[논문]CYP1A1 유전자발현과 소아천식의 상관

양미희

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Due to steady increase of childhood asthma, exposure to air toxics including PAHs have been thought as an etiology for the asthma. PAHs -involvement in airway inflammation, such as IgE production, is the potential mechanism of the PAHs-induced asthma. Cytochrome P450s (CYPs), particularly CYP1A1 is ...

Due to steady increase of childhood asthma, exposure to air toxics including PAHs have been thought as an etiology for the asthma. PAHs -involvement in airway inflammation, such as IgE production, is the potential mechanism of the PAHs-induced asthma. Cytochrome P450s (CYPs), particularly CYP1A1 is known enzyme to metabolite PAHs and to be induced by PAHs. The CYP1A1 expression has been emphasized as an biomarker for PAHs - exposure. The present study was performed to clarify the etiology of childhood asthma with PAHs-exposure using mRNA expression of CYP1A1 . The study Objects were Korean children who were asthma patients (cases) or other hospital controls (N=20; age,3 $\~$ 16; boys,56$\%$). As result, we detected expression of the CYP1A1 in all peripheral blood specimens which were collected from the subjects. Moreover, we found approx. 300 fold-higher expression of the CYP1A1 in the cases than that in the controls (p(<)0.01). When we considered age which was related to Asthma, the above significant trend was somewhat diluted, however, the relation between asthma and the Cypih i expression waL stronger than that between asthma and age (chi square,7.99 vs. 3.34). Therefore, our study supports that PAHs induce or worse childhood asthma and suggests application of expression of the CYP1A1 as an initiation or progress biomarker for PAHs - induced childhood asthma.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

, 2005). 그러므로 본 연구는 PAHs와 소아 천식의 기전을 구명하고 나아가 소아천식과 관련 한 선택적이며 특이적이며 비침해인 PAHs 생체지표를 개발하여 향후 PAHs의 올바른 규제에 기여하기 위하여, PAHs에 의해 유도되는 유전자 cytochrome P450(CYP)lAl 발현을 중심으로 소아천식 과의 관련을 중심으로 수행되었다.
폐조직은 PAH류에 대한 표적장기로써 결정적인 병인학 정보를 갖고 있지만 PAH류에 대한 노출을 규제하기 위한 모니터링을 위하여, 혈액, 또는 소변 등과 같이 보다 비침해적 인 조직 이 필요하다. 따라서 본 연구에서는 혈액에서 CYP1A1 발현량을 정량하여 CYP1A1과 천식과의 상관을 통하여 천식의 병인학으로써 PAH류의 관여를 구명하려 하였다.
, 2002). 본 연구에서는 PAHs 노출을 반영호 CYP1A1 mRNA 발현이 소아천식환자에서 대조군에 비하여 약 300배 가량 높아 천식의 병인학으로 PAH류의 노출을 제시하였다. 나아가, 본 연구결과로부터 비침해적인 조직인 말초혈유래 CYP1A1 발현은 PAHs노출지표로써 뿐만 아니라, 소아천식의 발생(발작) 및 악화의 지표로써 효용성이 제안되었다.

