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문제 정의
- 6一9)특히 야채와 과일에는 항산화성분인 폴리페놀이 많이 함유되어 있는 것으로 알려져 있다.이에 본 연구에서 는 한국인들이 즐겨먹는 5종의 야채 및 4종의 과일로부터 flavonoic® 비롯한 폴리페놀 화합물들이 다량으로 들어 있는 엑스 를 각각 제조하고, 이 엑스들의 항산화활성을 밝혀 이들의 항산화 기능성 식품으로서의 용도를 개발하기 위한 연구를 수행하였다. 5 종의 야채로부터 추출된 야채생리활성추출물과 4종의 과일로부터 추출된 과일생리활성추출물들을 대상으로 하여 전보⑵의 in vitro 실험에 이어 in vivo 항산화작용을 평가하기 위하여 강력한 산화 제인 KBrO3 유도에 대한 생쥐 간조직의 지질과산화억제실험 을 실시하였다.
- 5 종의 야채로부터 추출된 야채생리활성추출물과 4종의 과일로부터 추출된 과일생리활성추출물들을 대상으로 하여 전보⑵의 in vitro 실험에 이어 in vivo 항산화작용을 평가하기 위하여 강력한 산화 제인 KBrO3 유도에 대한 생쥐 간조직의 지질과산화억제실험 을 실시하였다. 한편, 산화적 DNA 손상 및 염색체손상억제효과 를 평가하기 위하여 생쥐 말초혈액을 이용한 single cell gel electrophoresis(comet assay)와 소핵시험 (micronucleus assay)를 각각 실시하여 항산화효과를 규명하여 이에 보고하는 바이다.
제안 방법
- 'Sample (p.o.) was treated for 6 days a week for one month, and was treated with KBrO3 (80 mg/kg, i.p.) daily for last 4 consecutive days, simultaneously. Blood from heart puncture was taken at 24 hours after final treatment of KBrO3.
- 이에 본 연구에서 는 한국인들이 즐겨먹는 5종의 야채 및 4종의 과일로부터 flavonoic® 비롯한 폴리페놀 화합물들이 다량으로 들어 있는 엑스 를 각각 제조하고, 이 엑스들의 항산화활성을 밝혀 이들의 항산화 기능성 식품으로서의 용도를 개발하기 위한 연구를 수행하였다. 5 종의 야채로부터 추출된 야채생리활성추출물과 4종의 과일로부터 추출된 과일생리활성추출물들을 대상으로 하여 전보⑵의 in vitro 실험에 이어 in vivo 항산화작용을 평가하기 위하여 강력한 산화 제인 KBrO3 유도에 대한 생쥐 간조직의 지질과산화억제실험 을 실시하였다. 한편, 산화적 DNA 손상 및 염색체손상억제효과 를 평가하기 위하여 생쥐 말초혈액을 이용한 single cell gel electrophoresis(comet assay)와 소핵시험 (micronucleus assay)를 각각 실시하여 항산화효과를 규명하여 이에 보고하는 바이다.
- 5% carboxy methyl cellulose (CMC)에 녹여 사용하였다. Negative 군은 0.5% CMC 4주 경구 투여하고, 주사용수는 마지므} 4일 동안에 복강주사하였다. Positive 군은 0.
- 5% CMC 4주 경구 투여하고, 주사용수는 마지므} 4일 동안에 복강주사하였다. Positive 군은 0.5% CMC 4주 경구투여하고, KBrC>3는 마지막 4일 동안 복강주사하였다. Treatment 군은 각 검체 (BV BF는 각각 100 mg/kg, 250 mg/kg, 500 mg/kg 4주 경구투여, vitamin C, trokg quercetin은 10 mg/kg 4주 경구투여)하였고, 마지막 4일 동안에는 KBrO3< 복강주사하였다.
