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문제 정의
- 에 의하면 인간과 설치류 간에 혈소판의 수용기에 차이가 있다고 하였다. 따라서 설치류에서 효능이 검증된 오매(Mume Fructus) 추출물에 대한 사람의 혈액 응고에 미치는 영향을 평가 하였다. 김 등21)의 보고에 의하면 정상인의 경우 aPTT 23.
- 본 연구에서는 민간 요법으로 사용되어 온 오매(Mume Fructus)의 추출물을 대상으로 in vitro, in vivo를 통하여 혈소판 응집 억제, 혈전용해 등을 검증하였으며, 그 효과를 보고하고자 한다.
- 본 연구에서는 천연물을 대상으로 항혈소판 응집억제와 혈전용해 효과를 중심으로한 혈행개선 소재를 발굴하고자 하였으며, 그 결과 오매(Mume Fructus)에서 항혈소판 응집억제와 혈전용해 효과를 확인하였다. 오매(Mume Fructus)는 장미과의 매실나무(Prunus mume.
- 본 연구에서는 한국에서 민간요법으로 사용되고 있는 장미과의 매실나무(Prunus mume.)의 덜 익은 열매를 매연으로 훈증시킨 오매(Mume Fructus) 추출물을 이용하여 혈소판의 응고, 항산화능, 혈전용해, mice tail bleeding time, aPTT, 그리고 PT에 미치는 효과를 알아보았다. 그 결과, 혈소판 응고 억제, 혈액응고시간 연장 및 혈전용해 활성 모두에 효과가 좋은 것으로 나타났다.
가설 설정
- 1)IC50 value is the concentration of sample required for 50% inhibition.
제안 방법
- 17-19) 오매(Mume Fructus) 추출물을 3일간 경구 투여 후, mouse tail bleeding time system을 이용하여 혈행개선 효과를 시험하였다. 물을 투여한 대조군의 경우 77.
- mice에 물, Clopidogrel, 그리고 오매추출물 50 mg/kg, 100 mg/kg, 250 mg/kg을 3일간 각각 경구투여 하였으며 마지막 투여 후 60분이 되었을 때 ketamin hydrochloride(75 mg/kg)으로 마취시키고 mice의 꼬리 끝으로부터 4 mm 되는 부분을 surgical blade로 자르고 꼬리의 나머지 부분을 37oC의 생리식염수에 직각으로 담갔다. Bleeding time은 꼬리를 자른 시간부터 측정하여 bleeding이 처음 멈춘 시간 까지를 기준으로 하여 측정하였다. 또한 300초 이상 bleeding이 된 경우 300초로 기록하였다.
- Germany) 50 µl를 넣음과 동시에 응고시간을 측정하였다. Clotting time 측정은 Sysmex CA-540(Sysmex Co., Japan)으로 측정하였다.
- Mice tail bleeding time은 Hornstra 법16)을 수정하여 측정하였다. mice에 물, Clopidogrel, 그리고 오매추출물 50 mg/kg, 100 mg/kg, 250 mg/kg을 3일간 각각 경구투여 하였으며 마지막 투여 후 60분이 되었을 때 ketamin hydrochloride(75 mg/kg)으로 마취시키고 mice의 꼬리 끝으로부터 4 mm 되는 부분을 surgical blade로 자르고 꼬리의 나머지 부분을 37oC의 생리식염수에 직각으로 담갔다.
- 을 수정하여 측정하였다. mice에 물, Clopidogrel, 그리고 오매추출물 50 mg/kg, 100 mg/kg, 250 mg/kg을 3일간 각각 경구투여 하였으며 마지막 투여 후 60분이 되었을 때 ketamin hydrochloride(75 mg/kg)으로 마취시키고 mice의 꼬리 끝으로부터 4 mm 되는 부분을 surgical blade로 자르고 꼬리의 나머지 부분을 37oC의 생리식염수에 직각으로 담갔다. Bleeding time은 꼬리를 자른 시간부터 측정하여 bleeding이 처음 멈춘 시간 까지를 기준으로 하여 측정하였다.
