선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 이에 저자는 오미자를 haxane, chloroform, ethyl-acetate, butanol 등을 이용하여 분획물을 얻어 실험한 결과, 고지방식 이에 의해 유발된 이상지질혈증에 오미자 chloroform 분획물이 비교적 강한 활성을 나타내어 오미자 chloroform 분획물을 이용하여 고지방식이로 유발된 이상지질혈증 생쥐의 지질 대사 및 간 독성에 미치는 영향을 살펴보고, DNA microarray 기법으로 간 조직 내의 유전자 발현 변화를 분석 하여 유의한 결과를 얻었기에 이를 보고하는 바이다.
- 저자는 예비 실험을 통하여 고지방 식이에 의한 생쥐의 이상지질혈증에 五味子 분획물들을 투여하여 그 활성을 확인하였으며, 이 중에도 활성도가 높았던 choloroform 분획물(SFCF)이 지질대사에 어떠한 과정을 거쳐 작용하는가를 알아보기 위하여 본 연구를 수행하였다.
가설 설정
- 1. SFCF의 투여는 생쥐의 체중 증감에 영향을 끼치지 않 았다.
제안 방법
- 3주간의 약물 투여가 끝난 후, 생쥐의 복대동맥에서 혈액을 채취하였다. 5,000×g로 20분간 원심 분리하여 상청액을 얻었으며, 이를 이용해 혈중 total cholesterol, HDL-cholesterol 및 triglyceride, aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT), glucose 수치를 측정하였다.
- 4주간의 이상지질혈증 유발 기간이 끝난 뒤, 시료 투여 시작 일에 전자저울을 이용하여 기준 체중을 측정하였으며, 이후 1주 간격으로 체중을 측정하였다. 또한 3주간 시료를 투여하면서 주 1회 사료 섭취량(g) 및 음수량(ml)을 측정하였다.
- 5 m 두께로 절제한 조직을 슬라이드 글라스 위에 올리고 H&E 기법으로 염색한 후, 광학 현미경(Carl Zeiss Inc., Oberkochen, Germany)을 이용하여 관찰하였다.
- 5,000×g로 20분간 원심 분리하여 상청액을 얻었으며, 이를 이용해 혈중 total cholesterol, HDL-cholesterol 및 triglyceride, aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT), glucose 수치를 측정하였다.
- 7주간의 실험이 끝난 후, 생쥐를 희생시키고 간 조직을적출하였다. 간 조직 대엽의 첨부를 절제하여 인산 완충액에 헹군 뒤, 4% paraformaldehyde에 24시간 고정하였으며, 이후 paraffin 포매 과정을 거쳐 조직 절편을 완성하였다.
- The pathways were presented from KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes), and the most changed pathways in expression were listed. Fisher Exact test was performed for calculating enrichment P-values, and multiple test was performed for corrections (Bonferroni, Benjamini, and FDR). Count: number of genes in set with annotation, FDR: false discovery rate, the expected proportion of the observed enrichments due to random chance.
- The most changed genes in expression were listed. Fisher exact test was performed for calculating enrichment P-values, and multiple test was performed for corrections (Bonferroni, Benjamini, and FDR).
- Microarray의 이미지 파일은 ScanArray scanner (PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA)를 이용하여 측정하였고, IMAGENE 4.0 (Bio-discovery Inc., Hawthorne, CA, USA) 프로그램을 이용하여 수치화하였다. 발현의 증가 또는 감소의 기준은 NOR군에 비해 2배 또는 0.
- NOR군에 비하여 CTL군에서 변화를 보인 유전자들의 기능적 연관성을 알아보기 위하여 gene ontology와 pathway 분석을 수행하였다.
- 각 실험동물로부터 간 조직을 적출하여 곧바로 액체 질소에 담가서 얼린 뒤 −70o C에서 보관하였으며, 이로부터 얻은 RNA를 pooling한 후 약 45,000 oligonucleotide probes가 결합된 microarray (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, USA)에 반응시키고, 3DNA array detection system (Genisphere LLC, Hatfield, PA, USA)을 이용하여 형광염색하였다.