- 'Sample (p.o.) was treated for 6 days a week for one month, and was treated with KBrO3 (80 mg/kg, i.p.) daily for last 4 consecutive days, simultaneously. Blood from heart puncture was taken at 24 hours after final treatment of KBrO3.
- Sample (p.o.) was treated for 6 days a week for one month, and was treated with KBrO3 (80 mg^kg, i.p.) daily for last 4 consecutive days, simultaneously. Liver from mouse was removed at 24 hours after final treatment of KBrO3.
- 5% CMC 4주 경구투여하고, KBrC>3는 마지막 4일 동안 복강주사하였다. Treatment 군은 각 검체 (BV BF는 각각 100 mg/kg, 250 mg/kg, 500 mg/kg 4주 경구투여, vitamin C, trokg quercetin은 10 mg/kg 4주 경구투여)하였고, 마지막 4일 동안에는 KBrO3< 복강주사하였다. 마지막 투여 후 24시간에 소 핵시험을 위하여 꼬리정맥에서 말초혈액을 채혈하였고, comet 시험을 위해서 심장채혈을 시행하였으며 이후 간 조직을 적출하 여 지질과산화시험에 사용하였다.
- 5)에 30분간 담가 중화시켰다. Ttay에 걸어 말린 후 ethidium bromide(2 pg/rni) 20 B를 각각에 떨어뜨린 후 515— 560 nm의 excitation filter와 590 nm의 barrier Slter를 이용하여 형광현미경으로 관찰하여 image analyzer인 KOMET 5.5(Kinetic image, England)를 사용하여 슬라이드 당 50 cell을 분석하였다. Comet 시험의 데이터는 Olive tail moment(% DNAx distance of center of gravity of DNA, OTM) 와 tail length(distance between the head and the last DNA fragment, TL)로 나타내었다.
- 각 실험군은 6마리씩으로 하고 1일 1회(주 6일) 일정한 시간 에 검체 (0.2 m〃25 g 마우스체중)를 4주간 경구투여하였다. KBrO3 는 주사용수에 녹였으며 마우스에 80mg/kg 용량으로 투여되도 록 조제하였으며, 검체들은 0.
- 강원도 양구지방에서 재배된 배추(Bnzs戒a campestris), 무청 (Raphanus sativus), 양파(4〃彼, ” cepa), 오이 庆s sativus), 샐러 리 0所"所 garveolens)^: 구입하여 물로 세척 한 후 건조기 에서 건조하였다. 건조된 야채를 0.1 의 비율로 섞고 여기에 주정(대한주정) 20/와 정제수 20 Z를 가해 20일간 실온에 서 방치하고 여과 후 농축하여 암녹색의 연조엑스(Bioactive Vegetables, BV)를 얻었다. 건조야채로부터의 회수율은 약 22%(w/w)였다.
- 17)마 우스 꼬리 정맥을 주사바늘로 찔러 소량 분출해 나오는 혈액을 미리 acridine orange로 코팅된 슬라이드 상에 떨어뜨렸다. 곧 카 바글래스를 덮고 2시간 이후에 1, 000개의 망상적혈구(reticulocyte, RET) 중 소핵을 가진 망상적 혈구(micronucleated reticulocyte, MNRET)를 관찰하였다. 관찰은 형광현미경(blue excitation, 488 nm & yellow filter, 515nm)에서 l, 000x로 하였다.
- 곧 카 바글래스를 덮고 2시간 이후에 1, 000개의 망상적혈구(reticulocyte, RET) 중 소핵을 가진 망상적 혈구(micronucleated reticulocyte, MNRET)를 관찰하였다. 관찰은 형광현미경(blue excitation, 488 nm & yellow filter, 515nm)에서 l, 000x로 하였다.
- 동물세포I© 및 rat의 콩팥&에 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine(80H2'dG)을 생 성시킴。로서 세포내에 산화적 스트레스를 야기시키는 물질이다. 따라서 in 勿初에서 산화적 스트레스를, 용이하게 유도하기 위하 여 KBrQj를 투여하였다.
