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문제 정의
- Shin 등(14)은 고혈압 쥐의 혈압변 동에 마늘의 효과를 연구한 논문에서, 마늘이 고혈압 동물과 SHI/] 혈압상승을 현저하게 억제하여, 고혈압발생에 예방효과가 있는 것으로 보고한 바 있다. 따라서 본 연구에서는, 국내산 마늘과 중국산 마늘을 methanol, ethyl acetate, chioro- form, hexane의 유기용매를 사용하여 추출하고, 항균, 항고혈압 활성 및 위, 자궁암세포에 대한 암세포 성장억제 효과를 실시하여 그 기능 활성을 비교하고자 하였다.
제안 방법
- MIT assay는 인간에서 유래하는 2가지 종류의 암세포에 대한 cytotoxicity를 Carmichael 등(17)의 colorimetric MTT assay 방법을 응용하여 측정하였다. SNU-1과 HeLa 세포를 RPMI- 1640(Sigma, USA)배지에서 72시간 배양하여 SNU-1 세포는 1 X" cells/wel1의 농도로 조정하고, HeLa세포는 1X103 cells/ well으로 조정하여 실험하였다. 이와 같은 농도로 조정한 ceU 들을 96 well plate에 130jiL씩 분주하고, 8 brix의 농도로 조정한 각 마늘추출물을 20µL첨가하여, 3TC, 5% CO2 incubatoi에서 72시간 배양하였다.
- 75%)를 이에 분주하여 제조하였다. 곰팡이는 30"C에서 72-84시간 전 배양한 후, 2%의 균주를 중층용 배지(agar #75%)에 접종하고 기충용 배지(agar 1.5%)에 부어 항곰팡이 활성 시험 평판배지를 제조하였다. 위와 같이 제조된 각각의 평판배지에 올려 밀착시킨 paper disc(O 8 mm, Advantec, Toyo Roshi Kaisha, Ltd.
- E. coli, B. subtilis, S. aureus, P. aeruginosa, S. typhimurium 균주에 대해 단양, 서산, 완도 및 중국산 마늘을 methanol, ethyl acetate, chloroform 및 hexane으로 주출하여 항균활성을 확인하였다. 그 결과 E.
- MIT assay는 인간에서 유래하는 2가지 종류의 암세포에 대한 cytotoxicity를 Carmichael 등(17)의 colorimetric MTT assay 방법을 응용하여 측정하였다. SNU-1과 HeLa 세포를 RPMI- 1640(Sigma, USA)배지에서 72시간 배양하여 SNU-1 세포는 1 X" cells/wel1의 농도로 조정하고, HeLa세포는 1X103 cells/ well으로 조정하여 실험하였다.
- 단양, 서산, 완도 및 중국산 마늘을 methanol, ethyl acetate, chloroform 및 hexane용매를 사용하여 추출한 후 A. niger, M. miehei, P. rugullosum, A. oryzae, T. wesei의 5종의 fungi에 항 곰팡이 활성을 확인하였다. 그 결과 ethyl acetate추출물과 chlo- rofonn추출물에서 항곰팡이 활성이 가장 좋게 나타났으며, 곰팡이 5 균종에 따른 항 곰팡이 활성은 M.
- 이에 IN HC1 250μL를 가하여 반응을 정지시킨 후, ethyl acetate L5mL을 가해 15초 간 교반한 후 원심분리(3000 rpm/5 µl, 4℃하여 상등액 1 mL 을 얻었다, 이 상등액을 120℃에서 30분간 완전히 건조시켜 증류수 3mL을 넣은 후에 228nm에서 흡광도를 측정하여 ACE 저해활성을 측정하였다. 대조구로서는 추출물 대신 추출용매 50µL를 가해 실험하였으며, ACE저해활성효과는 다음 계산식을 이용하여 계산하였다.
- 마늘의 용매추출물에 대한 암세포 억제 효과를 살펴보기 위해 위암세포(SNU-1)와 자궁암세포(HeLa)에 대해 암세포 성장 억제효과를 MTT assay로 측정하였다. 그 결과 서산, 단양, 완도 및 중국산 마늘의 모든 용매추출물에서 위암세포가 자궁암 세포에 비해 대체적으로 높은 세포독성을 나타내었다.
