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문제 정의
- 본 연구에서는 주로 약재로 사용되었던 오매의 열수 추출물, 에탄올 추출물, 발효 공정을 적용한 추출물을 대상으로 하여 항산화 및 세포독성, 피부미백, 항염증 효능을 비교하여 오매를 활용한 화장품 원료 소재의 이용가치를 규명함으로써 산업적 응용 가능성을 알아보고자 하였다.
- 최근 염증 유발에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 NO생성에 대한 오매 추출물들의 효과를 알아보기 위해 본 연구에 서는 LPS로 활성화 시킨 RAW 264.7 대식세포를 사용 하였고, 자극에 의해 유도되는 NO 생성을 억제시키는 항염증 실험을 하였다. 그 결과 LPS 처리 시 아무 처리도 하지 않았을 때 보다 약 10배 이상의 NO가 증가됨을 확인하였고, 오매 추출물들이 LPS로 인한 NO생성을 농도 의존적으로 감소시킴을 확인하였다 (Fig.
제안 방법
- B16-F10 melanoma 세포를 이용하여 멜라닌 생성 억제능을 측정하였다 (Lim et. al., 2003). 96 well plate에 B16-F10 세포를 1 × 104 cells/well의 농도로 분주하고, 세포가 바닥에부착할 수 있도록 24시간 동안 배양한 후 melanin 생성을 촉진하기 위하여 혈청 5%와 α-MSH 10 nM, theophilline 2 mM이 포함된 배지로 갈아준다.
- 7 세포 (rat macrophage)는 한국세포주은행에서 구입하였고 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)에 10% fetal bovine serum과 penicillin/streptomysin (100 IU/50 ㎍/㎖)을 첨가하여 37℃로 유지되는 5% CO2 배양기에서 배양하였다. B16-F10 melanoma 세포를 이용하여 세포내 멜라닌 생성 억제 실험을 수행하였고, RAW 264.7 세포를 이용하여 세포내 NO 생성을 측정하였다.
- B16-F10 세포에 α-MSH 10 nM과 theophilline 2 mM를 처리하여 멜라닌 생성을 유도하고 동시에 오매 추출물 50, 100, 250, 300 ㎍/㎖의 농도로 처리한 후 72시간 배양하고 상등액을 흡광도로 측정하였다.
- rat 유래 대식세포인 RAW 264.7 세포를 6 well plate에 well 당 1 × 106 로 분주하고 오매 추출물을 각각 10, 30, 50, 70, 100, 150, 200, 300 ㎍/㎖ 의 농도로 가한 후 Lipopolysaccharide (LPS) 1 ㎍/㎖ 을 첨가하여 세포를 자극하고 24시간 배양하였다.
- 총 폴리페놀 함량 측정은 Folin-Denis 방법을 수정하여 Folin-reagent가 추출물의 페놀성 화합물에 의해 환원되어 몰리브덴 청색으로 발색되는 원리를 이용하여 정량하였다 (Gutfinger, 1981). 각 추출물 0.2 ㎖ 에 3차 증류수 5 ㎖ 를 가한 후 Folin-reagent 시약을 0.5 ㎖ 씩 차례로 가한 다음 실온에 3분간 방치한 후 2% Na2CO3 용액 1 ㎖ 를 혼합하고 다시실온에 1시간 방치한 후 microplate reader를 이용하여 729 ㎚ 에서 흡광도를 측정하였다. 0-100 ㎍/㎖ 농도로 제조한 오매 추출물들의 총 폴리페놀 함량은 caffeic acid (Sigma, USA)를 표준물질로 이용하여 작성한 표준곡선으로부터 환산 하였다.
- , 2000). 각 추출물 0.5 ㎖ 농도의 시료액에 10% aluminium nirate 0.1 ㎖ 와 1 M potassium acetate 0.1 ㎖ 및 ethanol 4.3 ㎖를 차례로 가하여 혼합하여 실온에서 40분간 방치한 후 microplate reader를 이용하여 415 ㎚ 에서흡광도를 측정하였다. 0-100 ㎍/㎖ 농도 범위로 제조한 오매 추출물들의 총플라보노이드 함량은 quercetin (Sigma USA)을 표준물질로 사용하여 작성한 표준곡선으로부터 환산하였다.
