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문제 정의
- 규명하고자 Oj 이온의 정량 및。项 소거효소인 superoxide dismutase(SOD), glutathione peroxidase(GPx) 및 catalase 효소 활성을 측정하여 유의성 있는 결과를 얻어 제시하는 바이다.
- 어성초 추출물이 암유발 동물에서 상당한 생명연장효과를 나타내었으므로 세포주 준위에서의 암세포수에 대한 영향을 검색해 보았다. 백혈병계 암세포주인 L1210 세포에 어성초 추출물을 10 μ以血에서 200)回m2 농도까지 투여한 다梧 1~4일간 배양하여 control군에 비하여 감소한 세포수를 세포독성으로 간주하여 검색한 결과가 Table Ⅱ에 제시되어 있는데 배양 1일째에는 농도에 관계없이 세포독성이 거의 나타나지 않았으나 그 이후부터는 특히 고농도에서 현저한 세포독성을 나타내었다.
- 기존의 항암제에 대한 연구에 의하면 항암제에 의한 암세포 사멸은 necrosis 보다는 apoptosis에 의한다는 결과23-25)가 디수보고 되고 있으며, apoptosis 촉발 인자로서의 활성산소의 영향은 매우 크므로 어성초 추출물에 의한 암세포 사멸에도 활성산소 관계물질이 연관되는지 검색하고자 하였다. 우선 어성초 메탄올 추출물에 의해 세포독성이 현저하게 유발될 수 있는 조건을 설정하여 이에 따른 02 이온의 생성량의 변화를 측정하고 이값을 세포독성이 유발되지 않은 조건에서의 02 이온의 생성량과 비교하여 보았다.
- 2628)따라서 어성초 추출물에 의해 L1210 세포내에 생긴도 H2O2 또는 . OH로 전환될 가능성이 있으며 이들 활성산소는 암세포에게도 해로운 물질일 수 있으므로 암세포가 자신을 보호하기 위한 대응 반응을 할 가능성이 있어 검색해보기로 하였다.
제안 방법
- ICR 생쥐의 복강에서 계대배양 되어 온 Sarcoma 180 cells을실험용 ICR 생쥐 복강에 lx 105 cells/10 p//20 g body weight로 접종한 다음 24시간 후부터, DMSO의 농도가 0.5%를 넘지 않은 범위로 용해시킨 어성초 추출물을 10-200 ng/10|J/20g body weight의 농도로 매일 일정 시간에 경구투여 한 다음 상태를 관찰하면서 생존율을 계산하였다. Control의 경우는 시료와 동일 한양의 DMSO를 증류수에 용해하여 동일한 방법으로 경구투여 하였다.
- 5%를 넘지 않은 범위로 용해시킨 어성초 추출물을 10-200 ng/10|J/20g body weight의 농도로 매일 일정 시간에 경구투여 한 다음 상태를 관찰하면서 생존율을 계산하였다. Control의 경우는 시료와 동일 한양의 DMSO를 증류수에 용해하여 동일한 방법으로 경구투여 하였다.
- 정상세포에 대한 무독성의 정도를 검색하기 위해 ICR 생쥐로부터 normal lymphocytes를 분리하여 이 정상세포에 미치는 어성초 추출물의 독성을 검색하였다. Normal lymphocytes의 분리 방법은 Boyume)의 방법을 적용하였는데 간단한 방법은 다음과 같다.
- 다음과 같이 시행하였다. 24 well plate에 1X106 cells/m/의 농도로 L1210 세포 또는 normal lymphocytes를 가하고 여기에 어성초 추출물을 첨가한 다음 배양 후 NCI19) 방법에 준하여 hemocytometer를 사용하여 trypan blue exclusion을 시행함으로써 살아있는 비착색 세포수(생존세포)를 모두 세어 control 그룹의 비착색 세포수와 비교하여 백분율(%)로 세포독성을 계산하였다.