- 마늘 추출물을 Whatman No 2 여과지로 여과한 후, 농축하여 -4℃ 냉동고에 보관하면서 실험에 사용하였다. 마늘의 추출수율은 RefractometertATAGO, Japan)를 이용하여 brix 수치측정으로 나타내었다.
- 완도, 단양, 서산 및 중국산 마늘의 methanol, ethyl acetate, chloroform과 hexaine추출물을 각각 ACE저해활성 측정하였다. 그 결과 마늘의 methanol추출물에서 완도 65.
- 5%)에 부어 항곰팡이 활성 시험 평판배지를 제조하였다. 위와 같이 제조된 각각의 평판배지에 올려 밀착시킨 paper disc(O 8 mm, Advantec, Toyo Roshi Kaisha, Ltd., Tokyo, Japan)에 단양, 서산, 완도, 중국산 마늘의 methanol, ethyl acetate, chloroform, hexane용매 추출물을 8brix의 농도로 조정하여 각각 20μL 첨가한 후, 세균은 37℃ incubatoH 3648시간 동안 배양하고, 곰팡이는 30℃ incubator에 72-84시간 배양하여 clear zone 직경(mm)으로 항균활성을 비교하였다.
- 이와 같은 농도로 조정한 ceU 들을 96 well plate에 130jiL씩 분주하고, 8 brix의 농도로 조정한 각 마늘추출물을 20µL첨가하여, 3TC, 5% CO2 incubatoi에서 72시간 배양하였다. 이에 5mg/ml로 제조한 MTT용액 10 μL를 첨가하여 SNU-1 세포는 4시간동안, HeLa세포는 5시간동안 각각 37℃, 5% CO2 incubator에서 발색시킨 후, PBS buffer 50)llX 20% SDS용액을 50gL씩 분주하여 20시간 동안 incu- bation시켰다. 이에 DMSO 50µL를 첨가하여 세포를 완전히 풀어준 뒤 ELISA microplate reader(Eniax, Molecular Devices, Sunnyvale, USA)> 사용하여 540nm에서 홉광도를 측정한 후, 아래 계산식을 이용하여 cytotoxicity를 확인하였다.
- 이에 5mg/ml로 제조한 MTT용액 10 μL를 첨가하여 SNU-1 세포는 4시간동안, HeLa세포는 5시간동안 각각 37℃, 5% CO2 incubator에서 발색시킨 후, PBS buffer 50)llX 20% SDS용액을 50gL씩 분주하여 20시간 동안 incu- bation시켰다. 이에 DMSO 50µL를 첨가하여 세포를 완전히 풀어준 뒤 ELISA microplate reader(Eniax, Molecular Devices, Sunnyvale, USA)> 사용하여 540nm에서 홉광도를 측정한 후, 아래 계산식을 이용하여 cytotoxicity를 확인하였다.
- 3) 5 ml에 HHL(hip- puryl-histidyl-leucine) 25 mg을 첨가하여 만든 기질 50gL를 첨가하여 3TC에서 30분간 반응시켰다. 이에 IN HC1 250μL를 가하여 반응을 정지시킨 후, ethyl acetate L5mL을 가해 15초 간 교반한 후 원심분리(3000 rpm/5 µl, 4℃하여 상등액 1 mL 을 얻었다, 이 상등액을 120℃에서 30분간 완전히 건조시켜 증류수 3mL을 넣은 후에 228nm에서 흡광도를 측정하여 ACE 저해활성을 측정하였다. 대조구로서는 추출물 대신 추출용매 50µL를 가해 실험하였으며, ACE저해활성효과는 다음 계산식을 이용하여 계산하였다.
- OAC방법(15)에 따라 수분은 105℃ 상압가열 건조법으로, 조단백질 함량은 semi-micro Kjeldahl법으 로, 회분은 550℃ 건식회화법으로 실시하였으며, 지방은 Soxthlet 으로 추출하여 측정하였다. 탄수화물은 100-(수분 + 조단백질 + 조지방 + 회분)으로 계산하였다.