- , Santa Clara, CA, USA)에 반응시키고, 3DNA array detection system (Genisphere LLC, Hatfield, PA, USA)을 이용하여 형광염색하였다. 간 조직에 포함되어 있는 total RNA의 quality는 Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies Inc.)를 이용하여 측정하였으며, 상기 과정을 2회 이상 반복 하여 결과의 재현성을 높이고자 하였다.
- 4주간의 이상지질혈증 유발 기간이 끝난 뒤, 시료 투여 시작 일에 전자저울을 이용하여 기준 체중을 측정하였으며, 이후 1주 간격으로 체중을 측정하였다. 또한 3주간 시료를 투여하면서 주 1회 사료 섭취량(g) 및 음수량(ml)을 측정하였다. 측정 단위는 24시간으로, 전일 오후 4시에 고형사료와 음용수를 제공하고, 다음날 오후 4시에 남은 사료와 음용수의 양을 측정하여, 그 차이를 일일 사료 섭취량 및 음수량으로 계산하였다.
- 실험에 사용된 동물의 유지 및 관리에 있어서 사료 및 음용수를 자유롭게 섭취하도록 하였으며, 식품의약품안전처의 실험동물에 관한 법률 및 시행규칙에 따라 사육실의 항온 및 항습 조건을 유지하였고(실내온도 24±2o C, 습도 55±5%), 조명의 주기도 12시간 간격으로 일정하게 수행하였다. 또한 polycarbonate cage를 사용하여 네 마리씩 분리하여 유지 관리하였다.
- 실험 5주차부터 NOR군은 일반 식이를, CTL군은 고지방식이를 공급하면서 1차 증류수를 1일 1회 구강투여하였으며, SFCF군은 고지방 식이를 계속 공급하면서 SFCF를 10 mg/kg body weight/day 농도로 경구 투여하였다. 실험에 사용한 고지방 식이는 (주)두열바이오텍(DooYeol Biotech, Seoul, Korea)에 주문 제작하여 사용하였으며, 조성은 Table 1과 같다.
- 오미자 chloroform 분획물(SFCF)이 이상지질혈증 생쥐에 미치는 영향을 확인하기 위하여 4주간 고지방식이를 통해 이상지질혈증을 유발하고, 3주간 SFCF를 투여한 다음 혈중 total cholesterol, HDL-cholesterol, triglyceride 함량 변화 및 공복 시 혈당 변화를 관찰하고, AST, ALT 검사 및 간을 적출하여 조직병리학적 이상 변화를 확인하였으며, 유전자 microarray 분석을 시행한 결과 다음과 같은 결론을 얻을 수 있었다.
- 유전자 발현 변화를 살펴보기 위해 microarray 원본 이미지를 표준화, 시각화하여 군집 분석을 실시하였다. 붉은색은 발현이 증가된 유전자를, 녹색은 발현이 감소된 유전자를 나타내었으며, 그 결과 CTL군에서 발현 변화를 보인 유전자 중 일부가 SFCF군에서는 정상 수준으로 유지됨을 관찰할 수 있었다(Fig.
- 이상지질혈증 유발을 위하여 4주간 30마리에는 고지방식이를 공급하였으며, 8마리의 정상 식이군(normal, NOR)에는 일반 사료를 공급하였다. 실험 5주차에 고지방식이군 중에서 체중을 기준으로 하여 대조군(control, CTL) 및 오미자 chloroform 분획물(Schizandrae fructus chloroform fraction, SFCF) 투여군을 각각 8마리씩 선별하였으며, 나머지 기준 체중 외의 14마리는 실험에서 탈락시켰다.
- 적출된 간 조직의 RNA를 분리하여 microarray에 반응 시킨 후 형광염색하여 원본 이미지를 얻었다. 형광 표지는 Cy3와 Cy5로 구성된 two colors system을 사용하였기 때문에 적색과 녹색 스팟으로 표현되었고, 의미 있는 변화를 보이지 않은 유전자 스팟은 노란색으로 나타났다(Fig.
