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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 건강기능식품으로서 목초액 성분의 혈행개선 효과를 연구하였다. 본 실험을 통하여 목초액은 thrombin 이나 collagen으로 유도되는 혈소판의 응집을 농도 의존적으로 저해하고 혈소판으로부터 serotonin 분비를 농도 의존적으로 저해하며, 또한 mouse tail bleeding time을 농도 의존적으로 연장시키는 혈행개선효과를 관찰하였다.
제안 방법
- 여기에 3 ml의 chloroform을 가하여 남아있는 TCA를 추출하고, 상부의 수층을 취한 후, excitation 360 nm, emission 475 nm의 파장에서 fluorescence를 측정하였다. 15% triton X-100 sdution을 WP에 가한 후(final 0.3%) 측정된 fluorescence# 100%로 하여 각각의 serotonin 분비 정도를 계산하였다.
- Saline, 목초액 10%, 20%, 30%액을 mice의 복강에 주사한 후 60분이 되었을 때 mice를 틀에 고정시키고 mice의 꼬리 끝으로부터 2 mm 되는 부분을 surgical blade로 자르고 꼬리의 나머지 부분을 37℃의 saline에 직각으로 담갔다. Bleeding time은 꼬리를 자른 시간부터 측정하여 bleeding이 완전히 멈춘 시간 까지를 (30초 이내에 다시 bleeding이 생기지 않았을 때까지) 기준으로 하여 측정하였다. 또한 200초 이상 bleeding이 된 경우 200초로 기록하였다.
- Bleeding time의 측정은 혈소판과 혈장인자들 그리고 혈관벽과 연관된 hemostatic plug를 형성하는 능력을 측정하기 위해 고안된 실험으로써 혈소판 응집은 hemostatic plug 형성에 중요한 요인이므로 mouse tail bleedingsystem을 이용하여 목초액의 혈행개선 효과를 시험하였다. Vehicle을 투여한 군의 경우 tail bleeding time은 77.
- 그리고 WP와 목초액을 농도별로 가하고 water bath에서 1아분간 incubation 시킨 후 WP를 취하여 aggregometer cuvette에 넣고 곧바로 thrombin또는 collagen에서 최대 혈소판 응집을 일으키는 농도의 액을 가하여 light transmission을 확인하였다. IC50는 thrombin과 collagen을 가하였을 때 응집을 저해하는 농도를 잡아 그에 해당하는 inhibition%를 이용하여 농도- 억제효과에 관한 직선식을 도출한 후, 50% inhibition에 대응하는 농도를 구하였다.
- 여기에 37℃에서 미리 incubation한 14 mM pyruvate solution 100 ㎕를 가하고, 즉시 339 nm의 파장에서 1분간 흡광도 감소를 측정하였다. LDH의 총 활성도는 0.3% triton X-100으로 lysis를 유발하여 측정하였으며, 이를 100% 활성도로 하여 계산하였다.
- 정확히 10분 후, 37%;의 fibrometer 에 incubation된 sample 100 ㎕를 가하고 aPTT reagent 100 와 20 mM CaCl2 100 ㎕을 가하며 즉시 BBL fibrometer®를 작동시켜 fibrin clot이 형성될때까지의 시간을 측정하였다. PT 역시 DW나 목초액을 농도별로 가하여 10분간 incubation된 혈장 100 ㎕를 37℃의 fibrometer에 가하고, 즉시 37°C로 prewarming된 PT reagent 200 ㎕를 가한 후 BBL fibrometer®를 작동시켜 fibrinclot이 형성될때까지의 시간을 측정하였다.
- Saline, 목초액 10%, 20%, 30%액을 mice의 복강에 주사한 후 60분이 되었을 때 mice를 틀에 고정시키고 mice의 꼬리 끝으로부터 2 mm 되는 부분을 surgical blade로 자르고 꼬리의 나머지 부분을 37℃의 saline에 직각으로 담갔다. Bleeding time은 꼬리를 자른 시간부터 측정하여 bleeding이 완전히 멈춘 시간 까지를 (30초 이내에 다시 bleeding이 생기지 않았을 때까지) 기준으로 하여 측정하였다.