- 본 실험에서는 L1210 세포에 어성초 추출물을 첨가하여 배양한 다음 250Xg에서 원심분리 후 상등액은 버리고 수집하여 24 well plate에 1X108 celWwell, 700 p/ PBS, 50 p/ cytochrome c, 5mM의 phorbol myristate acetate(PMA) 50("와 배지를 첨가하여 60분간 배양 후 원심분리 하였다. 상등액에 200 W PBS 롤 가하여 가 되도록 희석하고 550nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 본 실험에서는 L1210 세포에 어성초 추출물을 첨가하여 배양한 다음 250Xg에서 원심분리 후 상등액은 버리고 수집하여 24 well plate에 1X108 celWwell, 700 p/ PBS, 50 p/ cytochrome c, 5mM의 phorbol myristate acetate(PMA) 50("와 배지를 첨가하여 60분간 배양 후 원심분리 하였다. 상등액에 200 W PBS 롤 가하여 가 되도록 희석하고 550nm에서 흡광도를 측정하였다. Ferricytochrome c의 환원반응은 21.
- 상등액에 200 W PBS 롤 가하여 가 되도록 희석하고 550nm에서 흡광도를 측정하였다. Ferricytochrome c의 환원반응은 21.1/mM/cmS] 몰흡광계수를 적용하여 계산하였다.
- GPx의 활성은 Maral 등22)에 의하여 측정하였다. 50 mM potassium phosphate buffer(5 mM EDTA, pH 7.0), 8.4 mM NADPH, 1 unit glutathione reductase(GSSGR), 150 mM의 glutathion(GSH), 효소액을 첨가하여 반응액이 2mZ가' 되도록 한 다음 37℃서 5분간 방치시킨 후 0.16 mM 左butyl hydroperoxide 를 가하여 340nm에서 3분 동안 NADPH의 산화에 의해 감소되는 흡광도의 변화를 측정하였으며 NADPH의 흡광계수는 6.22 을 적용하여 사용하여 효소활성을 계산하였다.
- 하는 Maral 등22)의 방법을 적용하였다. 50 mM Potassium phosphate buffer(pH 7.4), 12.5 mM H2O2 및 효소액을 가하여 전체 반응액이 2mZ가 되도록 한 후 250nm에서 1Q초 단위로 5 분간 흡광도 변화를 측정하였다. Catalase의 활성도는 1분 동안 1 呻이의 也。2를 분해시키는 효소의 양을 1 unk로 정의하였다.
- 어성초 추출물이 항암제로서의 가치가 있으려면 암세포수 감소와 같은 항암효과 못지않게 정상세포에 대한 무독성이 확보되어야 하므로 L1210 세포가 유래한 ICR 생쥐로부터 분리한 normal lymphocytes에 대한 세포수 감소 정도를 측정하여보았다. Table Ⅲ에 제시된 결과에 따르면 normal lymphocytes에 어성초 추출물을 첨가한 후 배양 1일째에는 대부분의 농도에서 세포사멸보다는 10% 내외의 세포증식효과가 나타났으며, 배양 2 일째에도 저 농도의 경우에는 세포증식 효과 그리고 100~200 |ig/ m/의 고농도에서 5% 남짓의 세포독성효과가 나타났다.
- Table Ⅲ까지의 결과로부터 어성초 추출물은 암유발 동물실험에서 생명연장 효과가 뚜렷하였고, 암세포주 실험에서도 농도와 배양 기간에 의존적으로 L1210 세포수를 감소시키는 것을 알게 되었으므로, 다음실험으로 이 암세포수 감소 현상의 기작을 파악하고자 활성산소와 어성초 추출물과의 관계를 규명히는 실험 -을 시행하였다.
- 관계물질이 연관되는지 검색하고자 하였다. 우선 어성초 메탄올 추출물에 의해 세포독성이 현저하게 유발될 수 있는 조건을 설정하여 이에 따른 02 이온의 생성량의 변화를 측정하고 이값을 세포독성이 유발되지 않은 조건에서의 02 이온의 생성량과 비교하여 보았다. 02 이온은 활성산소의 대표적인 화합둘로서 02 로부터 생성되는 활성산소군의 첫 번째 물질로 그 생성량은 의미가 크다고 할 수 있겠다.