- )로 전환 반응을 촉매하는 pyrogallol의 생성량을 측정하여 SOD 유사활성 으로 나타내었다 (Marklund and Marklund, 1974). 각각의 오매 추출물들 0.2 ㎖ 에 tris-HCl 완충용액 (50 mM tris [hydroxymethyl] amino-methane + 10 mM EDTA, pH 8.5) 2.6 ㎖ 와 7.2 mM pyrogallol 0.2 ㎖ 를 첨가하고 실온에서 20분간 반응시킨 후 1 N HCl 0.1 ㎖를 가하여 반응을 정지시켰다. 반응액 중 산화된 pyrogallol의 양은 microplate reader를 이용하여 420 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
- 2 여과지로 여과시킨 후 멸균 필터지로 필터링 한 다음 이를 다시 동결 건조시켜 오매 추출물을 얻었다(sample 2-LP). 또한 유산균주를 Lactobacillus plantarum (KCTC 3108)에서 Lactobacillus acidophillus (KCTC 3164)로 바꾸어 위와 동일한 방법으로 발효 공정을 이용한 오매 추출물을 얻었다 (sample 2-LA).
- 오매 300 g을 믹서기로 교반 분쇄 후 3 ℓ 의 증류수에 넣고 autoclave한 후 MRS 배지에서 배양한 Lactobacillus plantarum (KCTC 3108)의 흡광도가 1이상이 되었을 때 부피 비로 10% (V/V) 접종하고 발효는 1 ℓ 삼각플라스크를 이용 하여 24시간 진탕 배양하였다. 발효가 끝나면 환류 가열기를 이용하여 3시간 동안 가열하고 원심분리를 이용하여 상등액을여과하고 같은 방법으로 2회 반복 여과하였다. 모든 여액을 Whatman No.
- 세포 주는 RAW 264.7세포를 사용하였으며, 96 well plate에 well 당 1 × 104 농도로 분주하여 24 시간 부착하고 오매 추출물을 각각 10, 30, 50, 70, 100 ㎍/㎖의 농도가 되도록 첨가한 후 48시간 동안 37℃에서 CO2 배양기에서 배양하였다.
- 양성대조군으로 arbutin을 배양용 배지에 용해하여 사용하였으며 분비된 멜라닌의 양은 microplate reader를 이용하여 490 ㎚에서 측정하였고 멜라닌 생성량을 α-MSH 무처리군과 비교하여 백분율로 표시하였다.
- 배양된 세포는 배양액을 NR solution (Sigma) 1%가 포함된 무혈청 배지로 교환하여 3시간 동안 배양한 뒤 48시간 후 배양 용액을 버리고 neutral red의 결정화 유무확인 후 formaldehyde 용액 10%가 들어간 PBS (phosphate buffered saline solution)를 이용하여 100 ㎕로 20분간 처리하여 세포를 고정화 시켰다. 여기에 NR desorb solution (1% glacial acetic acid, 49% ethanol, 50% distilled water)을 각 well에 100 ㎕ 씩 분주하고 세포내 neutral red를 추출하여 ELISA microplate reader (540 ㎚)로 측정하였다.
- 오매 추출물들의 항산화력을 알아보기 위한 방법으로 전자 공여능을 비교하여, 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl (DPPH, Sigma, USA)에 대한 소거활성을 측정하였다 (Perez et al., 2004). 에탄올에 녹인 100 µM DPPH 용액 180 ㎕와 오매 추출물들을 각각 20 ㎕ 씩 96 well plate에 첨가하고 37℃에서 20분간 반응시켰다.
- 오매 추출물의 멜라닌 생성 억제 효과를 확인하기 위하여 멜라닌세포가 생산하는 멜라닌 생성량을 비교하였다. B16-F10 세포에 α-MSH 10 nM과 theophilline 2 mM를 처리하여 멜라닌 생성을 유도하고 동시에 오매 추출물 50, 100, 250, 300 ㎍/㎖의 농도로 처리한 후 72시간 배양하고 상등액을 흡광도로 측정하였다.
- 오매 추출물의 세포독성을 알아보기 위하여 RAW 264.7 세포에 오매 추출물들을 10, 30, 50, 70, 100, 150, 200, 300 ㎍/㎖의 농도로 처리하여 독성에 의한 세포 생존률을 측정하였다. 5종의 오매 추출물들 모두 전체적으로 높은 생존률을 보였으며, 특히 300 ㎍/㎖ 의 농도에서도 sample 1과 sample2-LP는 80%이상의 생존률을 보였다 (Fig.
