선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 또한 2차원 형광센서를 사용하여 글루타치온의 생산에 영향을 줄 수 있는 각종 공정변수를 온라인 모니터링하여 공정개발에 이용하고자 한다.
- 본 연구에서는 글루타치온의 생산 공정을 개발하기 위해효모의 성장특성, 글루타치온의 생산성 및 공정 모니터링에관하여 조사하였다. 초기 pH가 4인 경우 40 mg/L 정도의 높은 글루타치온이 생산되었으며 배양온도에 따른 글루타치온의 생산은 30℃ 에서 가장 높게 나타났다.
- 본 연구에서는 효모의 일종인 Saccharomyces cerevisiae 가글루타치온을 생산하는 최적 조건을 연구하고 생물 반응기를 이용하여 글루타치온의 대량생산 기술을 개발하고자 한다. 또한 2차원 형광센서를 사용하여 글루타치온의 생산에 영향을 줄 수 있는 각종 공정변수를 온라인 모니터링하여 공정개발에 이용하고자 한다.
-
유가배양에 의한 글루타치온 생산
생물반응기를 이용한 회분식 발효 실험의 결과를 이용하여유가식 발효 공정에 의해 고농도의 균체와 글루타치온의 생상량을 증대시키고자 하였다. 배양 배지로는 최소 배지를 사용하였으며 시스테인과 글라이신 및 글루탐산의 첨가 농도는회분식 배양결과를 사용하여 각각 0.
제안 방법
- 2차원 형광 센서를 이용하여 생물반응기 내의 글루타치온생산 공정에서 미생물 및 배양액의 형광특성 변화를 모니터링 하였다. 특히, 배양 조건에 따른 형광 특성 변화를 알아보았으며 각종 공정 변수와 형광 스펙트럼과의 상관관계를 조사하였다.
- 5)를 1 tnL씩 첨가한 후 초음파 분쇄기 (30 W)를 이용하여 파쇄한 후 원심분리 (13000 rpm, 3 min) 하여 상등액을 취하였다. 96-well plate의한 well에 얻어진 시료 50 와 반응 혼합물 (1 mM 5, 5-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid) 5 mL, 1 mM NADPH; 5 mL, glutathione buffer 5.75 mL, 20 unit glutathione reductase) 150 를 반응시 킨 후, microplate reader (Victor 1420, Perkin Elmer Co, Finland)를이용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하여 글루타치온의 농도를 분석하였다. 단백질의 정량은 균체를 파쇄한 후 얻은 상등액을 5~50배 정도로 적절히 희석한 후 Bradford 법(15) 에 의해 595 nm에서 홉광도를 측정하였으며, 배양액 중의 시스테인 농도는 구리(U) 촉매반응(16)에 의해 510 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 기질 농도에 따른 5. 旋佗讶成ze의 성장 특성 및 글루타치온의 생산량을 알아보기 위해 글루코스 농도를 5 g/L, 10 g/L, 20 g/L로 다르게 하여 실험을 수행하였다(Fig. 2). 배양액으로 최소 배양액을 사용하였으며 배양 초기에 글라이신과 글루탐산을 각각 0.
- 글루타치온 생합성 전구체인 글라이신, 시스테인, 글루탐산을 배양액에 첨가하는 방법에 따른 글루타치온의 생산특성을연구하였다. 최소배양액에 배양 초기에 글라이신과 글루탐산을 각각 0.
- 또한, 글라이신, 시스테인 및 글루탐산의 첨가 농도에 따른글루타치온의 생산량 및 생산 수율을 조사하였다(Fig. 3b). 전구체의 첨가농도는 최소 배지에 세 종류의 아미노산 농도를 0.
- 5 , 통기량 1 vvm (aeration volume/medium volum히minute) 으로 하였으며, 배양액의 pH 조절에는 1 N HC1 과 14% NHQH를 사용하였다. 발효실험에서 글루코스 농도 및 전구체의 첨가농도에 따른 글루타치온의 생산정도를 알아보았으며 전구체 첨가 방법에 따른 글루타치온 생산량을 조사하였다.
- 증대시키고자 하였다. 배양 배지로는 최소 배지를 사용하였으며 시스테인과 글라이신 및 글루탐산의 첨가 농도는회분식 배양결과를 사용하여 각각 0.5% (v/v)를 배지에 첨가하였으며 시스테인은 배양 11시간에 첨가하였다.