- 즉 어성초 추출물을 L1210 세포에 가하여 생긴。2이 무독한 HR로 전환시키기 위한 일련의 반응이 일어날 것으로 유추되는데, 그 지표물질로 첫 번째 반응인 0犹로부터의 H2O2 생성반응의 효소인 superoxide dismutase(SOD), 두 번째 반응인 玮02로부터의 H2O 생성반응의 효소인 glutathione peroxidase(GPx)와 catalase 활성을 측정하여 어성초 추출물의 세포독성 현상과 연계하여 보았다.
- . OH로 전환되는 것으로 알려져 있는데 어성초 추출물로 야기되는 세포독성 과정에 실제 SOD 활성변화가 수반되는지 파악하기 위하여 세포독성의 조건에 따라 SOD 활성을 각각 측정 비교하였다. Fig.
- 어성초 추출물에 의한 암세포증식 억제 작용에 SOD 효소 활성이 증가함을 알게 되었으므로 다음 반응을 맡고있는 GPx와 catalase 효소활성을 측정하였다. SOD의 경우와 마찬가지로 세포독성이 유발되는 조건에서 실험하여 측정한 GPx 효소활성을 Fig.
대상 데이터
- Ferricytochrome c, xanthine, xanthine oxidase, superoxide dismutase, glutathione, glutahione reductase, phorbol 12-myristate 13-acetate, i-butyl hydroperoxide, nicotinamide adenine dinucleotide reduced, trypan blue, dimethylsulfoxide, ethylenetetraacetate는 Sigma(St Louis, MO, U.S.A.)의 제품을구입하였으며, RPMI 1640, fetal bovine serum(FBS), penicillin /streptomycin mixture는 GIBCO BRL(Grand Island, New York, USA)에서 구입하였으며 dimethylsulfoxide, methanol 등 무기화합물, 유기용매는 특급수준의 제품을 사용하였다.
- 어성초는 한국토종 약초연구소(부암동, 서울)에서 일괄 구입하여 냉동실에 밀봉 보관하면서 필요에 따라 메탄올 추출물을 조제하였다. 잘 씻어 물기를 닦아낸 다음 잘게 썬 어성초 시료에 대해 다음과 같이 추출물을 조제하였다.
- L1210 cells(murine lymphocytic leukemia; ATCC CCL 219)은 한국세포주 은행(서울대 암연구센터)에서 분양 빋아■ 사용하였다. L1210 세포의 배양은 10% FBS를 함유한 RPMI 1640 배양액 중에서 37℃, 5% CO2, humidified conditione토 이루어졌으며 항생제로는 penicillin/streptomyciirg: 사용흐!■였고 계대 배양은 3~4일마다 시행하였다.
이론/모형
- 추출물의 독성을 검색하였다. Normal lymphocytes의 분리 방법은 Boyume)의 방법을 적용하였는데 간단한 방법은 다음과 같다. ICR 생쥐의 척추를 탈골시킨 다음 하대정맥을 절개흐}여 heparin 처리가 된 주사기에 채혈한 뒤 15m/ tube에 모아서 여기에 dextran 유도체인 HistopaqueR-1077 3 m/을 가한 다음 1, 000 rpm에서 30분간 실온에서 원심분리 하였다.
- 후 생성된。2 량은 Markesbery 등加)의 방법에 의하여 시행하였다. 본 실험에서는 L1210 세포에 어성초 추출물을 첨가하여 배양한 다음 250Xg에서 원심분리 후 상등액은 버리고 수집하여 24 well plate에 1X108 celWwell, 700 p/ PBS, 50 p/ cytochrome c, 5mM의 phorbol myristate acetate(PMA) 50("와 배지를 첨가하여 60분간 배양 후 원심분리 하였다.