- 96 well plate에 B16-F10 세포를 1 × 104 cells/well의 농도로 분주하고, 세포가 바닥에부착할 수 있도록 24시간 동안 배양한 후 melanin 생성을 촉진하기 위하여 혈청 5%와 α-MSH 10 nM, theophilline 2 mM이 포함된 배지로 갈아준다. 이때 오매 추출물들을 각각 50, 100, 250, 300 ㎍/㎖ 농도로 처리하며 72시간 배양 후배지를 제거하고 세포를 PBS로 세척하였다. 양성대조군으로 arbutin을 배양용 배지에 용해하여 사용하였으며 분비된 멜라닌의 양은 microplate reader를 이용하여 490 ㎚에서 측정하였고 멜라닌 생성량을 α-MSH 무처리군과 비교하여 백분율로 표시하였다.
- 총 폴리페놀 함량 측정은 Folin-Denis 방법을 수정하여 Folin-reagent가 추출물의 페놀성 화합물에 의해 환원되어 몰리브덴 청색으로 발색되는 원리를 이용하여 정량하였다 (Gutfinger, 1981). 각 추출물 0.
대상 데이터
- 발효 공정에 사용된 시험균주로는 유산균인 Lactobacillus plantarum (LP2, KCTC 3108), Lactobacillus acidophillus(LA, KCTC 3164)가 이용되었으며 한국세포주은행 (KCTC)으로부터 구입하여 사용하였다. 실험에 사용된 B16-F10 melanoma 세포와 RAW 264.
- 실험에 사용된 B16-F10 melanoma 세포와 RAW 264.7 세포 (rat macrophage)는 한국세포주은행에서 구입하였고 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)에 10% fetal bovine serum과 penicillin/streptomysin (100 IU/50 ㎍/㎖)을 첨가하여 37℃로 유지되는 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
- 실험에 사용된 시약은 DPPH (1,1-diphenyl-2-picryl-hydr azyl), BHT (Butylated Hydroxy Toluene), DNS (3,5-dinitrosalocylic acid), glucose, caffeic acid, quercetin, arbutin, pyrogallol, griess reagent, Tris-HCl buffer (tris [hydroxymethyl] amino-methane+EDTA), LPS (Lipopolysaccharide), aluminium nirate, potassium acetate, sodium phosphate buffer, DMEM (Dulbecco‘s modified Eagle’s medium), α-MSH (α-melanocyte stimulating hormone), L-DOPA (L-3,4-dihydroxyphenylalanin), fetal bovine serum, penicillin, streptomysin, formaldehyde, NR desorb solution, theophilline, PBS (phosphate buffered saline solution)를 Sigma (USA)로부터 구입하여 사용하였으며, 그 외의 기타 시약은 특급시약을 사용하였다. 실험에 사용된 기기는 microplate reader (Synergy-HT, BIO-TEK Instruments, USA), CO2 incubator (MCO 175, Sanyo Electric Co., Japan), pH meter (Orion, 520A, USA), 냉동건조기 등을 사용하여 측정하였다.
- 실험에 사용된 시약은 DPPH (1,1-diphenyl-2-picryl-hydr azyl), BHT (Butylated Hydroxy Toluene), DNS (3,5-dinitrosalocylic acid), glucose, caffeic acid, quercetin, arbutin, pyrogallol, griess reagent, Tris-HCl buffer (tris [hydroxymethyl] amino-methane+EDTA), LPS (Lipopolysaccharide), aluminium nirate, potassium acetate, sodium phosphate buffer, DMEM (Dulbecco‘s modified Eagle’s medium), α-MSH (α-melanocyte stimulating hormone), L-DOPA (L-3,4-dihydroxyphenylalanin), fetal bovine serum, penicillin, streptomysin, formaldehyde, NR desorb solution, theophilline, PBS (phosphate buffered saline solution)를 Sigma (USA)로부터 구입하여 사용하였으며, 그 외의 기타 시약은 특급시약을 사용하였다.
- 오매는 경북 지역에서 생산 가공된 국내산을 구입하여 직경 1~1.5 ㎝ 되는 것을 골라 이물질을 제거하고 사용하였다.
이론/모형
- 실험에서 사용된 오매 추출물의 세포독성을 알아보기 위하여 Neutral Red (NR) assay를 수행하였다 (Borenfreund and Puemer, 1985). 세포 주는 RAW 264.
- 오매 추출물의 NO 생성 저해능을 측정하기위하여 Green 등의 (Green et al., 1982) 방법에 따라 세포배양액 내 nitric oxide (NO) 양을 nitrite (NO2−)와 nitrate (NO3−)형태로 측정하였다.
- 총 플라보노이드 함량은 Moreno 방법을 이용하여 측정하였다 (Moreno et al., 2000). 각 추출물 0.
성능/효과
- α-MSH 및 theophilline 처리군에서 생성된 멜라닌 양을 100%로 보았을 때 오매 추출물 처리군 모두에서 농도 의존적으로 멜라닌 생성저해 효과를 확인 할 수 있었다.