- 항균 활성 검색에 사용한 세균는 slant 배지에 배양한 균주 1 백금이를 각각 취하여 각각의 lOpL의 broth 배지에 접종하고, 37℃에서 18-24시간 전 배양하여 사용하였다. 항균 활성 시험 평판배지의 조제는 각각의 생육배지를 멸균하여 기충용 배 지 (agar 1.5%)를 pettidish에 분주하여 응고시키고, 각각의 균주를 1% 접종하여 잘 혼합한 중충용 배지 (agar 0.75%)를 이에 분주하여 제조하였다. 곰팡이는 30"C에서 72-84시간 전 배양한 후, 2%의 균주를 중층용 배지(agar #75%)에 접종하고 기충용 배지(agar 1.
대상 데이터
- 3g(w/v)을 첨가하여 RPMI-1640배지 1 L를 제조하여 사용하였다. KCLB에서 분양받은 SNU-1(KCLB 00001)과 HeLa(KCLB 10002)세포는 37℃, 5% CO2 incubator에서 T-75 culture flask(BD Biosciences, Bedford, USA)에 배양하였으며, 계대배양은 세포가 충분히 배양된 것을 확인하고 일주일에 2-3회 80%이상의 배지를 교환하여 실시하였다.
- 항균활성 실험에 사용한 세균은 Escherichia coli KCTC 1682, Bacillus subtilis ATCC 14593, Staphylococcus aureus ATCC 12692, Pseudomonas aeruginosa ATCC 15522, Salmonella typhimurium ATCC 14028을 사용하였고, 항곰팡이 활성 실험에 사용한 균주는 Aspergillus niger ATCC 62751, Aspergillus oryzae ATCC 16507, Trichoderma reesei ATCC 26921, Peni- cillium rugullosum IFO 4683, Mucor miehei KFRI 이이 1 로서 한국식품연구원에서 분양받아 사용하였다. 각각의 균주들은 BHI,Tryptic soy, Malt extract 및 Potato dextrose(Difco, Maryland,USA)의 각 배지에 배양하여 실험에 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 마늘은 서산, 단양, 완도의 국내산 마늘과 중국산 마늘로서, 세척 후 세절하여 25g/100mL의 비율로 methanol, ethyl acetate, chloroform, hexane을 각각 가하여, 싱온에서 3일간 교반시키면서 추출하였다. 마늘 추출물을 Whatman No 2 여과지로 여과한 후, 농축하여 -4℃ 냉동고에 보관하면서 실험에 사용하였다. 마늘의 추출수율은 RefractometertATAGO, Japan)를 이용하여 brix 수치측정으로 나타내었다.
- 본 실험에 사용한 마늘은 서산, 단양, 완도의 국내산 마늘과 중국산 마늘로서, 세척 후 세절하여 25g/100mL의 비율로 methanol, ethyl acetate, chloroform, hexane을 각각 가하여, 싱온에서 3일간 교반시키면서 추출하였다. 마늘 추출물을 Whatman No 2 여과지로 여과한 후, 농축하여 -4℃ 냉동고에 보관하면서 실험에 사용하였다.
- 실험에 사용한 SNU-1과 HeLa 세포는 한국세포주은행(KCLB, Seoul)으로부터 분양 받아 사용하였다. 실험에 사용한 배지는 RPMI-1640(Sigma, USA)으로서 56℃ water bath에서 30분 동안 inactivation 처리한 Fetal Bovine Serum(FBS) 10%(Wv)와 항생제(1% penicillin-streptomycin) 1 %(v/v), Sodium bicarbonate 2.