- 배양배지로는 최소배지를 사용하였으며 글라이신 및 글루탐산의 첨가 농도는 각각 0.5% (v/v)를 발효 초기에 배지에 첨가하였으며 시스테인은 배양 11시간에 첨가하였다. 회분식 배양을 하는 도중 글루코스 농도가 거의 고갈되었을 때, 농축된 글루코스를 계단식과 지수적으로 증가하는 형태로 공급하였으며 비성장 속도는 각각 0.
- 2). 배양액으로 최소 배양액을 사용하였으며 배양 초기에 글라이신과 글루탐산을 각각 0.3% (v/v) 첨가하였고 시스테인은 배양 11시간에 0.3% (v/v) 첨가하였다. 기질로써 글루코스를 사용하였을 때 진탕 배양실험에서는 5 g/L일 때 글루타치온 생산성이 최대값을 보였다.
- 배양액의 pH 값에 따른 글루타치온의 생산량을 조사하기위하여 복합배지를 본배양 배지로 사용하고 배양액의 초기 pH 값를 4.0, 5.0, 6.0, 7.0으로 조절한 경우와 pH를 조절하지않은 경우의 S. cerevisiae 성장 특성, pH 변화 및 글루타치온생산량을 조사하였다(Fig. la). 글루타치온의 생산량은 15시간에서 18시간 경과 후 가장 높게 나타났으며, 특히 초기 pH가 4.
- 본배양 배지로 복합배양액을 이용하여 배양액의 온도 변화에 따른 S. cerevisiae의 성장 및 글루타치온의 생산량을 조사하였다(Fig. lc). 실험에서 배양 온도를 28℃, 30℃, 35℃로다르게 하여 발효 특성을 비교하였다.
- 생물공정 내 미생물의 성장 및 글루타치온 생산 특성을 생물 반응기에 직접 연결한 2차원 형광센서를 이용하여 비 침투 방식으로 온라인 모니터링 하였다. 형광 데이터의 모니터링은 매 5.
- 생물반응기 내의 각종 공정변수들 즉, pH, 용존산소 농도, 배가스 등을 모니터링하기 위해 pH 전극 (pH electrode, METTLER Co., Germany), 용존산소센서 (O2 sensor, METTLER Co., Germany), O2/CO2 가스 분석기 (LOKAS Co., Korea) 등을 사용하였다. 실시간 측정된 자료를 수집하기 위해 데이터 수집보드 (PCI 6024E DAQ board, National instrument Co.
- 1, National instrument Co, USA)를 이용하여 프로그래밍하였다. 생물반응기 내의 미생물 및 배양액의 형광특성 변화를 모니터링하기 위해 2차원 형광 광도계 (Model F-4500, Hitachi Co., Japan) 를 사용하였다. 스테인리스로 제작한 생물 반응기 (KoBiotech Co.
- lb). 시스테인첨가 시간은 배양초기, 배양시작 후 12시간, 24시간, 36시간으로 다르게 하였으며 본배양 배지로는 최소 배지를 사용하였다. 배양초기에 시스테인을 첨가한 경우 균체 성장이 원활하게 이루어지지 않아 24시간까지 글루코스가 완전히 소모되지 않았으며 글루타치온 생산성도 가장 낮게 나타났다.
- lc). 실험에서 배양 온도를 28℃, 30℃, 35℃로다르게 하여 발효 특성을 비교하였다. 28℃에서 배양한 경우에는 균체 성장이 느리고 글루타치온의 생산량도 적음을 알수 있었고 35℃의 경우 균체 성장은 활발히 이루어진 반면, 글루타치온의 생산량은 30℃ 에서 배양한 경우보다 적음을 알수 있었다.
- 우선, 회분식 배양을 하는 도중 글루코스 농도가 거의 고갈되었을 때, 농축된 글루코스를 계단식으로 공급하여 글루타치온의 생산 특성을 알아보았다(Fig. 4a). 즉, 비성장 속도 (specific cell growth rate)는 0.