- , USA)를 이용하여 turbidity 변화로서 측정하였다. Washed platlets(WP)의 light transmission을 0%, suspension buffer의 light transmission을 100%로 맞춘 후, 37℃에서 혈소판의 응집정도에 따른 light transmission을 측정하였다. 측정 시 silicon으로 코팅된 aggregometer cuvette을 사용하였으며 반응이 일어나는 동안 1,000 rpm에서 지속적으로 교반시켰다.
- WP를 aggregometer cuvette에 넣고 aggregometer 안에서 1분간 안정화시켰다. 그리고 WP와 목초액을 농도별로 가하고 water bath에서 1아분간 incubation 시킨 후 WP를 취하여 aggregometer cuvette에 넣고 곧바로 thrombin또는 collagen에서 최대 혈소판 응집을 일으키는 농도의 액을 가하여 light transmission을 확인하였다. IC50는 thrombin과 collagen을 가하였을 때 응집을 저해하는 농도를 잡아 그에 해당하는 inhibition%를 이용하여 농도- 억제효과에 관한 직선식을 도출한 후, 50% inhibition에 대응하는 농도를 구하였다.
- 목초액의 혈소판에 미치는 영향을 파악하기 위하여 Washed platelets(WP)를 분리한 후 목초액을 가하여 37℃에서 10분간 반응시켰다. 대조군은 혈소판 응집 억제 효과가 없었으나 목초액 처리군에서는 농도 의존적으로 thrombin과 collagen에 의한 응집을 억제시켰다(Fig. 1). 2% 목초액은 thrombin 및 collagen에 의한 혈소판 응집을 완전히 억제하였다.
- 목초액의 혈소판에 미치는 영향을 파악하기 위하여 Washed platelets(WP)를 분리한 후 목초액을 가하여 37℃에서 10분간 반응시켰다. 대조군은 혈소판 응집 억제 효과가 없었으나 목초액 처리군에서는 농도 의존적으로 thrombin과 collagen에 의한 응집을 억제시켰다(Fig.
- 목초액이 thrombin에 의해 유도되는 혈소판 응집을 저해하였으므로 thrombin에 의해 혈소판이 활성화될 때 나타나는 여러 가지 현상 중 혈소판의 granule에 저장되어 있다가, agonist 자극에 의해 활성화되면 granule과 세포막의 융합에 의해 혈소판 밖으로 분비되어 혈소판 활성화 및 혈관 수축을 유발하는 serotonin 분비에 목초액의 효과를 실험 하였다. 목초액을 WP에 10분간 전처리 한 후,thrombin 0.
- 목초액이 혈액 coagulation에 어떠한 효과를 갖는지 알아보기 위해 rat plasma를 분리한 다음, intrinsic path way를 통해 fibrin clot이 형성될 때까지의 시간을 aPTT 를 지표로, extrinsic pathway를 통해 fibrin clot이 혈성될 때까지의 시간을 PT를 지표로 하여 혈장 응고 시간을 측정하였다. aPTT, PT는 항혈전 작용을 검색하는데 널리사용되는 지표이며 각각 intrinsic pathway와 extrinsic pathway의 활성화 정도를 반영한다(Matsuo et al.
- 혈행개선 효과를 연구하였다. 본 실험을 통하여 목초액은 thrombin 이나 collagen으로 유도되는 혈소판의 응집을 농도 의존적으로 저해하고 혈소판으로부터 serotonin 분비를 농도 의존적으로 저해하며, 또한 mouse tail bleeding time을 농도 의존적으로 연장시키는 혈행개선효과를 관찰하였다.
- 6 ml가 담긴 glass test tube에 가하고 끓는 수욕 상에서 10분간 가열한 다음, 즉시 ice bath에서 냉각시켰다. 여기에 3 ml의 chloroform을 가하여 남아있는 TCA를 추출하고, 상부의 수층을 취한 후, excitation 360 nm, emission 475 nm의 파장에서 fluorescence를 측정하였다. 15% triton X-100 sdution을 WP에 가한 후(final 0.
- 0 ml에 가한 다음, 37℃에서 10분 동안 incubation 하였다. 여기에 37℃에서 미리 incubation한 14 mM pyruvate solution 100 ㎕를 가하고, 즉시 339 nm의 파장에서 1분간 흡광도 감소를 측정하였다. LDH의 총 활성도는 0.