제안 방법

합성된 cDNA 3 |1L에 2x syber green PCR master mix (ABI)) 10 |1L, CYP1 Al forward primer, 5'- GCTG ACTTC ATCCCT ATTCTTCG - 3; 1 pmole; CYP1A1 reverse primer, 5Z-TTTTGTAGTGCTCC- TTGACCAT-CT-3; 6 pmol-f- 가하여 반응액 총20)jlL를 조제, ABI Prism 7500 Sequence Detection System으로 Taqman fluorogenic real time PCR을 실시하였다 또한, reference gene으로 18S rRNA를 선택하여 18S rRNA kit (ABI)를 사용하여 그 발현을 제작사의 방법을 따라 정량하였다. Standard curve를 작성하여 CYP1A1과 18SrRNA, 이 두유 전자 발현이 각 cDNA농도에 따라 일정한 효율(efficiency)을 나타냄을 확인한 뒤 (ACt vs. log RNA concentration: | slope |<0.1), 가장 큰 Z\Ct (CYP1A1 Ct-18SrRNA의 Ct)를 보인 대조군의 일정 시료값을 기준으로 하여 &XCt법에 의해 제작사의 방법에 따라 상대 정량하였다. Well to well 및 plate to plate error를 극복하기 위하여 각각 3회씩 한 시료 당 총 9회의 반복실험 후, CV (coefficient of variation) 10% 이하인 값만을 data로 취하 였다
1), 가장 큰 Z\Ct (CYP1A1 Ct-18SrRNA의 Ct)를 보인 대조군의 일정 시료값을 기준으로 하여 &XCt법에 의해 제작사의 방법에 따라 상대 정량하였다. Well to well 및 plate to plate error를 극복하기 위하여 각각 3회씩 한 시료 당 총 9회의 반복실험 후, CV (coefficient of variation) 10% 이하인 값만을 data로 취하 였다
본 연구는 대상군의 크기를 고려할 때 예비연구(pilot study) 에 속하지만 통계적으로 알려진 소아천식의 분포 가 주로 9세 이하 어린 소아 인구에서 호발하므로 본 천식환자군은 이러한 연령분포를 잘 반영하였다. 따라서, 환자와 대조군에서 차후 CYP1A1 발현 량 비교 시 나이를 고려하였다.
본 연구진의 방법 (Yang et al., 2005)에 따라 유전자발현에 영향을 줄 수 있는 일체의 조작을 가하지 않기 위하여 phytohemagglutinin 등 세포분열 촉진인자를 가하지 않고 순수 말초혈액 0.9 mL에 3배 용적의 Trizol LS (Invitrogen, Carlsbad, CA) 2.7 mL에 적용하여 total RNA를 분리하였다. 분리된 total RNA는 DNase (GibcoBRL, Gaithersburg, MD) 을 처리하여 genomic DNA를 제거한 후 Taqman RT reagent Kit (ABI, Foster City, CA)를 이용하여 cDNA로 전환.
합성된 cDNA 3 |1L에 2x syber green PCR master mix (ABI)) 10 |1L, CYP1 Al forward primer, 5'- GCTG ACTTC ATCCCT ATTCTTCG - 3; 1 pmole; CYP1A1 reverse primer, 5Z-TTTTGTAGTGCTCC- TTGACCAT-CT-3; 6 pmol-f- 가하여 반응액 총20)jlL를 조제, ABI Prism 7500 Sequence Detection System으로 Taqman fluorogenic real time PCR을 실시하였다 또한, reference gene으로 18S rRNA를 선택하여 18S rRNA kit (ABI)를 사용하여 그 발현을 제작사의 방법을 따라 정량하였다. Standard curve를 작성하여 CYP1A1과 18SrRNA, 이 두유 전자 발현이 각 cDNA농도에 따라 일정한 효율(efficiency)을 나타냄을 확인한 뒤 (ACt vs.

대상 데이터

서울대학교병원과 인하대학교병원에 온천식 및 다른 질환 소아환자 중, 본인과 보호자가 담당의사 와의 인터뷰에 자원자로 응한 20명(천식환자 10명, 대조군 10명; 연령, 3~ 16세; 남아, 56%; 여아, 44%)을 대상으로 하였다. 각 지원자로부터 EDTA 처리 말초혈 ImL를 채집하여 실험 전까지 -80도에 보관하였다.

데이터처리

CYP1A1 발현량에 대한 정규분포 판정은 Shapiro-Wilk W test에 따랐다. 두집단, 천식군과 대조군에서 CYP1A1 발현량의 비교분석은 Mann- Whitney test로 수행하였다. 천식발생에 대한, 나이, 와 CYP1A1 발현의 영향을 함께 고려하기 위하여 multiple nominal logistic regression을 수행하였다.
두집단, 천식군과 대조군에서 CYP1A1 발현량의 비교분석은 Mann- Whitney test로 수행하였다. 천식발생에 대한, 나이, 와 CYP1A1 발현의 영향을 함께 고려하기 위하여 multiple nominal logistic regression을 수행하였다. 모든 통계는 JMP software (version 4; SAS institute, Cary, NC)를 사용하였다.
천식환자와 대조군에서 나이 및 성별의 분포차이는 각각 nominal logistic regression, contingency table analysis (the Pearson Chi Square test)를 사용하였다. CYP1A1 발현량에 대한 정규분포 판정은 Shapiro-Wilk W test에 따랐다.