- 3b). 전구체의 첨가농도는 최소 배지에 세 종류의 아미노산 농도를 0.3% (v/v), 0.5% (v/v), 0.7% (v/v)로 달리하여 실험하였으며, 배양 초기에 글라이신과 글루탐산을 첨가한 후 배양 11시간에 시스테인을 추가로 첨가하였다. 세 종류의 아미노산 즉 글라이신, 글루탐산 및 시스테인을 0.
- 배양초기에 시스테인을 첨가한 경우 균체 성장이 원활하게 이루어지지 않아 24시간까지 글루코스가 완전히 소모되지 않았으며 글루타치온 생산성도 가장 낮게 나타났다. 지수 성장기가 끝날 무렵인 12시간에 시스테인을 첨가했을 때 글루타치온의 생산성이 가장 높았으므로 이후의 실험에서 시스테인 첨가시간은 12시간으로 하였다.
- 최소배양액에 배양 초기에 글라이신과 글루탐산을 각각 0.3% (v/v) 첨가한 후 배양 11시간에 시스테인을 0.3% (v/v) 추가로 첨가한 경우와 초기에는 아미노산을 첨가하지 않고 11시간에 세 종류의 아미노산을 각각 0.3% (v/v) 첨가하였을 경우의 글루타치온의 생산량 및 생산 수율을 조사하였다(Fig. 3a). 시스테인만을 배양 11시간 즉, 미생물의지수 성장기에 투입한 경우 높은 농도의 글루타치온이 생성되었지만 균체 당 글루타치온의 생산량은 11시간에 세 종류의 아미노산을 첨가한 경우가 높았다.
- 12 g/L CaCk, 3 ml/L Vitamin solution )를 실험 조건에 따라 적절히 수정하여 사용하였다. 특히 최소 배지에는 글루타치온의 전구체로사용되는 시스테인, 글라이신, 글루탐산을 첨가하여 사용하였다. 배양액 및 반응기는 121 ℃, 14 psi에서 최소 20분 멸균하였으며, 최소 배지의 탄소원과 가용성 염은 분리하여 멸균한후 혼합하였다.
- 하였다. 특히, 배양 조건에 따른 형광 특성 변화를 알아보았으며 각종 공정 변수와 형광 스펙트럼과의 상관관계를 조사하였다.
- 합성에 중요한 역할을 한다. 특히, 배양액에 시스테인을 첨가하는 시간이 글루타치온 합성에 결정적인 요소이므로 시스테인의 첨가 시간을 변화시켜 글루코스 농도 변화 및 글루타치온의 생산성을 조사하였다(Fig. lb). 시스테인첨가 시간은 배양초기, 배양시작 후 12시간, 24시간, 36시간으로 다르게 하였으며 본배양 배지로는 최소 배지를 사용하였다.
- 한편, 반응기내 글루코스 농도가 거의 고갈 된 시점에서글루코스를 지수적으로 증가하는 형태로 공급하였을 때 균체의 성장 및 글루타치온 생산에 관하여 연구하였다(Fig. 5a). 주입유량은 비성장 속도는 0.
- 방식으로 온라인 모니터링 하였다. 형광 데이터의 모니터링은 매 5.6분마다 이루어졌으며 (측정시간 L6분 포함) 각파장별 형광 세기의 변화는 생물 반응기내의 각종 공정 변수와 상관지었다. 초기 글루코스의 농도가 5 g/L, 10 g/L, 20 g/L인 최소 배지를 이용한 배양 실험에서는 280 nm(ex)/340 nm(em)에서 형광세기의 변화가 글루타치온의 생산성과 좋은상관성을 보였다(Fig.
- 회분식 발효 실험의 결과를 이용하여 유가식 발효 공정에 의한 고농도의 균체 생산 및 글루타치온의 생산성을 조사하였다. 배양배지로는 최소배지를 사용하였으며 글라이신 및 글루탐산의 첨가 농도는 각각 0.
- 5% (v/v)를 발효 초기에 배지에 첨가하였으며 시스테인은 배양 11시간에 첨가하였다. 회분식 배양을 하는 도중 글루코스 농도가 거의 고갈되었을 때, 농축된 글루코스를 계단식과 지수적으로 증가하는 형태로 공급하였으며 비성장 속도는 각각 0.1 1/h과 0.15 1/h로 하고 반응기내 글루코스 농도가 0.5 g/L로 유지되도록 글루코스를 공급하여 글루타치온의 생산을 조사하였다.