- 방법을 이용하여 민간에서 사용하는 혈행개선에 관련된 생약 수종을 검색하였다(data not shown). 각각의 추출물을 PRP에 혼합한 후 ADP에 의해서 혈소판의 응고를 유도 시켰다. Fig.
- 내인성 혈액응고 과정의 항응고 활성은 activated partial thromboplastin time(aPTT)으로 측정하였다. aPTT 측정은 생리식염수로 희석한 PRP 50 µl에 시료용액을 넣고 교반한 후 37℃ 항온수조에서 1분간 가온하였다.
- , USA)를 1 µg/ml이 되도록 가한 후 37oC에서 4분간 배양하였다. 배양액으로부터 현미경하에서 혈소판의 응집도를 관찰하였다.
- 시료의 free radical 소거 활성은 stable radical인 1,1-diphenyl2-picrylhydrazyl(DPPH)를 이용하여 측정하였다.15) 에탄올에 용해시킨 0.
- 투명환의 면적은 양성 대조군으로 사용한 대두발효추출물의 면적과 비교하였다. 양성대조군인 대두 발효추출물을 2 mg/disk를 점적하고, 오매 추출물은 1 mg/disk, 2 mg/disk 그리고 4 mg/disk로 점적한 다음 37oC incubator에서 1시간 동안 방치하였다. 용해된 투명환의 크기를 측정한 결과 양성대조군인 대두발효추출물에서는 1.
- 여기에 50 µl Actin® FS(Dade behring. Germany)을 첨가한 후 20 mM CaCl2(Dade behring. Germany) 50 µl를 넣음과 동시에 응고시간을 측정하였다.
- 여기에 Thromborel® S(Dade behring, Germany) 100 µl를 가한 후 응고시간을 측정하였다.
- 오매(Mume Fructus) 추출물의 free radical scavenging 활성 측정은 stable radical인 DPPH에 대한 환원력을 측정하였다. 오매(Mume Fructus) 추출물은 사용된 범위 내에서 농도 의존적으로 radical-scavenging 효과가 나타났으나, IC50값이 185.
- 외인성 경로에 기인하는 항응고 활성은 prothrombin time(PT)으로 측정하였다. 생리식염수로 희석한 PRP 50 µl에 시료용액 넣고 교반한 후 37oC 항온수조에서 1분간 가온하였다.
- Korea)을 사용하였다. 이들 plate를 37oC에서 1시간 동안 배양한 후 fibrin이 가수분해됨에 따라서 생기는 투명환의 크기를 측정하였다.
- 의 Modified smear method을 이용하여 생약추출물의 혈소판응집 억제작용을 측정하였다. 즉 오매(Mume Fructus)추출물(ME)을 DMSO에 필요 농도로 녹여 사용하였으며 이때 DMSO의 최종 농도는 1%가 되도록 하였다. 랫트(SpragueDawley) 혈액을 200×g로 10분간 원심 분리하여 얻은 상층액 혈소판혈장(Platelet rich plasma, PRP) 0.
- 채혈 지원자는 성인남자로 선정하고 채혈하기 일주일 전부터 아스피린이나 비스테로이드 항염증약을 복용하지 않도록 하였다. 일정시간에 채혈 한 후 혈액응고가 일어나지 않도록 하기 위해서 3.
- 혈관이 생리적 손상을 받을 경우 혈소판의 침착으로 혈전이 발생되는데 이러한 혈전을 오매(Mume Fructus) 추출물이 용해하는지를 Fibrin plate method에 따라 농도별로 점적하여 혈전 용해 활성을 측정하였다. 투명환의 면적은 양성 대조군으로 사용한 대두발효추출물의 면적과 비교하였다. 양성대조군인 대두 발효추출물을 2 mg/disk를 점적하고, 오매 추출물은 1 mg/disk, 2 mg/disk 그리고 4 mg/disk로 점적한 다음 37oC incubator에서 1시간 동안 방치하였다.
