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제안 방법
- 5 mM MgCl2)에 총 부피가 25 μL되게 증류수를 첨가하였다. DNA 증폭은 PTC-200 Thermal Cycler(MJ Research, Germany)를 이용하였으며, PCR 조건은 처음 94℃에서 5분간 변성 후, 94℃ 1분, 52℃ 1분, 72℃ 1분을 1주기로 40 주기를 시행한 후 72℃에서 5분간 연장 반응을 시켰다. 증폭된 PCR 산물은 2% agarose gel에서 100V로 45분간 전기영동 후 UV-transilluminator 를 통하여 관찰한 후 사진을 찍었다.
- DNA의 추출은 상품화된 키트(Bioneer, AccuePrepⓇ Genomic DNA extraction kit)를 사용하여 제조사의 설명서대로 시행하였으며, 추출된 DNA는 PCR이 이용할 때까지 －20℃에 보관하였다.
- ERIC-PCR에 의한 아형분류는 증폭된 DNA band의 수와 band의 위치에 따라 3개 이상의 차이가 있을 경우 A, B, C, D, E, F, G, H, I형으로 대별하였으며, DNA band의 차이가 1-2개 인 경우 1, 2, 3, 4 등으로 세분하였다. V.
- 시발체는 기존문헌(Wong과 Lin, 2001)을 참고하여 바이오니아(Bioneer, Korea)에 주문 제작하였으며, 염기서열은 ERIC-1; 5'-GTGAATCCCCAGGAGCTTACAT-3', ERIC-2; 5'-AAGTA- AGTGACTGGGGTGAGCG-3'이다. PCR 반응액은 dNTP 200 μM, MgCl2 2 mM, primer 100 pmol, Taq DNA polymerase (Bioneer, Korea) 0.5 U, genomic DNA 100 ng 및 반응 완충액(10 mM Tris HCl, 40 mM KCl, 1.5 mM MgCl2)에 총 부피가 25 μL되게 증류수를 첨가하였다. DNA 증폭은 PTC-200 Thermal Cycler(MJ Research, Germany)를 이용하였으며, PCR 조건은 처음 94℃에서 5분간 변성 후, 94℃ 1분, 52℃ 1분, 72℃ 1분을 1주기로 40 주기를 시행한 후 72℃에서 5분간 연장 반응을 시켰다.
- V. parahemolyticus가 분리된 환자의 균 분리일, 진단명, 병동 등의 임상정보를 진료기록을 통하여 조사하였다.
- 균의 동정을 위해 설사를 주소로 내원한 환자의 대변을 MacConkey agar, SS agar, thiosulfate citrate bile salt agar (TCBS) 배지에 접종 후 37℃에서 하룻밤 동안 배양한 후 TCBS 선택배지에서 초록색 집락을 선택하였다. Oxidase 검사에서 양성을 보이고, 0% NaCl에서 자라지 않으며 6% NaCl에서 자란 균을 Vitek system (bioMerieux, Inc.
- PCR 방법을 이용한 아형분류는 PFGE보다 재현성이 떨어지는 것이 큰 단점인데, 특히 RAPD와 같이 짧은 시발체를 사용하는 경우가 낮은 재현성을 보인다고 알려져 있다. 그러나 ERIC-PCR은 시발체의 길이가 RAPD보다 길어 보다 재현성이 우수하다고 알려져 있으며, 같은 실험실내에서 시행할 경우는 동일한 기기 및 방법을 이용하므로 재현성에는 큰 문제가 없을 것으로 사료되어 본 연구에서는 재현성 실험을 하지 않았다
- 분자유전학적 분류에 PCR을 이용하는 방법에는 random amplified polymorphic DNA, repetitive-element PCR(rep-PCR) 등(Madico 등,1995; Hulton 등, 1991; Stem 등, 1984; Wood 등, 1992)도 있는데, 이들 방법은 IRS-PCR 보다 좀더 간편하고 실용적이다. 따라서 저자들은 V. parahaemolyticus의 분자유전학적 분류에 rep-PCR 중 enterobacterial repetitive intergenic consensus(ERIC)-PCR을 적용하여 보았다.
- coli, Salmonella, Shigella 등이 설사의 주요 원인균 인데, 이들 균은 계절 및 지역에 국한되지 않고 설사를 일으켜 이들 균의 아형분류 및 Vibrio spp. 와의 차이를 보기 위해 ERIC-PCR을 시행하였다. 3개의 E.
- 그러나 이 방법도 PCR 방법에 제한 효소를 첨가하는 단계가 필요하다. 저자는 단지 PCR 방법만으로 아형분류를 시행하여 일반 검사실에서 쉽게 접근할 수 있는 ERIC-PCR을 V. parahaemolyticus의 아형 분류에 이용하여 보았다. ERIC (enterobacterial repetitive intergenic consensus)은 장내세균 및 다양한 세균의 염색체의 서로 다른 위치에 존재하는 repetitive element이다(Halton 등, 1991).
- DNA 증폭은 PTC-200 Thermal Cycler(MJ Research, Germany)를 이용하였으며, PCR 조건은 처음 94℃에서 5분간 변성 후, 94℃ 1분, 52℃ 1분, 72℃ 1분을 1주기로 40 주기를 시행한 후 72℃에서 5분간 연장 반응을 시켰다. 증폭된 PCR 산물은 2% agarose gel에서 100V로 45분간 전기영동 후 UV-transilluminator 를 통하여 관찰한 후 사진을 찍었다.
- 디스크 확산법은 NCCLS guideline(NCCLS, 2000)에 따라 시행하였으며 약술하면 다음과 같다. 하룻밤 동안 배양한 집락을 0.45% NaCl에 풀어 McFarland 0.5관에 맞추고 Mueller Hinton 배지에 접종하였다. 이어서 항균제 디스크를 올려놓은 다음 37℃에서 16-18시간 배양한 후 억제대 직경을 재었다.
대상 데이터
- coli ATCC 51435(verotoxin varinant), Salmonella. Typhi(임상분리주), Salomenlla group B, D(임상분리주), Shigella dysenteriae 및 Shigella sonnei(임상분리주) 등을 포함하였다.
이론/모형
- 항균제 감수성 검사는 디스크 확산법을 이용하였으며, 사용한 항균제는 tetracycline, ampicillin, ciprofloxacin 등이었다. 디스크 확산법은 NCCLS guideline(NCCLS, 2000)에 따라 시행하였으며 약술하면 다음과 같다. 하룻밤 동안 배양한 집락을 0.
- 시발체는 기존문헌(Wong과 Lin, 2001)을 참고하여 바이오니아(Bioneer, Korea)에 주문 제작하였으며, 염기서열은 ERIC-1; 5'-GTGAATCCCCAGGAGCTTACAT-3', ERIC-2; 5'-AAGTA- AGTGACTGGGGTGAGCG-3'이다. PCR 반응액은 dNTP 200 μM, MgCl2 2 mM, primer 100 pmol, Taq DNA polymerase (Bioneer, Korea) 0.
- 항균제 감수성 검사는 디스크 확산법을 이용하였으며, 사용한 항균제는 tetracycline, ampicillin, ciprofloxacin 등이었다. 디스크 확산법은 NCCLS guideline(NCCLS, 2000)에 따라 시행하였으며 약술하면 다음과 같다.
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