대상 데이터
- 006 g/L CuSO4 . 5H2O, 0.12 g/L CaCk, 3 ml/L Vitamin solution )를 실험 조건에 따라 적절히 수정하여 사용하였다. 특히 최소 배지에는 글루타치온의 전구체로사용되는 시스테인, 글라이신, 글루탐산을 첨가하여 사용하였다.
- 25% (w/v) glycerol stock으로 보관하였다. 균주의 활성화를 위해 YM (3 g/L yeast extract, 3 g/L malt extract, 5 g/L tryptone, 10 g/L glucose, pH 7) agar 배지 (1.5% agar)를 사용하였으며 종균배양과 전배양 에는 YM 배지 (pH 7)를 사용하였다. 본 배양 (main culture)에는 복합 배지인 YM 배지와 최소 배지(9), 10 g/L Glucose, 6 g/L (NH4)2SO4, 5.
- 5% agar)를 사용하였으며 종균배양과 전배양 에는 YM 배지 (pH 7)를 사용하였다. 본 배양 (main culture)에는 복합 배지인 YM 배지와 최소 배지(9), 10 g/L Glucose, 6 g/L (NH4)2SO4, 5.33 g/L K2HPO4, 2.4 g/L KC1, 0.12 g/L NaCl, 2 g/L MgSO4 . 7H2O, 0.
- 본 연구는 2001년도 (재)광주.전남테크노파크 신기술연구개발 사업 (과제번호 O1-B-3-OO3)에 의해 수행되었으며 이에 감사드립니다.
- 본 연구에서 사용한 효모 균주인 Saccharomyces cerevisiae (ATCC 7754)는 미국 ATCC (American Type Cell Collections, USA)에서 구입하였으며, 보관용 균주는 -80℃에서 25% (w/v) glycerol stock으로 보관하였다. 균주의 활성화를 위해 YM (3 g/L yeast extract, 3 g/L malt extract, 5 g/L tryptone, 10 g/L glucose, pH 7) agar 배지 (1.
- 생물반응기에 의한 회분식 배양에는 KoBiotech 사 (Korea) 에서 제조한 2.5 L 크기의 반응기를 사용하였으며 반응기내의 본배양 배지 (배양부피: L5 L)에 전배양액의 1%를 접종하여 배양하였다. 반응기의 운전조건은 30℃, 400 rpm, pH 5.
데이터처리
- , Korea) 등을 사용하였다. 실시간 측정된 자료를 수집하기 위해 데이터 수집보드 (PCI 6024E DAQ board, National instrument Co., USA)를 사용하였으며 LabVIEW (ver. 6.1, National instrument Co, USA)를 이용하여 프로그래밍하였다. 생물반응기 내의 미생물 및 배양액의 형광특성 변화를 모니터링하기 위해 2차원 형광 광도계 (Model F-4500, Hitachi Co.
이론/모형
- 사용된 2 m-bifurcated 액체 광학 전도관은 250-650 nm 범위에서 50% 이상의 투과도를 가지고 있었다(6). 2차원 형광센서의 조작 매개변수 값과 발효기와 함께 사용한 형광센서 등의 온라인 모니터링 장치는 Rhee 등(12)의 논문을 참고하였다.
- 75 mL, 20 unit glutathione reductase) 150 를 반응시 킨 후, microplate reader (Victor 1420, Perkin Elmer Co, Finland)를이용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하여 글루타치온의 농도를 분석하였다. 단백질의 정량은 균체를 파쇄한 후 얻은 상등액을 5~50배 정도로 적절히 희석한 후 Bradford 법(15) 에 의해 595 nm에서 홉광도를 측정하였으며, 배양액 중의 시스테인 농도는 구리(U) 촉매반응(16)에 의해 510 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 발효액의 상등액에 남아있는 환원당 농도는 p-hydro- xybenzoic acid hydrazide를 이용한 비색법으로 측정하였다. 세포내 글루타치온의 농도를 측정하기 위해 얻어진 균체에 glutathione buffer (125 mM sodiumphosphate, 6.