- 또한 3주간 시료를 투여하면서 주 1회 사료 섭취량(g) 및 음수량(ml)을 측정하였다. 측정 단위는 24시간으로, 전일 오후 4시에 고형사료와 음용수를 제공하고, 다음날 오후 4시에 남은 사료와 음용수의 양을 측정하여, 그 차이를 일일 사료 섭취량 및 음수량으로 계산하였다.
대상 데이터
- Pathway 데이터베이스는 KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)에서 제공하는 자료를 활용하였다. 개별 pathway의 통계적 유의성은 다중비교 테스트를 이용 하여 보정되었다.
- 1). 본 연구에서는 예비 연구를 바탕으로 박층 크로마토그래피(thin layer chromatography)상 methanol 추출물과 가장 유사한 추출 및 분리 패턴을 보인 chloroform 분획물만을 사용하였으며, 이러한 과정을 거쳐 얻은 최종 추출물은 1.22 g으로 오미자 500 g에 대한 수율은 약 0.268%에 해당하였다.
- 이상지질혈증 유발을 위하여 4주간 30마리에는 고지방식이를 공급하였으며, 8마리의 정상 식이군(normal, NOR)에는 일반 사료를 공급하였다. 실험 5주차에 고지방식이군 중에서 체중을 기준으로 하여 대조군(control, CTL) 및 오미자 chloroform 분획물(Schizandrae fructus chloroform fraction, SFCF) 투여군을 각각 8마리씩 선별하였으며, 나머지 기준 체중 외의 14마리는 실험에서 탈락시켰다.
- 실험 5주차부터 NOR군은 일반 식이를, CTL군은 고지방식이를 공급하면서 1차 증류수를 1일 1회 구강투여하였으며, SFCF군은 고지방 식이를 계속 공급하면서 SFCF를 10 mg/kg body weight/day 농도로 경구 투여하였다. 실험에 사용한 고지방 식이는 (주)두열바이오텍(DooYeol Biotech, Seoul, Korea)에 주문 제작하여 사용하였으며, 조성은 Table 1과 같다.
- 오미자(Schizandrae Fructus)는 (주)화림제약(HwalimNatural Drug Co. Ltd., Busan, Korea)에서 규격품을 구입하였으며, 관능 검사를 통해 北五味子 (Schizandra chinensis)인 것을 확인한 후 정선하여 사용하였다.
- 이상지질혈증 유발을 위하여 6주령 체중 25∼30 g의 수컷 C57BL/6를 (주)샘타코 바이오 코리아(Samtako Inc., Osan, Korea)로부터 공급받아 사용하였다.
데이터처리
- Pathway 데이터베이스는 KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)에서 제공하는 자료를 활용하였다. 개별 pathway의 통계적 유의성은 다중비교 테스트를 이용 하여 보정되었다.
- 실험 성적은 평균±표준편차로 나타내었으며, 실험군 간 평균의 차이를 검정할 때에는 one way-ANOVA test를 시행하였고, P값이 0.05 미만일 때 유의한 차이가 있는 것으로 판정하였다.
이론/모형
- 이상지질혈증의 치료 지침은 2004년 개정된 NCEP (National Cholesterol Education Program) ATP III (Adult Treatment Panel III)19)에 기초하여 상당 기간 사용되었다. 이후 여러 임상연구들의 결과를 토대로 2013년 후반 미국심장학회(America College of Cardiology, ACC)와 미국심장협회(America Heart Association, AHA)에서 새로운 가이드라인을 발표하였고20), 앞으로 이상지질혈증 치료 지침에 적극 반영될 것으로 보인다.
성능/효과
- 2. SFCF는 이상지질혈증의 유발로 상승된 혈청 지질 항목 중 triglyceride와 total cholesterol 함량을 유의하게 감소시켰다.
- 3. SFCF 투여는 혈중 AST, ALT 수치 및 간 조직의 지방 분포에 영향을 끼치지 않았다.
- 3주 간의 실험 기간 동안 실험동물이 섭취한 사료 및 음용수 양의 변화를 관찰하였으며, 각 실험군 사이에 통계적으로 유의한 차이는 관찰되지 않았다(Table 2).