- 마우스 꼬리정맥혈을 이용하여 소핵시험을 실시하였다.17)마 우스 꼬리 정맥을 주사바늘로 찔러 소량 분출해 나오는 혈액을 미리 acridine orange로 코팅된 슬라이드 상에 떨어뜨렸다.
- Treatment 군은 각 검체 (BV BF는 각각 100 mg/kg, 250 mg/kg, 500 mg/kg 4주 경구투여, vitamin C, trokg quercetin은 10 mg/kg 4주 경구투여)하였고, 마지막 4일 동안에는 KBrO3< 복강주사하였다. 마지막 투여 후 24시간에 소 핵시험을 위하여 꼬리정맥에서 말초혈액을 채혈하였고, comet 시험을 위해서 심장채혈을 시행하였으며 이후 간 조직을 적출하 여 지질과산화시험에 사용하였다.
- 본 연구에서는 마우스에 KBrO3 투여 후 유도된 마우스 혈액 세포 중 임파구의 DNA single strand breakage# comet assay 로 평가하였다. vitamin C, trolox, quercetin 등 항산화제들과 함 께 BV와 BF는 조추출물임에도 불구하고 높은 항산화활성을 나 타내었다.
- 산화적 stress에 대하여 보호활성을 갖는 chemopreventive agents# 창출하기 위하여 S종의 야채로부터 추출된 야채생리활 성추출물(Bioactive Vegetables, BV)와 4종의 과일로부터 추출된 과일생리활성추출물(Bioactive Fruits, BF)을 가지고 생쥐를 이 용한 in vivo 시험에서 KBrO3 유도 지질과산화억제활성과 산화 적 DNA 손상억제시험 , 산화적 염색체손상억제시험을 실시하였 다. 시험결과 BV와 BF는 강력한 항산화작용을 지닌 것으로 알 려진 vitamin C, trolox, quercetin 보다는 낮았으나 대체로 투여 용량에서 통계학적 유의성이 있는 억제활성을 나타내었으며, 대 체로 용량의존적인 항산화작용을 나타내었다.
- 건조야채로부터의 회수율은 약 22%(w/w)였다. 한편, 강원도 양구산 사과(MzZus pumilar), 배 (Pyrus communis), 포도(V2tis viniferd), 제주산 감귤(Citrus aMrantiiiwi)을 세척하고 1:1:1의 비율로 섞고 주정(대한주정) 을 30Z를 가하고 실온에서 20일간 방치하였다. 이것을 여과하고 농축하여 암갈색의 연조엑스(Bioactive Fruits, BF)를 얻었다.
대상 데이터
- 강원도 양구지방에서 재배된 배추(Bnzs戒a campestris), 무청 (Raphanus sativus), 양파(4〃彼, ” cepa), 오이 庆s sativus), 샐러 리 0所"所 garveolens)^: 구입하여 물로 세척 한 후 건조기 에서 건조하였다. 건조된 야채를 0.
- 5(Kinetic image, England)를 사용하여 슬라이드 당 50 cell을 분석하였다. Comet 시험의 데이터는 Olive tail moment(% DNAx distance of center of gravity of DNA, OTM) 와 tail length(distance between the head and the last DNA fragment, TL)로 나타내었다.'汹)
- 였다. 본 실험에서 사용한 ICR 생쥐는 (주)폴라스인터내셔날에 서 공급받아 강원대학교 약학대학 동물사육실 내에 있는 양압의 무균동물챔버에서 23±1°C 및 상대습도 55±7%의 조건으로 7~10일 적응시킨 후 사'용했다. 사료는 삼양유지의 마우스식 pellet 사료를 주었으며, 물은 자유롭게 먹게 흐}고, 12 h/12 h(L/D) cycle 의 조건에서 실험하였다.