- 혈관이 생리적 손상을 받을 경우 혈소판의 침착으로 혈전이 발생되는데 이러한 혈전을 오매(Mume Fructus) 추출물이 용해하는지를 Fibrin plate method에 따라 농도별로 점적하여 혈전 용해 활성을 측정하였다. 투명환의 면적은 양성 대조군으로 사용한 대두발효추출물의 면적과 비교하였다.
- 그리고 혈액을 200×g에 10분간 원심분리하여 상등액의 PRP(platelet rich plasma)를 얻었다. 혈소판 수는 혈구분석기(Sysmex, JP)로 측정하였다.
- 혈소판 응집을 억제하는 물질은 혈소판 응집 유도 물질에 의한 응집 억제에도 영향을 줄 것으로 예상하고 Modified smear method12,13)방법을 이용하여 민간에서 사용하는 혈행개선에 관련된 생약 수종을 검색하였다(data not shown). 각각의 추출물을 PRP에 혼합한 후 ADP에 의해서 혈소판의 응고를 유도 시켰다.
- 혈소판과 혈장인자들 그리고 혈관과 연관된 hemostatic plug가 형성되는 능력을 측정하기 위하여 tail bleeding time을 측정하였다.17-19) 오매(Mume Fructus) 추출물을 3일간 경구 투여 후, mouse tail bleeding time system을 이용하여 혈행개선 효과를 시험하였다.
대상 데이터
- 본 연구의 재료는 경동시장에서 구입하여 사용하였으며, 오매 100 g을 잘게 썰어서 Methanol 1,000 ml에 넣고 100oC에서 4시간 환류 냉각 추출하였다. 이 추출액을 여과한 후, 여액을 회전 감압농축기에서 감압으로 농축하고 이 오매(Mume Fructus) 농축액을 동결 건조하여 사용하였다.
- 응고된 plate 위에 시료 10 µl가 처리된 paper disk를 조심스럽게 점적하였다. 양성 대조구로는 시료 대신 대두발효추출물(13,000 FU/g; 납두균배양추출물 CK114; Greenfarmer Co. Korea)을 사용하였다. 이들 plate를 37oC에서 1시간 동안 배양한 후 fibrin이 가수분해됨에 따라서 생기는 투명환의 크기를 측정하였다.
데이터처리
- 통계처리는 Student t-test로 검정하였고 대조군과 비교하여 p<0.05 이하의 경우 유의적인 차이가 있다고 판정하였다.
이론/모형
- 섬유소 용해 활성은 Astrup14)에 의한 섬유소 평판법에 의해서 측정하였다. 섬유소원 용액은 다음과 같이 조제하였다.
- 윤 등12,13)의 Modified smear method을 이용하여 생약추출물의 혈소판응집 억제작용을 측정하였다. 즉 오매(Mume Fructus)추출물(ME)을 DMSO에 필요 농도로 녹여 사용하였으며 이때 DMSO의 최종 농도는 1%가 되도록 하였다.
성능/효과
- 일반적으로 항혈전 활성이 매우 우수한 것으로 알려진 단삼 추출물의 경우 혈액응고 저해와 혈전용해 두 가지 효능이 있다고 하였다.23) 본 연구에 사용한 오매의 경우에도 단삼과 같이 혈액응고 저해 및 혈전용해 모두에서 효능이 있었다. 이는 오매 추출물이 혈전 예방과 치료에 유용할 것으로 판단된다.
- 본 연구에 사용한 오매 추출물은 다양한 물질이 혼재된 상태임을 고려할 때 활성물질을 정제하면 높은 혈전용해 효과가 나타날 수 있을 것으로 추측된다. In vitro에서 혈소판 응집 억제와 혈전용해능은 농도의존적인 결과로 나타났으며, 이는 in vivo에서도 혈소판과 혈액 응고계의 항혈전작용 효과를 나타낼 것으로 기대된다.