- 3주간 SFCF의 투여가 끝난 후에 생쥐의 혈중 triglyceride 수치 변화를 관찰한 결과, CTL군에서 121.54±17.71 mg/dl로 나타나 80.45±7.59 mg/dl를 보인 NOR군에 비해 유의한 증가를 보였고, SFCF군은 81.32±7.36 mg/dl로 나타나 CTL군에 비하여 유의한 감소를 보였다.
- 4. SFCF 투여는 이상지질혈증 유발에 의하여 발현이 변화된 간 조직 유전자 중 약 19.9%의 발현 변화를 조절하였다.
- 4주간의 고지방 식이를 통해 이상지질혈증을 유발시킨후, 3주간 시료를 투여하면서 체중의 변화를 관찰한 결과, 각 실험군 모두 체중 증가의 경향이 나타났으며, 실험군 사이에 통계적으로 유의한 차이는 관찰되지 않았다(Fig. 2).
- 5. SFCF 투여로 인한 유전자 발현 변화의 조절에는 fatty acid biosynthesis 등 지질대사와 관련된 pathway를 통한기전이 있었다.
- 7주간의 고지방 식이 후, CTL군에서 정상 식이의 NOR 군에 비하여 total cholesterol 및 triglyceride 수치가 유의 하게 상승하였으나, SFCF군은 CTL군에 비하여 해당 항목이 유의하게 감소하여 이상지질혈증에 SFCF의 투여가 유의한 효과가 있음을 보여주었다(Fig. 3, 5).
- 7주간의 실험 후에 NOR군, CTL군 및 SFCF군의 간 조직의 지방 분포에는 뚜렷한 차이를 발견할 수 없었으며 (Fig. 6), 혈중 AST 수치도 유의한 차이를 보이지 않았다(Fig. 7). 반면에 혈중 ALT를 측정한 결과, NOR군에 비해 CTL군의 경우 경도의 증가를 보였고, 그에 비해 SFCF군은 CTL군과 유의한 차이를 보이지 않았다(Fig.
- 7주후에 생쥐의 간 조직을 적출하여 관찰한 결과, 각각의 조직 샘플에서 거의 유사한 구조로 간세포가 무수히 열을 지어 분포하고 있음을 확인하였다. 간 세포판의 간격은 NOR군에 비해 CTL군에서 약간 넓었으나 정상 소견에 속 하였고, 각 실험군 모두 흰색 방울 모양의 지방축적 현상 및 기타 특이 소견을 보이지 않았다(Fig.
- CTL군에서 발현이 증가된 유전자는 cell cycle과, 감소된 유전자는 steroid 등의 지질 대사와 각각 연관되어 있었으며, KEGG pathway 분석 또한 유전자 프로파일과 유사한 패턴을 보여주었다(Table 3∼6).
- KEGG database에 기초하여 pathway 분석해본 결과도 gene ontology와 유사하게 cell cycle 및 지질대사와 연관된 pathway가 각각 상위에 랭크됨을 확인할 수 있었다(Table 5, 6).
- CTL군에서 발현이 증가된 유전자는 cell cycle과, 감소된 유전자는 steroid 등의 지질 대사와 각각 연관되어 있었으며, KEGG pathway 분석 또한 유전자 프로파일과 유사한 패턴을 보여주었다(Table 3∼6). PAPi (pathway activity profiling) 결과, CTL군에서 up-regulate된 fatty acid biosynthesis pathway가 SFCF군에서는 down-regulate되어 뚜렷한 차이를 보였으며, 그 외에 glycerolipid 및 glycerophospholipid metabolism pathway도 대조군에 비하여 up-regulate되는 정도가 감소하였다(Fig. 12).
- 10에서의 유전자 발현 프로파일과 패턴이 상당히 유사하다. SFCF 투여 후에 CTL군에서 증가된 활성이 정상 수준으로 유지되는 것을 확인할 수 있었으며, 특히 fatty acid biosynthesis, glycerolipid metabolism, glycerophospholipid metabolism 등 지질대사와 관련된 pathway가 다수 선별되었다(Fig. 12).