- 본 실험에서 사용한 ICR 생쥐는 (주)폴라스인터내셔날에 서 공급받아 강원대학교 약학대학 동물사육실 내에 있는 양압의 무균동물챔버에서 23±1°C 및 상대습도 55±7%의 조건으로 7~10일 적응시킨 후 사'용했다. 사료는 삼양유지의 마우스식 pellet 사료를 주었으며, 물은 자유롭게 먹게 흐}고, 12 h/12 h(L/D) cycle 의 조건에서 실험하였다.
- 상등액을 취하여 535nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준 물질로서 1, 1, 3, 3-tetraethyl ethoxy propane을 사용하였으며 검 량선으로부터 MDA양을 계산하여 생성된 과산화지질의 양을 MDA gmol/g of tissues. 나타내었다.
데이터처리
- 01. The groups with different alphabet are significantly different in the treatment groups of BV or BF including positive control (CMC+KBrO3 80 mg/kg) at p<0.05 (ANOVA/Duncan's multiple comparison test).
- 01. The groups with different alphabet are significantly different in the treatment groups of BV or BF including positive control (CMC+KBrO3 80 mg/kg) at p<0.05 (ANOVA/Duncan's multiple range test).
- 통계처리는 Student's t-test를 사용하여 대조군과 투여군의 유의성을 검정하였고, ANOVA with multiple comparison test를 사용하여 용량간의 유의성 있는 차이를 분석하였다.
성능/효과
- 01) 억제 효과를 나타내었다. BV가 BF보다 활성이 다소 높은 편이었으며 대조물질로 사용한 항산화제들의 활성은 vitamin C, trolox, quercetin 순이었고, 이들은 투여용량 10 mg/kg에서 활성이 크게 나타났다. 대체로 BV 및 BF와 대조 항산화제들에 대한 산화적 DNA 손상억제효과는 Table I의 지질과산화시험의 억제경향처럼 유사하게 나타났다.
- BV와 BF는 투여용량에서 용량의존적인 억제효과를 나타내었다. Student's t-test에서 BV의 경우에는 500 mg/kg, BF의 경우에는 250, 500mg/kg에서 유의성 (p<0.01) 있는 억제효과가 관찰되었으며 BV가 BF보다 활성이 다소 높은 편이었다. 대조물질로 사용한 항산화제들의 활성은 vitamin C, trolox, quercetin 순이었으며 투여용량 10mg/kg에서 활성이 크 게 나타났다.
- KBrQj에 의한 BV와 BF 및 항산화제들의 염색체 손상에 의 한 소핵생성의 억제활성을 Table HI에 나타내었다. Students t- test에서 BF 100 mg/kg군을 제외하고(p<0.05), BV와 BF는 투여농도에서 유의성이 높은(p<0.01) 억제활성을 나타내었으며, BV가 BF보다 활성이 높은 편이었으며 대조물질로 사용한 항산 화제들의 활성은 vitamin C, trolox, quercetin 순이었다. BV BF 및 항산화제들에 대한 억제효과는 Table I의 지질과산화시험과 Table II의 산화적 DNA 손상억제실험 결과와 대체로 유사한 경 향을 나타내었다.
- 투여 후 유도된 마우스 혈액 세포 중 임파구의 DNA single strand breakage# comet assay 로 평가하였다. vitamin C, trolox, quercetin 등 항산화제들과 함 께 BV와 BF는 조추출물임에도 불구하고 높은 항산화활성을 나 타내었다. Comet assay는 여러 가지 작용기전의 유전독성물질 에 의한 단일세포에서의 DNA 손상을 검출할 수 있는 예민한 방 법으로 알려져 있다.
- 1&31)한편, Sai 등에 의하면 흰쥐에서 KBrCW에 유도된 소핵이 vitamin C, glutathione, cysteine 등에 의해 감소되었음을 보고하고 있다.⑺ 본 연구에서 도 vitamin C는 물론이고 trolox, quercetin 등 항산화제들과 함 께 BV와 BF는 KBrQj와 같은 강력한 ROS 유발물질에 의한 염 색체 수준에서의 손상에 대해서도 잘 나타내었다.