- SOD 활성의 측정은 기본적으로 McCord 등幻)의 방법에 의해 이루어졌다. 반응액의 총량은 3m/로서 50mM potassium phosphate buffer(pH 7.
- GPx의 활성은 Maral 등22)에 의하여 측정하였다. 50 mM potassium phosphate buffer(5 mM EDTA, pH 7.
- Catalase 활성의 측정은 250 nm, 25℃에서 흡광도 감소를 근거로 하는 Maral 등22)의 방법을 적용하였다. 50 mM Potassium phosphate buffer(pH 7.
성능/효과
- Table I에 표시한 바와 같다. ICR계 mouse에 복수암을 유발하기 위하여 Sarcoma 180 cells을 접종하여 24시간이 지난 후부터 어성초 추출물을 10~200 μ©伺까지 매일 한차례씩 경구투여 하여 사망일을 계산한 결과 control 군의 평균 생존 기간은 21.3+3.7 days 이었으며 어성초 추출물 투여군의 생명 연장 효과는 50|ig/mZ의 농도부터 현저히 증가하여 70 飓同 농도에서는 control을 100%로 했을 때 143.7%로 최고조에 달하였으며 전체적으로는 Ⅲ.7%~143.7%에 이르렀다. 이로써 어성초 추출물은 복수암을 유발시킨 ICR 생쥐의 생명을 상당히 연장시키는 것으로 판단되었다.
- 7%에 이르렀다. 이로써 어성초 추출물은 복수암을 유발시킨 ICR 생쥐의 생명을 상당히 연장시키는 것으로 판단되었다.
- 백혈병계 암세포주인 L1210 세포에 어성초 추출물을 10 μ以血에서 200)回m2 농도까지 투여한 다梧 1~4일간 배양하여 control군에 비하여 감소한 세포수를 세포독성으로 간주하여 검색한 결과가 Table Ⅱ에 제시되어 있는데 배양 1일째에는 농도에 관계없이 세포독성이 거의 나타나지 않았으나 그 이후부터는 특히 고농도에서 현저한 세포독성을 나타내었다. 즉 배양 3일째와 배양 4일째에 50 ng/mZ 농도이상에서는 약 50% 이상의 세포독성 효과를 나타내었고 4일간 배양시 최고 98.6%의 세포독성이 시사하는 바와 같이 고농도에서는 살아남은 세포가 거의 없었다. 세포독성에 대한 일반적인 실험 기준인 배양 기간 3일을 선택하여 계산한 心0값은 49.
- Table Ⅲ에 제시된 결과에 따르면 normal lymphocytes에 어성초 추출물을 첨가한 후 배양 1일째에는 대부분의 농도에서 세포사멸보다는 10% 내외의 세포증식효과가 나타났으며, 배양 2 일째에도 저 농도의 경우에는 세포증식 효과 그리고 100~200 |ig/ m/의 고농도에서 5% 남짓의 세포독성효과가 나타났다. 배양 3 일째에는 세포독성 효과가 나타났지만 그 정도는 5% 정도의 미약한 것이었고 배양 4일째에 가서야 10%가 넘는 세포독성 효과가 나타났다.
- 이 결과를 L1210 세포에 대한 Table Ⅱ의 결과와 비교하면 어성초 추출물은 암세포에 대해서는 상당한 세포수 감소를 나타낸 반면, normal lymphocytes에 대해서는 세포수를 거의 감소시키지 않았고 다만 100~200(ig/m/과 같은 고농도와 4일간 배양과 같은 과격한 조건에서만 15% 정도의 세포수 감소를 나타낸 것으로 보아(L1210 세포의 경우에는 90% 내외) 어성초 주출물은암세포 증식은 강하게 억제하면서도 정상세포는 크게 손상시키지 않을 가능성이 시사되어 항암제로서의 개발 값어치가 있다고간주되었다.