성능/효과
- 실험에서 배양 온도를 28℃, 30℃, 35℃로다르게 하여 발효 특성을 비교하였다. 28℃에서 배양한 경우에는 균체 성장이 느리고 글루타치온의 생산량도 적음을 알수 있었고 35℃의 경우 균체 성장은 활발히 이루어진 반면, 글루타치온의 생산량은 30℃ 에서 배양한 경우보다 적음을 알수 있었다.
- 2차원 형광 센서를 이용하여 글루타치온 생산 공정의 온라인 모니터링은 배양액의 배지 조성이나 성장 특성 등 배양기 내의 환경 변화에 따라 형광 영역 및 세기가 다르게 나타났으며 실시간 모니터링 된 형광 데이터는 기질 및 생산물 그리고 균체 성장 등의 각종 공정 변수와 좋은 상관성을 보였다. 따라서 2차원 형광 센서에 의한 모니터링은 글루타치온대량 생산을 위한 실시간 모니터링에 매우 효과적이라 할 수 있다.
- 8에는 기질을 지수적으로 공급하는 유가 배양 실험에서 450 nm(ex)/530 nm(em)에서 형광세기의 변화가 균체 농도와 좋은 상관성을 보임을 나타내었으며 배가스 중의 이산화탄소 발생량이 470 nm(ex)/590 nm(em) 형광 영역에서 형광 세기의 변화와 잘 일치함을 볼수 있었다. 그리고, 트립토판, 페닐알라닌 등 아미노산 형광영역인 300 nm(ex)/33O nm(em)에서 형광 세기의 변화는 시스테인 농도변화와 잘 일치하였으며, 320 nm(ex)/390 nm(em) 에서 형광 세기의 변화는 인산 농도와 좋은 상관성을 보였다 (Fig. 9). 이와 같이 발효공정에 각종 화합물의 첨가로 인해발생하는 각 형광 파장 영역에서 형광 세기의 변화는 균체성장 및 세포 대사 과정 등을 추정할 수 있는 지표가 될 수있다 .
- 3% (v/v) 첨가하였다. 기질로써 글루코스를 사용하였을 때 진탕 배양실험에서는 5 g/L일 때 글루타치온 생산성이 최대값을 보였다. 그러나 배양액의 pH 조절이 용이하고 공기 주입 하에서 가동되는 생물 반응기에서는 글루코스의 농도가 높을 때 즉, 20 g/L에서 글루타치온의 농도가 가장 높고 균체 (cell mass) 당 글루타치온의 생산성은 글루코스 10 g/L일 때 최대값을 나타내었다.
- 모니터링 결과를 나타내었다. 배양 6시간부터 산소소모량 및 이산화탄소 생성량이 급격히 증가하다가 10시간을 전후하여 감소하였다. 기질이 첨가되는 11시간 이후부터는 산소 소모량 및 이산화탄소 생성량이 글루코스 공급 형 태와 유사한 계단식 형태로 변화하였다.
- 그리고 최소 배지에 첨가한 시스테인은 배양 12시간에 넣었을 때 글루타치온의 생산성이 높게 나타났다. 생물 반응기를 이용한 회분식배양에서 기질 농도에 따른 S. cerevisiae 성장 특성 및 글루타치온 생산은 글루코스 농도 20 g/L에서 글루타치온 생산량이 55 mg/L로 가장 높았다. 최소 배양액에 배양 초기에 0.
- 7% (v/v)로 달리하여 실험하였으며, 배양 초기에 글라이신과 글루탐산을 첨가한 후 배양 11시간에 시스테인을 추가로 첨가하였다. 세 종류의 아미노산 즉 글라이신, 글루탐산 및 시스테인을 0.3% 및 0.5%로 증가하였을 때 글루타치온의 생산량은 아미노산의 증가에 따라 증가됨을 볼 수 있었다. 그러나 0.
- 4a). 즉, 비성장 속도 (specific cell growth rate)는 0.1 (1/hr)로 하였으며 반응기내글루코스 농도가 0.5 g/L로 유지되도록 글루코스를 공급하였는데 글루타치온의 생산량은 24시간을 전후하여 약 102 mg/L 정도로 최대 값을 보였으며, 균체 당 글루타치온 양은약 18 mg/g cell이였다(Fig. 4b).
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.