- 7 세포에 오매 추출물들을 10, 30, 50, 70, 100, 150, 200, 300 ㎍/㎖의 농도로 처리하여 독성에 의한 세포 생존률을 측정하였다. 5종의 오매 추출물들 모두 전체적으로 높은 생존률을 보였으며, 특히 300 ㎍/㎖ 의 농도에서도 sample 1과 sample2-LP는 80%이상의 생존률을 보였다 (Fig. 1). 그 중에서 Lactobacillus plantarum (LP, KCTC 3108)으로 생물 전환한 Sample 2-LP는 모든 처리농도 (10, 30, 50, 70, 100, 150, 200 ㎍/㎖)에서 100.
- 7 대식세포를 사용 하였고, 자극에 의해 유도되는 NO 생성을 억제시키는 항염증 실험을 하였다. 그 결과 LPS 처리 시 아무 처리도 하지 않았을 때 보다 약 10배 이상의 NO가 증가됨을 확인하였고, 오매 추출물들이 LPS로 인한 NO생성을 농도 의존적으로 감소시킴을 확인하였다 (Fig. 3) 따라서, 오매 추출물들은 항염에 의한 손상을 효과적으로 저해할 것이라 생각된다. 특히 발효공정을 적용한 추출물인 sample 2-LP를 10 ㎍/㎖처리한 군에서는 LPS 로 증가된 NO 생성량이 LPS 처리군에 비해 40% 이상의 감소율을 나타내었으며 300 ㎍/㎖ 의 농도에서는 60% 이상의 NO 생성 저해를 일으키는 것을 확인할 수 있었다.
- 1). 그 중에서 Lactobacillus plantarum (LP, KCTC 3108)으로 생물 전환한 Sample 2-LP는 모든 처리농도 (10, 30, 50, 70, 100, 150, 200 ㎍/㎖)에서 100.78%, 98.62%, 98.23%, 98.23%, 96.27%, 96.27%, 92.93%로 세포 생존률이 안정적으로 나왔으며 300 ㎍/㎖ 의 농도에서도 83.3%의 생존률로 세포 독성이 낮아 세포의 생존률에 크게 영향을 주지 않는다는 것을 알게 되었고 화장품 원료 개발 및 응용에 적합할 것으로 사료된다.
- 3%의 활성을 보였다. 본 실험에 사용된 오매 추출물들 중 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량이 높았던 Sample2-LA와 Sample 3가 프리라디칼 소거능 측정에서도 활성도가 높았다는 사실은 Park (2002)과 Lim 등 (2004) 의 연구에서 프리라디칼 소거활성과 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량은 양의 상관관계를 나타낸다고 보고한 결과와도 일치하며, 오매 추출물 속의 총 폴리페놀 및 플라보노이드도 오매의 항산화 활성에 기여할 것으로 생각되었다.
- 본 연구에서 오매를 대상으로 하여 열수 추출 및 에탄올 추출, 발효 공정을 적용하여 추출한 결과 오매 추출물들은 세포독성을 나타내지 않으면서 항산화 및 피부미백, 항염증 효과 등을 가지는 것을 확인 할 수 있었다. Kim 등 (2009)은 생더덕과 발효더덕의 생리활성비교를 통해 발효에 따른 미생물의 영향으로 발효더덕의 유용성분의 용출이 증가되었다고 보고하였는데 본 연구에서도 유산균주를 이용한 발효 공정을 적용한 추출물들이 열수 추출 시료 (sample 1)에 비해 항산화 및 세포 활성들이 증가한 것은 발효의 영향이라 사료된다.
- 오매 추출물들의 SOD 유사활성을 측정한 결과 발효공정 적용 추출물인 Sample 2-LP와 에탄올 추출물인 Sample 3에서 58.8%와 53.3%의 활성을 나타내는 반면, 열수 추출물인 Sample 1은 46.3%의 활성을 나타내어 열수 추출물보다는 발효공정을 이용한 추출물과 에탄올 추출물의 SOD유사활성이 더 높음을 알 수 있었다. 이는 Chung 등 (1998)의 연구에서 보고된 약용식물 60여종의 평균 34.