- OH로 전환되는 것으로 알려져 있는데 어성초 추출물로 야기되는 세포독성 과정에 실제 SOD 활성변화가 수반되는지 파악하기 위하여 세포독성의 조건에 따라 SOD 활성을 각각 측정 비교하였다. Fig. 1에 제시된 결과를 보면 어성초 추출물을 첨가하여 야기되는 세포독성의 정도에 비례하여 SOD 활성의 변화가 큰 것을 알 수 있었다. 우선 세포독성이 거의 일어나지 않는 조건인 배양 1일째에 어성초 추출물을 첨가하여 배양시킨 후 L1210 세포의 SOD 활성은 10(ig/m/에서는 1.
- 세포독성이 약 50-90% 정도까지 높았던 배양 2일째와 3일째, 4일째의 결과를 보면 control군의 SOD 활성도 배양 기간에 비례하여 2~3배 증가하였으며, 어성초 추출물 첨가군의 SOD 활성은 각각의 control 값의 5배 정도까지의 매우 높은 증가 값을 보인 것으로 보아 어성초 추출물로 인하여 야기되는 세포독성에는 02 전환효소인 SOD 효소활성 증가가 크게 수반되는 것을 확인 할 수 있었다.
- 효소활성을 측정하였다. SOD의 경우와 마찬가지로 세포독성이 유발되는 조건에서 실험하여 측정한 GPx 효소활성을 Fig. 2에 제시하였는데 전체적으로 어성초 추출물에 의한 세포독성의 증가에 비례하여 GPx 활성이 뚜렷하게 증가하는 것을 알 수 있었다.
- 결과에 따르면 우선 세포독성이 거의 나타나지 않는 배양 1일째에 어성초 추출물을 부터 100 pig/血 농도까지 첨가하였을 경우 GPx 활성은 0.7~L2 units/108 cell료서 control의 값과 거의 유사하였으나 세포독성이 현저했던 배양 2일째, 3일째 그리고 4일째의 GPx 활성은 control 군에 있어서도 3배 이상의 증가, 그리고 어성초 추출물 첨가군에 있어서도 배양 시기와 농도에 비례하여 해당된 배양기간의 각각의 control 값의 5배 정도까지 크게 증가하였다.
- 가 증가하고 이 &。2를 소거하기 위한 GPx 효소의 활성이 연이어 크게 증가하는 것으로 판단되었다. 이 실험에 부가하여 珏。2를 분해하는 또 하나의 효소인 catalase 효소의 활성을 측정한 바 어느 조건에서도 활성이 나타나지 않았는데 이는 catalase 효소가 대부분 peroxisome에 국재되어 있어서 반응이 제한적이거나 또는 생성된 H2O2 분해에는 관여하지 않는 반면 대부분의 는 세포질에 넓게 존재하는 GPx에 의해 특정적으로 분해되는 가능성이 있는 것으로 판단되었다.
- 이상으로부터 어성초 추출물은 L1210 세포 증식을 뚜렷하게 사멸하는데 이 과정을 보면 우선 L1210 세포내에서 02 이온을 양산하고 이로부터 생성된 H2O2 또는 . 0H 등의 활성산소가 증가하여 이들이 apoptosis를 유발하거나 또는 cell cycle의 arrest를 야기하여 암세포 증식의 억제가 일어날 수 있는 가능성이 시사되었으며, 한편으로 급증된 이들 활성산소의 독성에 대하여 암세포는 활성산소 소거효소인 SOD나 GPx를 유발하여 활성산소의 독성을 막아보려 하나 결국은 역부족이었던 것으로 사료되었다.
- 의 약 4배, 100 μ以11血의 농도에서는 control 값의 약 5배 이상의 높은 중가를 보였다. 즉 L1210 세포에 어성초 주출물을 첨가할 경우 겉으로는 세포독성이 약하게 나타났던 배양 1일째 이미 L1210 세포내에서는 02 이온의 생성이 상당히 증가되는 것을 알 수 있었다. 뿐만 아니라 역시 같은 농도에서 3일간 배양시키면 02 생성량은 더욱 증가하여 약 8배 내지 15배 까지 높은 값을 나타내었다.
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