- 01) 있는 억제효과가 관찰되었으며 BV가 BF보다 활성이 다소 높은 편이었다. 대조물질로 사용한 항산화제들의 활성은 vitamin C, trolox, quercetin 순이었으며 투여용량 10mg/kg에서 활성이 크 게 나타났다. 따라서 BV과 BF는 조추출물임에도 불구하고 양호 한 지질과산화억제효과가 있는 것으로 판단되었다.
- 대조물질로 사용한 항산화제들의 활성은 vitamin C, trolox, quercetin 순이었으며 투여용량 10mg/kg에서 활성이 크 게 나타났다. 따라서 BV과 BF는 조추출물임에도 불구하고 양호 한 지질과산화억제효과가 있는 것으로 판단되었다.
- 대조물질로 사용한 항산화제들의 활성은 vitamin C, trolox, quercetin 순이었으며 투여용량 10mg/kg에서 활성이 크 게 나타났다. 따라서 BV과 BF는 조추출물임에도 불구하고 양호 한 지질과산화억제효과가 있는 것으로 판단되었다.
- BV BF 및 항산화제들에 대한 억제효과는 Table I의 지질과산화시험과 Table II의 산화적 DNA 손상억제실험 결과와 대체로 유사한 경 향을 나타내었다. 따라서, BV와 BF는 조추출물임에도 불구하고 양호한 산화적 염색체손상(소핵생성)억제효과가 있는 것으로 판 단되 었다.
- 유도 산화적 스트레스에 의한 산화적 DNA 손상에 대한 억제효과를 나타내었다. 산화적 DNA 손상을 Olive tail moment(OTM)과 tail length(TL)로 나타내었을 때, BF 100 mg/kg군을 제외하고 투여용량에서 유의성이 높은(p<0.01) 억제 효과를 나타내었다. BV가 BF보다 활성이 다소 높은 편이었으며 대조물질로 사용한 항산화제들의 활성은 vitamin C, trolox, quercetin 순이었고, 이들은 투여용량 10 mg/kg에서 활성이 크게 나타났다.
- 유도 지질과산화억제활성과 산화 적 DNA 손상억제시험 , 산화적 염색체손상억제시험을 실시하였 다. 시험결과 BV와 BF는 강력한 항산화작용을 지닌 것으로 알 려진 vitamin C, trolox, quercetin 보다는 낮았으나 대체로 투여 용량에서 통계학적 유의성이 있는 억제활성을 나타내었으며, 대 체로 용량의존적인 항산화작용을 나타내었다.
- 따라서, BV와 BF와 같은 조성물들은 flavonoid를 비롯한 항산 화성 polyphenol 화합물들을 함유하여 in 成。에서 KBrO3 유도 지질과산화억제활성을 나타내었으며 , DNA 및 염색체 수준에서 의 산화적 손상에 대해서도 억제효과를 나타내었다. 비록 BV와 BI* 대조 항산화제들보다는 항산화활성이 낮았지만 비교적 완 만한 활성을 특징으로 흐)는 건강기능식품용으로는 응용가치가 큰 활성소재로 판단된다.
후속연구
- 비록 BV와 BI* 대조 항산화제들보다는 항산화활성이 낮았지만 비교적 완 만한 활성을 특징으로 흐)는 건강기능식품용으로는 응용가치가 큰 활성소재로 판단된다. 그러므로 BV와 BF 등 조성물들은 산 소유리기들에 의한 산화적 손상에 억제적으로 작용하는 기전을 활용하여 향후 항산화, 항노화, 암예방제로서의 응용가능성이 높 은 추출물 및 관련제제로서 항산화 기능성 식품으로서의 응용가 능성이 있는 것으로 판단되었다.
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