- aPTT를 측정하기 위해 혈장에 DW 또는 목초액을 농도별로 가하고 10분간 37℃에서 incubation시켰다. 정확히 10분 후, 37%;의 fibrometer 에 incubation된 sample 100 ㎕를 가하고 aPTT reagent 100 와 20 mM CaCl2 100 ㎕을 가하며 즉시 BBL fibrometer®를 작동시켜 fibrin clot이 형성될때까지의 시간을 측정하였다. PT 역시 DW나 목초액을 농도별로 가하여 10분간 incubation된 혈장 100 ㎕를 37℃의 fibrometer에 가하고, 즉시 37°C로 prewarming된 PT reagent 200 ㎕를 가한 후 BBL fibrometer®를 작동시켜 fibrinclot이 형성될때까지의 시간을 측정하였다.
- 공급하며 사육하였다. 체중이 300~400 g이 되는 것을 diethyl ether로 마취시킨후 복대동맥에서 18G주사기를 이용하여 혈액을 채취하였다. 이때 항응고제로는 acid-citrate-dextrose(ACD: 85 mM trisodium citrate, 71 mM citric acid, 111 mM glucose)를 사용하였다.
- 혈소판의 응집 정도를 lumi-aggregometer(Chrono- Log Co., USA)를 이용하여 turbidity 변화로서 측정하였다. Washed platlets(WP)의 light transmission을 0%, suspension buffer의 light transmission을 100%로 맞춘 후, 37℃에서 혈소판의 응집정도에 따른 light transmission을 측정하였다.
- 혈소판의 활성화를 억제하는 목초액의 효과가 세포독성과 연관성이 있는지 알아보기 위해 LDH 유출을 지표로 혈소판에 대해서 목초액의 세포독성을 실험하였다. WP에 목초액을 농도별로 가한 후 각 시간대별로 시료를 취하여 LDH의 활성을 측정한 결과 양성 대조군으로 사용한menadione 250 μM은 LDH 유출을 크게 증가시키는 반면 목초액이 처리된 WP에서는 유의적인 LDH 유출이 없었다(Fig.
대상 데이터
- Louis, USA)로부터 구입하여 사용하였다. Activated partial thipmboplastin time (aPTT) reagent와 prothrombin time(PT) reagent는 Instrumentation Laboratory(Milano, Italy)로부터, collagen은 Chronolog(Havertown, USA)로부터 구입하여 사용하였다. 그 밖의 모든 시약은 모두 특급 시약을 구입하여 사용하였다.
- Male ICR mice는 Orient사(서울, Korea)로부터 구입하였다. Saline, 목초액 10%, 20%, 30%액을 mice의 복강에 주사한 후 60분이 되었을 때 mice를 틀에 고정시키고 mice의 꼬리 끝으로부터 2 mm 되는 부분을 surgical blade로 자르고 꼬리의 나머지 부분을 37℃의 saline에 직각으로 담갔다.
- 목초액 성분은 바이오 오키(주)에서 공급받아 사용하였다. Calcium chloride, sodium chloride, trisodium citrate, citric acid, thrombin, ethylenediamine tetra acetic acid(EDTA), trichloroacetic acid(TCA), serotonin creatinine sulfate, ophthalaldehyde(OPT), anhydrous dimethyl sulfoxide (DMSO), trizma® base, pyruvic acid (sodium salt), t-octylphenoxy-polyethoxyethanol (Triton X-100), p-nicotinamide adenine dinucleotidereduced form(P-NADH) 둥 사용한 대부분의 시약은 Sigma Chemical Co.
- 실험동물은 male Sprague-Dawley rats(바이오링크, KoreaX 사용하였으며, 사육장의 온도는 22 ± 2℃( 습도는 55±5%로 유지하였고 충분한 물과 사료(퓨리나, Korea)를 공급하며 사육하였다. 체중이 300~400 g이 되는 것을 diethyl ether로 마취시킨후 복대동맥에서 18G주사기를 이용하여 혈액을 채취하였다.
이론/모형
- 혈소판으로부터의 lactate dehydrogenase(LDH) 유출은 spectrophotometry 방법을 이용하여 측정하였다. WP에 목초액을 농도별로 가한 후, 37℃에서 incubation 하면서 각 시간대별로 WP 100 ㎕를 취하여 10,000 g에서 2분간 원심분리하였다.
- 혈소판을 활성화시킬 때 생성되는 serotonin은 fluorimetric method를 이용하여 측정했다(Holmsen and Dangelmaier, 1989). WP에 목초액을 농도별로 처리하고 37℃에서 10분간 incubation한 후, thrombin 0.