- 실험에 사용한 SNU-1과 HeLa 세포는 한국세포주은행(KCLB, Seoul)으로부터 분양 받아 사용하였다. 실험에 사용한 배지는 RPMI-1640(Sigma, USA)으로서 56℃ water bath에서 30분 동안 inactivation 처리한 Fetal Bovine Serum(FBS) 10%(Wv)와 항생제(1% penicillin-streptomycin) 1 %(v/v), Sodium bicarbonate 2.0 g(w/v), HEPES 4.75 g(w/v), L-glutamine 0.3g(w/v)을 첨가하여 RPMI-1640배지 1 L를 제조하여 사용하였다. KCLB에서 분양받은 SNU-1(KCLB 00001)과 HeLa(KCLB 10002)세포는 37℃, 5% CO2 incubator에서 T-75 culture flask(BD Biosciences, Bedford, USA)에 배양하였으며, 계대배양은 세포가 충분히 배양된 것을 확인하고 일주일에 2-3회 80%이상의 배지를 교환하여 실시하였다.
- 항균활성 실험에 사용한 세균은 Escherichia coli KCTC 1682, Bacillus subtilis ATCC 14593, Staphylococcus aureus ATCC 12692, Pseudomonas aeruginosa ATCC 15522, Salmonella typhimurium ATCC 14028을 사용하였고, 항곰팡이 활성 실험에 사용한 균주는 Aspergillus niger ATCC 62751, Aspergillus oryzae ATCC 16507, Trichoderma reesei ATCC 26921, Peni- cillium rugullosum IFO 4683, Mucor miehei KFRI 이이 1 로서 한국식품연구원에서 분양받아 사용하였다. 각각의 균주들은 BHI,Tryptic soy, Malt extract 및 Potato dextrose(Difco, Maryland,USA)의 각 배지에 배양하여 실험에 사용하였다.
이론/모형
- ACE저해활성 측정은 Cushman 등(16)의 방법에 따라 측정하였다. 즉, ACE 저해활성은 0.
- 마늘의 일반성분 분석은 마늘을 세절하여 실험에 사용하였다. 일반성분 분석은 A.OAC방법(15)에 따라 수분은 105℃ 상압가열 건조법으로, 조단백질 함량은 semi-micro Kjeldahl법으 로, 회분은 550℃ 건식회화법으로 실시하였으며, 지방은 Soxthlet 으로 추출하여 측정하였다. 탄수화물은 100-(수분 + 조단백질 + 조지방 + 회분)으로 계산하였다.
성능/효과
- Chloroform 마늘 추출물은 B. subtilis균주가 완도 14mm, 단양 9 mm, 서수! 14 mm, 중국산 13 mm으로 나타났고, R aemginosa균주는 완도 15 mm, 단양 12 mm, 서산 15 mm, 중국산 16mm의 항균활성을 나타내었다. 4종류의 마늘의 항균활성을 비교해본 결과 단양 마늘의 항균활성이 가장 낮게 확인됐으며, 완도, 서산, 중국산 마늘의 항균활성은 서로 유사한 결과를 나타내었다(Table 3).
- subtilis균주가 완도 14mm, 단양 9 mm, 서수! 14 mm, 중국산 13 mm으로 나타났고, R aemginosa균주는 완도 15 mm, 단양 12 mm, 서산 15 mm, 중국산 16mm의 항균활성을 나타내었다. 4종류의 마늘의 항균활성을 비교해본 결과 단양 마늘의 항균활성이 가장 낮게 확인됐으며, 완도, 서산, 중국산 마늘의 항균활성은 서로 유사한 결과를 나타내었다(Table 3).
- Chloroform추출물에서도 단양 마늘추출물은 활성이 거의 나타나지 않았으며, 완도 마늘은 A. niger (15 mm), M. miehei (30 mm), T. reesei(20 mm)으로 높은 항곰팡이 활성을 나타내었다. 중국산 마늘주줄물은 A.
- aeruginosae 균주에서는 4가지의 마늘과 추출물에서 모두 항균활성을 나타났으며, 특히 ethyl acetate용매 와 chloroform용매의 마늘 추출물에서 높은 항균활성이 확인되었다. Ethyl acetate 추출물의 항균활성은 B. subfilis균주가 완도 13 mm, 서산 9 mm, 중국산 9 nun인데 반해, P. aentgbiosa균주는 완도 16 mm, 단양 13 mm, 서산 15 mm, 중국산 15 mm의 clear zone으로 높은 항균활성을 나타내었다. Chloroform 마늘 추출물은 B.