- 공복 시 혈당 또한 CTL군에서는 NOR군에 비하여 유의 하게 증가하였으며, SFCF의 투여로 유의하게 감소되는 결과를 보였다(Fig. 9).
- 구입한 오미자 500 g을 분쇄기로 잘게 부순 다음 실온에서 5일 동안 100% methanol에 담가서 여과액을 얻는 과정을 2회 반복하였고, 이를 동결 건조시켜 109.7 g의 건조 추출물을 얻었으며 수율은 약 21.94%였다. 이 추출물 중 100 g을 증류수에 현탁시킨 후 다시 hexane과 물을 1:1의 비율이 되도록 농도를 재조정하여 hexane층을 분리하였으며 역시 2회 반복 하여 용액을 얻었다.
- 또한 각 pathway에 포함된 유전자들의 발현도를 고려하여 분석한 결과, CTL군에서 많은 pathway가 붉은색으로 표현되었다. 이는 유전자 활성이 증가하였다는 것을 의미하는 것으로, Fig.
- 본 연구에서도 유전자 발현 변화를 살펴보고 그 기전을 확인하기 위하여 적출한 간조직의 microarray를 실시 분석하였으며, 그 결과 NOR군에 비해 CTL군에서 347개의 유전자의 발현이 증가되고, 235개의 유전자의 발현이 감소되었음을 확인하였다. 반면에 SFCF를 투여하여 그 변화된 유전자 중 각각 84개 및 32개가 정상 수준으로 발현이 유지되었다. 전체적으로 고지방 식이로 인하여 발현 변화를 보인 총 582개의 유전자 중 116개의 유전자가 SFCF의 투여로 정상 수준으로 유지하였으며, 백분율로는 약 19.
- 7). 반면에 혈중 ALT를 측정한 결과, NOR군에 비해 CTL군의 경우 경도의 증가를 보였고, 그에 비해 SFCF군은 CTL군과 유의한 차이를 보이지 않았다(Fig. 8).
- 발현이 변화한 유전자의 수를 확인한 결과, NOR군에 비해 CTL군에서 발현이 감소된 유전자가 235개, 증가된 유전자는 347개였으며, 그 중 SFCF 투여로 정상 유지된 유전자는 각각 32개 및 84개였다.
- 본 연구에서도 유전자 발현 변화를 살펴보고 그 기전을 확인하기 위하여 적출한 간조직의 microarray를 실시 분석하였으며, 그 결과 NOR군에 비해 CTL군에서 347개의 유전자의 발현이 증가되고, 235개의 유전자의 발현이 감소되었음을 확인하였다. 반면에 SFCF를 투여하여 그 변화된 유전자 중 각각 84개 및 32개가 정상 수준으로 발현이 유지되었다.
- 유전자 발현 변화를 살펴보기 위해 microarray 원본 이미지를 표준화, 시각화하여 군집 분석을 실시하였다. 붉은색은 발현이 증가된 유전자를, 녹색은 발현이 감소된 유전자를 나타내었으며, 그 결과 CTL군에서 발현 변화를 보인 유전자 중 일부가 SFCF군에서는 정상 수준으로 유지됨을 관찰할 수 있었다(Fig. 11).
- 생쥐의 혈액으로부터 ALT 수치 변화를 관찰한 결과, NOR군은 23±2.7 U/L, CTL군은 31±4.2 U/L로 나타나 두 군 사이에 유의한 차이를 확인하였다.
- 생쥐의 혈액으로부터 HDL-cholesterol 수치 변화를 관찰한 결과, NOR군 81.4±11.6 mg/dl, CTL군 79.5±5.6 mg/dl, SFCF군 76.1±10.8 mg/dl로, 각 실험군 사이에 통계적으로 유의한 차이는 나타나지 않았다(Fig. 4).
- 실험동물의 혈액으로부터 glucose 함량 변화를 관찰한 결과, CTL군에서 163.37±17.27 mg/dl로 나타나 107.13±17.10 mg/dl를 보인 NOR군에 비해 유의한 증가를 보였고, SFCF 군은 122.63±20.44 mg/dl로 나타나 CTL군에 비하여 유의한 감소를 보였다(Fig. 9).