성능/효과
- ,1997). Thrombin에 의해 유도되는 혈소판응집을 저해하였던 목초액 농도를 사용하여, plasma에 목초액을 처리하고 10분간 37℃에서 incubation후 혈장응고 시간을 측정한 결과 목초액의 사용한 농도와 관계없이 혈장 응고 시간을 변화시키지 않았다. 이는 목초액은 혈장응고 인자에 직접 작용하지 않으며, thrombin inhibitor로서의 효과를갖지 않음을 제시한다(Table 1).
- WP에 목초액을 농도별로 가한 후 각 시간대별로 시료를 취하여 LDH의 활성을 측정한 결과 양성 대조군으로 사용한menadione 250 μM은 LDH 유출을 크게 증가시키는 반면 목초액이 처리된 WP에서는 유의적인 LDH 유출이 없었다(Fig. 3). 이와 같은 결과로부터, 목초액의 혈소판 활성화 억제 작용은 혈소판에 미치는 세포독성 때문은 아닌 것으로 사료된다.
- 2). 더불어 in vivo 실험인 mouse tail bleeding 실험을 통해 목초액 농도 의존적으로 bleeding time이 연장되는 것을 확인하였다(Table 2). 또한 이러한혈소판의 활성화를 억제하는 목초액의 효과가 세포 독성과 연관이 있는지 알아보기 위해 LDH의 유출을 지표로 확인하였으나 이러한 목초액의 효과는 세포독성과는 관련이 없음을 밝혔다(Fig 3).
- 1). 또 혈소판의 granule에 저장되어 있다가, 혈소판이 thrombin 등의 agonist 자극에의해 활성화되면 혈소판 밖으로 분비되어 혈소판 활성화 및 혈관 수축을 유발하는 serotonin 분비에 대해 목초액이 농도 의존적으로 serotonin 분비를 억제하는 것을 확인하였다(Fig. 2). 더불어 in vivo 실험인 mouse tail bleeding 실험을 통해 목초액 농도 의존적으로 bleeding time이 연장되는 것을 확인하였다(Table 2).
- 더불어 in vivo 실험인 mouse tail bleeding 실험을 통해 목초액 농도 의존적으로 bleeding time이 연장되는 것을 확인하였다(Table 2). 또한 이러한혈소판의 활성화를 억제하는 목초액의 효과가 세포 독성과 연관이 있는지 알아보기 위해 LDH의 유출을 지표로 확인하였으나 이러한 목초액의 효과는 세포독성과는 관련이 없음을 밝혔다(Fig 3).
- 1 U/ml를 가한 후 3분간 유리되는 serotonin을 정량하였다. 실험결과 목초액은 농도의존적으로 serotonin 분비를 억제하였다(Fig. 2), 특히 2% 목초액은 serotonin 분비를 80% 이상 억제하였다. 이 결과는 Fig.
- 실험결과로 부터 thrombin과 collagen에 의한 응집의 저해는 thrombin의 경우 IC50은 0.748%이었고 collagen 의 경우 IC50은 0.547%이었다. serotonin 분비 저해의 경우 thrombin에 대한 IC50을 볼 때 1.
- 2% 목초액은 thrombin 및 collagen에 의한 혈소판 응집을 완전히 억제하였다. 이러한 결과를 토대로 IC50를 산출한 결과 thrombin에 대한 IC50는 0.748%이었으며 그리고 collagen에 대한 IC50는 0.547%이었다.
- 이번 연구에서는 in vitro에서 thrombin과 collagen에 의해 유도되는 rat 혈소판의 응집을 목초액이 농도 의존적으로 저해함을 보였다(Fig. 1). 또 혈소판의 granule에 저장되어 있다가, 혈소판이 thrombin 등의 agonist 자극에의해 활성화되면 혈소판 밖으로 분비되어 혈소판 활성화 및 혈관 수축을 유발하는 serotonin 분비에 대해 목초액이 농도 의존적으로 serotonin 분비를 억제하는 것을 확인하였다(Fig.
후속연구
- 결국 이러한 결과들을 종합해 볼 때 정상상태에서 당뇨병, 담배 등 유전적, 환경적 여러 가지 요인에 의하여 혈소판이 활성화되는데, 목초액은 이러한 지나친 활성화를 억제함으로써 혈행개선제로서의 기능이 기대된다고 하겠다.
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