- )의 덜 익은 열매를 매연으로 훈증시킨 오매(Mume Fructus) 추출물을 이용하여 혈소판의 응고, 항산화능, 혈전용해, mice tail bleeding time, aPTT, 그리고 PT에 미치는 효과를 알아보았다. 그 결과, 혈소판 응고 억제, 혈액응고시간 연장 및 혈전용해 활성 모두에 효과가 좋은 것으로 나타났다. 따라서 오매(Mume Fructus) 추출물은 혈액 응고 억제와 혈전용해 작용을 동시에 가진 소재로 혈관계에서 발생되는 혈전을 조절하여 혈전 예방과 치료에 유용할 것으로 판단된다.
- 그러나 1 mg/disk에서는 반응이 없었다(Table II). 오매 추출물은 대두발효추출물에 비해 2 mg/disk 그리고 4 mg/disk에서 각각 100%, 130% 정도의 활성을 보였다. 본 연구에 사용한 오매 추출물은 다양한 물질이 혼재된 상태임을 고려할 때 활성물질을 정제하면 높은 혈전용해 효과가 나타날 수 있을 것으로 추측된다.
- 1B에서, 최종농도가 1% DMSO가 되도록 처리 후 ADP를 처리하였을 때 혈소판 응집이 유도 되었다. 오매(Mume Fructus) 추출물에서는 응고 유도물질에 의한 혈소판 응집이 1 mg/ml에서 약하게 일어났다 그러나 2 mg/ml, 4 mg/ml의 농도에서는 혈소판 응집 반응이 일어나지 않는 것이 확인 되었다. 또한 양성대조군으로 사용한 4 mg/ml clopidogrel에서도 혈소판 응집이 일어나지 않았다(Fig.
- 오매(Mume Fructus) 추출물은 사용된 범위 내에서 농도 의존적으로 radical-scavenging 효과가 나타났으나, IC50값이 185.1 µg/ml로 항산화 효과는 거의 없는 것으로 판단되었다(Table I).
- 용해된 투명환의 크기를 측정한 결과 양성대조군인 대두발효추출물에서는 1.0±0.0 cm의 투명환이 측정되었고, 오매(Mume Fructus) 추출물 투여군은 2 mg/disk 그리고 4 mg/disk에서 각각 1.1±0.2 cm, 1.3±0.1 cm의 투명환이 측정되었다.
- 1초 그리고 4 mg/ml 에서는 각각 120초 이상, 60초 이상으로 나왔다(Table IV). 이 결과, 오매 추출물은 사람의 혈액에서도 혈액 응고 저해 효과가 나타났다. 일반적으로 항혈전 활성이 매우 우수한 것으로 알려진 단삼 추출물의 경우 혈액응고 저해와 혈전용해 두 가지 효능이 있다고 하였다.
후속연구
- 이는 오매 추출물이 혈전 예방과 치료에 유용할 것으로 판단된다. 따라서 혈전용해 및 혈소판의 응집억제작용을 모두 가지고 있는 오매의 혈행개선 성분 및 기전에 대한 연구가 이루어져야 할 것으로 사료된다.
- 오매 추출물은 대두발효추출물에 비해 2 mg/disk 그리고 4 mg/disk에서 각각 100%, 130% 정도의 활성을 보였다. 본 연구에 사용한 오매 추출물은 다양한 물질이 혼재된 상태임을 고려할 때 활성물질을 정제하면 높은 혈전용해 효과가 나타날 수 있을 것으로 추측된다. In vitro에서 혈소판 응집 억제와 혈전용해능은 농도의존적인 결과로 나타났으며, 이는 in vivo에서도 혈소판과 혈액 응고계의 항혈전작용 효과를 나타낼 것으로 기대된다.
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