- Ethyl acxtal의 완도 마늘추출물이 A. niger (15 mm), M. miehei (30 mm), T. (21 mm)의 clear zone으로 가장 높은 활성을 나타내었고, 중국산 마늘은 A. niger (9 mm), M. miehei (11 mm), T. reesei(9mm)를 보였으며, 서산 마늘은 A. niger(13 mm), M. miehei(15mm), T. resei(10mm)의 활성을 나타내었다. 이에 반해 단양 마늘추출물에서는 활성이 거의 나타나지 않았다.
- 서산, 단양, 완도의 국내산 마늘과 중국산 마늘을 세척 후 세절하여 methanol, ethyl acetate, chlorofonn, hexane으로 3일간 교반, 추출하여 RefiractometerS. brix를 측정한 결과, methan아추 출물이 서산 8.4, 단양 8.8, 중국산 8.5 및 완도 8.7brix의 수치로 다른 용매추출물에 비해 높은 추출율을 나타내었다. 또한, 마늘 종류에서는 단양마늘이 서산, 완도, 중국산마늘에 비해 methanol 8.
- typhimurium 균주에 대해 단양, 서산, 완도 및 중국산 마늘을 methanol, ethyl acetate, chloroform 및 hexane으로 주출하여 항균활성을 확인하였다. 그 결과 E. coli, S. aureus, S. typhimurium균주는 4종류의 마늘과 추출물에서 항균활성을 거의 나타내지 않았다. 이에 반해 B.
- wesei의 5종의 fungi에 항 곰팡이 활성을 확인하였다. 그 결과 ethyl acetate추출물과 chlo- rofonn추출물에서 항곰팡이 활성이 가장 좋게 나타났으며, 곰팡이 5 균종에 따른 항 곰팡이 활성은 M. miehei > T. reesei > A. /liger균의 순으로 높은 활성을 나타내었다.
- 완도, 단양, 서산 및 중국산 마늘의 methanol, ethyl acetate, chloroform과 hexaine추출물을 각각 ACE저해활성 측정하였다. 그 결과 마늘의 methanol추출물에서 완도 65.6%, 단양 60.4%, 서산 55.3%, 중국산 70.1%의 ACE저해율을 나타냈으며, 이외의 ethyl acetate, chlorofbnn 및 hexane추출물에서는 24.4%이하의 ACE저해활성으로 낮게 나타났다. 마늘에는 탄수화물과 아미노산의 일종인 alliin이 있는데, 이것이 alliinase 라는 효소의 작용에 의해 allicin으로 변하여 유익한 작용이 일어나게 된다.
- 마늘의 용매추출물에 대한 암세포 억제 효과를 살펴보기 위해 위암세포(SNU-1)와 자궁암세포(HeLa)에 대해 암세포 성장 억제효과를 MTT assay로 측정하였다. 그 결과 서산, 단양, 완도 및 중국산 마늘의 모든 용매추출물에서 위암세포가 자궁암 세포에 비해 대체적으로 높은 세포독성을 나타내었다. 추출용매에 따른 암세포의 성장억제 활성을 보면 위암세포의 경우 완도, 단양, 중국산 및 서산마늘의 methanol추출물에서 완도 42.
- 47%로 나타나, 국내산 마늘이 중국산 마늘에 비해 회분, 지질, 단백질, 탄수화물이 대체적으로 높게 나타났다. 그 중 단양마늘은 수분 65.12%, 회분 2.10%, 지질 0.18%, 단백질 4.21%와 탄수화물 28.39%로 탄수화물을 제외한 다른 성분이 다른 마늘에 비해 높은 수치를 나타내었다(Table 2). 위와 같은 일반성분 결과는, 마늘의 일반성분이 수분 58.