- 실험동물의 혈중 AST 수치 변화를 관찰한 결과, NOR군에서 47.2±11.3 U/L, CTL군 56.5±13.1 U/L, SFCF군 48.7±8.0 U/L로, 각 실험군 사이에는 통계적으로 유의한 차이가 보이지 않았다(Fig. 7).
- 실험동물의 혈청 중 total cholesterol 수치 변화를 관찰한 결과, CTL군에서 205.25±13.02 mg/dl로 나타나 167.13±13.38 mg/dl를 보인 NOR군에 비해 유의하게 증가하였고, SFCF군에서는 175.32±14.10 mg/dl로 나타나 CTL군에 비하여 유의하게 감소하였다(Fig. 3).
- 실험에 사용된 동물의 유지 및 관리에 있어서 사료 및 음용수를 자유롭게 섭취하도록 하였으며, 식품의약품안전처의 실험동물에 관한 법률 및 시행규칙에 따라 사육실의 항온 및 항습 조건을 유지하였고(실내온도 24±2o C, 습도 55±5%), 조명의 주기도 12시간 간격으로 일정하게 수행하였다.
- 약물 투여가 진행되었던 3주의 실험기간 동안 각 실험군의 체중변화에는 유의한 차이가 없었으며(Fig. 2), 사료 섭취량과 음수량에 있어서도 특별한 차이를 발견할 수 없었다(Table 2). 이는 실험을 통해 유발된 이상지질혈증에 SFCF 이 식욕 억제 등의 방법으로 혈중 지질을 조절하지 않았음을 나타내는 것으로, 식사량의 감소나 식습관의 변경 없이도 이상지질혈증을 개선하는 효과가 있음을 확인할 수 있다.
- 2), 사료 섭취량과 음수량에 있어서도 특별한 차이를 발견할 수 없었다(Table 2). 이는 실험을 통해 유발된 이상지질혈증에 SFCF 이 식욕 억제 등의 방법으로 혈중 지질을 조절하지 않았음을 나타내는 것으로, 식사량의 감소나 식습관의 변경 없이도 이상지질혈증을 개선하는 효과가 있음을 확인할 수 있다.
- 이상의 연구결과를 종합할 때, SFCF는 식욕 억제 및 체중감소를 일으키지 않으면서 혈중 지질 중 total cholesterol과 triglyceride을 조절하여 이상지질혈증을 개선하는 효과가 있었으며, 여기에는 fatty acid biosynthesis 등 지질대사와 관련된 pathway를 통하여 유전자 발현을 조절하는 기전이 있음을 확인할 수 있었다.
- 반면에 SFCF를 투여하여 그 변화된 유전자 중 각각 84개 및 32개가 정상 수준으로 발현이 유지되었다. 전체적으로 고지방 식이로 인하여 발현 변화를 보인 총 582개의 유전자 중 116개의 유전자가 SFCF의 투여로 정상 수준으로 유지하였으며, 백분율로는 약 19.9%에 해당 하였다.
후속연구
- 따라서 본 결과를 토대로 하여 연구를 발전시켜 나간다면, 이상지질혈증을 개선하고 심혈관계 질환을 예방하며 치료하는 데에 오미자 chloroform 분획물을 활용할 수 있으리라 생각된다.
- 다만 HDL-cholesterol 수치가 NOR군에 비하여 통계학적 유의성은 없으나 CTL군 및 SFCF군에서 낮았으며, 이는 고지방식이로 인한 결과로 추정된다. 또한 CTL군에 비해 SFCF군이 HDL-cholesterol 수치가 오히려 더 감소하는 결과를 보였는데(Fig. 4), 이는 향후 추가적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.
- SFCF의 투여 후에 간 손상이 심해지지는 않았으나 간세포를 손상으로부터 보호하지는 못하였다. 이는 五味子의 간 보호 효과를 보여주었던 타 연구 결과26)와는 상이한 점으로, SFCF 외의 五味子 분획물을 이용한 추가적인 연구가 필요하리라 생각된다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.