체를 통한 인슐린 작용을 나타내는 최대 농도로 이 농도 이하에서는 인슐린 농도에 비 례하여 인슐린 작용이 증가하지만 그 이상 증가하지 않는다는 것을 알 수 있었다.
- 인슐린을 처리하면 3T3-L1 지방세포의 세포막에 인슐린이 결합하고 이것은 일련의 인슐린 신호전달체계인 insulin receptor substrate- 1(IRS 1)-phosphatidyl inositol-3-phosphate(Pl3 kinase)-Akt의 과정 을 증폭시 킨다. 이 결과로 GLUT4가 세포막으로 translocation되는 것이 증가하게 되어 포도당의 흡수를 증가시키는 것으로 사료된다. 그러므로 3T3-L1 지방세포는 인슐린의 작용력을 향상시키는 물질을 탐색하거나 인슐린 신호전달체계를 연구하는 모델로 적합하다고 사료된다(12, 14).
- 인슐린을 첨가하지 않고 분획층만을 넣은 상태에서 포도당을 흡수하는 정도를 측정 하였는데 그 값이 기 저 값과 유사하거나 오히려 낮아 분획물이 세포막을 투과적으로 만드는 detergent로 작용하여 비 특이 적 으로 포도당의 흡수를 증가시키는 것은 아니라는 것을 확인하였다. 다른 연구에서도 천연물 추줄물을 처 리하였을 때 인슐린 작용을 증가시 켜 포도당 흡수를 증가시키는 것들이 있다고 보고하였다.
- 1에서 보여준 것처럼 3T3-L1 지방세포에 처리한 인슐린 농도가 50 ng/mL까지는 인슐린 농도가 높아짐에 따라 포도당 섭취가 증가하였으나 그 후에는 인슐린 농도가 높아져도 포도당 섭취가 증가하지 않았다. 즉, 50 ng/ mL 인슐린 농도가 인슐린 수용체를 통한 인슐린 작용을 나타내는 최대 농도로 이 농도 이하에서는 인슐린 농도에 비 례하여 인슐린 작용이 증가하지만 그 이상 증가하지 않는다는 것을 알 수 있었다. 그러므로 인슐린 민감성 물질을 탐색할 때 저농도의 인슐린과 탐색하고자 하는 물질을 처리하였을 때 포도당의 흡수가 현저하게 증가하는 경우는 처리한 물질을 인슐린 민감성 물질로 간주할 수 있다.
- 나머지 분획층을 처리한 경우는 DMSO만을 처리한 대조군에 비해 지방 세포로의 전환을 촉진하거나 억제하지 않았다. 즉, 오매에는 지방의 생성을 억제하는 물질이 모두 함유되어 있는 것을 알 수 있었다. 현재 어떤 기전에 의해서 지방 합성이 억제되는 지에 대한 연구를 진행하는 중이다(Table 1).
- 인슐린 민감성 물질은 제2형 당뇨병의 근본적 인 문제인 인슐린 저항성 을 완화시 켜 소량의 인슐린으로 혈당을 정상화시 키고 궁극적으로 혈당에 필요한 인슐린 양을 저하시켜 고인슐린혈증을 없애줄 수 있는 것으로 알려지고 있다(19, 20). 즉, 인슐린 민감성 물질은 당뇨병뿐 아니라 인슐린 저항성 증후군의 증세를 완화시 킬 수 있을 것으로 사료된다. 결국 인슐린 저항성을 완화시킨다는 것은 인슐린이 인슐린 수용체와 결합한 후 세포내에서 일어나는 신호전달 체계가 원활하게 일어날 수 있도록 도와주어 세포에서 포도당의 이용을 향상시키는것이다.
- 한편 인슐린을 포함한 분화유도물질과 함께 오매 분획물을 처리하였을 때 중성지방 생성량이 낮은 것은 중성지방의 분화를 방해하는 것으로 비 만을 방지할 수 있는 것으로 간주하였다. 오매 분획 물 중 Fr.
후속연구
- 그러 나 in uiuo에서 는 오매 에탄올 추출물을 말토스나 dextrin을 투여하기 10분전에 투여하였을 때 최고혈당 값과 area under the curve 값은 대조군과 차이 가 없었다. 결론적으로 오매 에는 지 방 세포의 분화를 억제하는 물질과 인슐린 민감성을 향상시키는 물질이 함유하고 있으므로 비 만을 동반한 당뇨병 및 인슐린 저항성의 치료와 예방에 중요한 역할을 할 것으로 사료된다.
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