- 80%로 나타났다. 또한 중국산 마늘은 수분 67.08%, 회분 0.48%, 지질 0.08%, 단백질 2.89%와 탄수화물 29.47%로 나타나, 국내산 마늘이 중국산 마늘에 비해 회분, 지질, 단백질, 탄수화물이 대체적으로 높게 나타났다. 그 중 단양마늘은 수분 65.
- 7brix의 수치로 다른 용매추출물에 비해 높은 추출율을 나타내었다. 또한, 마늘 종류에서는 단양마늘이 서산, 완도, 중국산마늘에 비해 methanol 8.8, ethyl acetate 8.3, chloroform 8.8 및 hexane 8.4 brix의 수치로 비교적 높은 추출율을 나타내었다(Table 1).
- 서산, 단양, 완도, 중국산 4가지의 마늘을 A.O.A.C.방법에 따라 일반성분을 분석한 결과, 완도 마늘은 수부 67.91%, 회분 1.79%, 지질 0.12%, 단백질 3.12%와 탄수화물 27.06%로 나타났으며, 서산 마늘은 수분 64.15%, 회분 1.42%, 지질 1.5%, 단백질 348%와 탄수화물 30.80%로 나타났다. 또한 중국산 마늘은 수분 67.
- 8 μg/mL의 농도에서 50%의 ACE저해율을 나타내었다. 위와 같은 연구 결과는 본 실험의 ACE저해 활성과 밀접한 관계가 있을 것으로 사료되며, 마늘의 유용한 성분에 의한 유사한 활성이 나타났다(Fig. 2).
- typhimurium균주는 4종류의 마늘과 추출물에서 항균활성을 거의 나타내지 않았다. 이에 반해 B. subtilis, P. aeruginosae 균주에서는 4가지의 마늘과 추출물에서 모두 항균활성을 나타났으며, 특히 ethyl acetate용매 와 chloroform용매의 마늘 추출물에서 높은 항균활성이 확인되었다. Ethyl acetate 추출물의 항균활성은 B.
- reesei(20 mm)으로 높은 항곰팡이 활성을 나타내었다. 중국산 마늘주줄물은 A. niger (16 mm), M. miehei (30 mm), T. reesei (18 min>t- 나타내었으며 , 서산 마늘 추출물은 A. niger (15 mm), M. miehei (25 mm), T. reesei (19 mm)^] 항곰팡이 활성으로 ethyl acetate 추출물보다 좋은 활성을 나타내었다(Table 4, Fig. 1).
- 또한 이러한 결과는 Ham 둥(25)의 연구 결과와 유사한 결과를 나타내었다. 즉, 산 마늘의 ethanol, chloroform, ethyl acetate 및 water 을 이용하여 추출한 추출물을 0.5mg/mLe 농도로 제조하여 폐 암세포(A549)에 대해 세포독성실험을 실시한 결과, 각각 74.2%, 64.7%, 50.6% 및 35.7%의 세포독성을 나타내었으며, 유방암세 포(MCF-7)에 대해서도 산 마늘의 ethanol추출물이 71.3%를 나타내었고, 위암세포(KATOiny게 대해서도 ethan아추출물이 67.4%의 암세포 성장억제 효과를 보고하였다. 이러한 결과는 마늘을 추출한 4가지의 용매에 있어서 극성도가 높은 용매에서 좋은 활성을 나타내는 본 연구 결과와 유사한 경향을 보였다.
- 그 결과 서산, 단양, 완도 및 중국산 마늘의 모든 용매추출물에서 위암세포가 자궁암 세포에 비해 대체적으로 높은 세포독성을 나타내었다. 추출용매에 따른 암세포의 성장억제 활성을 보면 위암세포의 경우 완도, 단양, 중국산 및 서산마늘의 methanol추출물에서 완도 42.3%, 단양 53.8%, 중국산 50.4% 및 서산 54.5% 의 성장억제 활성을 나타내었으며, ethyl acetate추출물에서는 완도 15.2%, 단양 35.6%, 중국산 42.7% 및 서산 35.8%로 나타났다. 또한 hexane 추출물에서는 완도 30.
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