이론/모형

천식환자와 대조군에서 나이 및 성별의 분포차이는 각각 nominal logistic regression, contingency table analysis (the Pearson Chi Square test)를 사용하였다. CYP1A1 발현량에 대한 정규분포 판정은 Shapiro-Wilk W test에 따랐다. 두집단, 천식군과 대조군에서 CYP1A1 발현량의 비교분석은 Mann- Whitney test로 수행하였다.
전체 말초혈 시료에서 CYP1A1 발현을 검출할 수 있었다(범위, 1-184083; 중간값, 4451). CYP1A1 발현량의 분포는 Fig. 1과 같이 왼쪽으로 치우친 양상으로 Shapiro-Wilk W test 결과에서 정규분포를 따르지 않으므로 이후 모든 통계분석에서는 비모수적 통계법을 따랐다.

성능/효과

CYP1A1 유전자발현량은 환자군과 대조군에서 비교하면 Fig. 2와 같이 중간값에서 천식군이 대조 군보다 약 300배 높았다(31216 vs. 93; p = 0.002). 앞서 서술한 CYP1A1 발현, 이외 환자군과 대조군에 상관을 보인 인자, '나이'를 함께 고려하여 Table 1과 같이 Likelihood Ratio Test를 수행한 결과, CYP1A1 발현이 천식에 미치는 영향은 유의적이었으나 나이는 유의적이지 않았다.
본 연구에서는 PAHs 노출을 반영호 CYP1A1 mRNA 발현이 소아천식환자에서 대조군에 비하여 약 300배 가량 높아 천식의 병인학으로 PAH류의 노출을 제시하였다. 나아가, 본 연구결과로부터 비침해적인 조직인 말초혈유래 CYP1A1 발현은 PAHs노출지표로써 뿐만 아니라, 소아천식의 발생(발작) 및 악화의 지표로써 효용성이 제안되었다. 향후, 비침해적인 말 초혈유래 CYP1A1 발현이 기도(air way, respiratory tract) 등 천식관련조직 내 CYP1A1 발현과 일치하 는지 확인을 통하여 말초혈유래 CYP1A1 발현이 소아천식 생체지표로써 실용화가 가능할 것으로 예상된다.
본 연구결과로부터 PAHs노출을 반영하는 말초혈 유래 CYPlAl-mRNA 발현이 소아천식환자에서 대조군에 비하여 약 300배가 높아 천식의 병인학으로 PAH류의 노출을 제시하였다. 나아가, 비침 해적인 조직인 말초혈유래 CYP1A1 발현은 PAHs 노출지표로써 뿐만 아니라, 소아천식의 발생(발작) 및 악화의 지표로써 효용성이 제안되었다.
, 2005). 이상의 보고를 종합해 볼 때, 천식과 PAH류의 관련, 은 대기 중독성물질, 특히 PAH류가 천식을 유발시키고 악화시키는 기전은 주로 IgE 유도 등 면역 기구를 통한 과민반응에 기인하므로 실험적 또는 역학적 증거로부터 PAH류가 소아천식 유발 및 악화에 생물학적기전을 통하여 관여한다고 여겨진다.
전체 말초혈 시료에서 CYP1A1 발현을 검출할 수 있었다(범위, 1-184083; 중간값, 4451). CYP1A1 발현량의 분포는 Fig.

후속연구

향후, 비침해적인 말 초혈유래 CYP1A1 발현이 기도(air way, respiratory tract) 등 천식관련조직 내 CYP1A1 발현과 일치하 는지 확인을 통하여 말초혈유래 CYP1A1 발현이 소아천식 생체지표로써 실용화가 가능할 것으로 예상된다. 또한, CYP1A1 발현과 IgE발현의 상관연구 등 천식기전에 있어서 유전적 정보전달체계 (signal pathway system)에서 CYP1A1의 역할에 관한 연구가 필요하다.
나아가, 본 연구결과로부터 비침해적인 조직인 말초혈유래 CYP1A1 발현은 PAHs노출지표로써 뿐만 아니라, 소아천식의 발생(발작) 및 악화의 지표로써 효용성이 제안되었다. 향후, 비침해적인 말 초혈유래 CYP1A1 발현이 기도(air way, respiratory tract) 등 천식관련조직 내 CYP1A1 발현과 일치하 는지 확인을 통하여 말초혈유래 CYP1A1 발현이 소아천식 생체지표로써 실용화가 가능할 것으로 예상된다. 또한, CYP1A1 발현과 IgE발현의 상관연구 등 천식기전에 있어서 유전적 정보전달체계 (signal pathway system)에서 CYP1A1의 역할에 관한 연구가 필요하다.

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