- Ha 등 (2010)은 유산균주를 이용하여 매자나무 수피 발효물의 총 폴리페놀 함량이 일반 매자 나무 수피 추출물의 함량보다 약 30~40% 증가하였다고 보고하였고, Hong (2010)도 비 발효 녹차보다 발효녹차에서 총 폴리페놀량이 유의한 증가를 보고 하였으며, Park (2010)의 연구에서도 홍삼보다 발효 홍삼의 총 페놀성 화합물이 높다고 보고 하였다. 이는 발효과정 중 연화된 조직에서 각종 생리기 능성 물질의 용출이 용이해지기 때문이라 생각되는데 본 연구에서도 열수 추출물의 폴리페놀 함량 3.84 ㎎/㎖에 비해 유산균이 첨가된 발효 공정을 적용한 추출물들에서의 총 폴리페놀량이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
- 088 ㎎/㎕로 두 번째로 높았다. 총 폴리페놀 함량과 플라보노이드 함량 모두 sample2-LA, 에탄올 추출물 순으로 높았다. Ha 등 (2010)은 유산균주를 이용하여 매자나무 수피 발효물의 총 폴리페놀 함량이 일반 매자 나무 수피 추출물의 함량보다 약 30~40% 증가하였다고 보고하였고, Hong (2010)도 비 발효 녹차보다 발효녹차에서 총 폴리페놀량이 유의한 증가를 보고 하였으며, Park (2010)의 연구에서도 홍삼보다 발효 홍삼의 총 페놀성 화합물이 높다고 보고 하였다.
- 총 폴리페놀 함량은 caffeic acid를 표준물질로 사용한 표준곡선으로부터 환산한 결과 시료 1 ㎖ 당 총 폴리페놀의 함량은 sample2-LA의 총 폴리페놀량이 4.94 ㎎/㎖로 가장 높았으며 sample2-LP와 에탄올 추출물인 Sample 3의 총 폴리페놀량이 4.71 ㎎/㎖ 로 동일했다. 총 플라보노이드 함량은 quercetin을 표준물질로 사용한 표준곡선으로부터 환산한 결과시료 1 ㎖ 당 발효공정을 이용한 추출물인 sample2-LA의 총폴리페놀량이 0.
- 71 ㎎/㎖ 로 동일했다. 총 플라보노이드 함량은 quercetin을 표준물질로 사용한 표준곡선으로부터 환산한 결과시료 1 ㎖ 당 발효공정을 이용한 추출물인 sample2-LA의 총폴리페놀량이 0.097 ㎎/㎕ 로 가장 높았으며 에탄올 추출물인 sample 3의 총 폴리페놀량이 0.088 ㎎/㎕로 두 번째로 높았다. 총 폴리페놀 함량과 플라보노이드 함량 모두 sample2-LA, 에탄올 추출물 순으로 높았다.
- 3) 따라서, 오매 추출물들은 항염에 의한 손상을 효과적으로 저해할 것이라 생각된다. 특히 발효공정을 적용한 추출물인 sample 2-LP를 10 ㎍/㎖처리한 군에서는 LPS 로 증가된 NO 생성량이 LPS 처리군에 비해 40% 이상의 감소율을 나타내었으며 300 ㎍/㎖ 의 농도에서는 60% 이상의 NO 생성 저해를 일으키는 것을 확인할 수 있었다.
- α-MSH 및 theophilline 처리군에서 생성된 멜라닌 양을 100%로 보았을 때 오매 추출물 처리군 모두에서 농도 의존적으로 멜라닌 생성저해 효과를 확인 할 수 있었다. 특히, Sample 2-LP 추출물 처리군은 추출물 농도 50, 100, 250, 300 ㎍/㎖ 에서 각각 70.75%, 55.86%, 52.31, 48.14%로 감소하였으며, 추출물 농도 50 ㎍/㎖ 이상에서 양성대조군으로 사용된 알부틴 100 ㎍/㎖ 처리군 보다 우수한 멜라닌 생성 억제능을 보여 (Fig. 2) 오매 추출물의 미백효과를 일정 수준 기대할 수 있을 것으로 사료된다.
후속연구
- Kim 등 (2009)은 생더덕과 발효더덕의 생리활성비교를 통해 발효에 따른 미생물의 영향으로 발효더덕의 유용성분의 용출이 증가되었다고 보고하였는데 본 연구에서도 유산균주를 이용한 발효 공정을 적용한 추출물들이 열수 추출 시료 (sample 1)에 비해 항산화 및 세포 활성들이 증가한 것은 발효의 영향이라 사료된다. 특히 Lactobacillus plantarum (KCTC 3108)을 이용하여 발효 공정을 적용한 오매 추출물은 세포독성을 나타내지 않으면서도 피부 미백 효과와 항염증 효과가 우수해 기능성 화장품 소재로서의 활용 가능성을 기대할 수 있으며, 향후 미생물과 발효된 물질에 대한 연구가 더 이루어 져야 할 것이라 사료된다.
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