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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 짧은 기간 제조 가능한 유산균을 이용한 발효마늘 개발을 위한 기초자료를 얻기 위하여 물리적 전처리 조건으로 증숙마늘을 제조한 후 생마늘과 증숙마늘이 체질에 미치는 면역효능에 대하여 조사하였으며 재배 산지에 따라 마늘의 유효성분의 차이가 있어 본 연구에서는 한국, 일본 및 미국에서 재배한 생마늘과 생마늘을 물리적 처리를 하여 증숙마늘을 제조한 후 이에 대한 면역활성과 항산화 효능을 비교하였다.
- 은 소양인, 태음인 그리고 소음인의 혈액에서 분리한 림프구와 대식세포에 생마늘과 흑마늘 추출물을 처리하였을때 세포 증식율을 증가시키고, TNF-α, IL-1β, IL-6 그리고 NO 생산을 증가시키므로 면역 활성을 나타내었으며, 생마늘보다 흑마늘이 면역 활성을 더 증가시킨다는 것을 보고하였다. 또한 생마늘은 체질별 면역 활성에 영향을 미쳤으나 흑마늘은 체질에 영향을 미치지 않으면서 모든 사람의 면역력을 증가시켰다고 보고하였는데 이러한 본 연구 결과와 유사하였다. Oh 등14)은 소양인, 태음인 그리고 소음인의 혈액에서 분리한 림프구와 대식세포 모델을 이용하여 생식 원료 및 제품의 체질 맞춤형 면역 활성을 탐색하였는데 체질에 따라 적합한 곡류가 존재한다는 것을 보고함으로써 식품이 체질에 영향을 미칠 수 있기 때문에 생마늘의 경우 양인보다는 소음인과 태음인에게 좋은 음식으로 체질에 따라 섭취하는 음식이 달라야 한다는 것은 본 연구 결과와 유사하였다.
제안 방법
- 마늘시료 200 g을 껍껍질/속껍질 모두 제거한 후 증류수로 세적하고 실온에서 건조하여 분쇄하였으며 121℃에서 60분간 증숙 시킨 마늘(steamed garlic)은 실온에서 냉각시켰다. 건조 생마늘과 증숙마늘을 각각 3 L 삼각플라스크에 넣고 시료 중량의 10배인 70% 에탄올을 첨가하여 24시간 shaking하면서 추출한 후 감압여과기를 사용하여 여과하였다. 다시 시료 중량의 10배인 70% 에탄올을 첨가한 후 동일한 방법으로 2차 추출을 하였고 여과 후 1차 여과액과 합하여 농축기를 사용하여 50℃에서 농축하였다.
- 대식세포로부터 NO를 측정하기 위해 griess 시약을 이용하여 세포 배양액 내 존재하는 NO의 안전 된 산화물인 NO2−를 측정하여 분석하였다.
- 0% CO2 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 대조군은 대식세포를 활성화시키는 LPS만 처리하였다.
- 림프구 세포 증식능을 측정하기 위해 1 × 105 cell/mL 농도의 세포를 96-well plate에 100 μL씩 분주한 후 시료(500μg/mL) 20 μL와 LPS(2 μg/mL)를 첨가하여 44시간 배양하였으며 대조군은 B세포 mitogen인 LPS만 처리하였다.
- 림프구는 시료의 세포 증식능 변화를 보기 위해 사용하였고, 부착된 단핵구(monocyte)는 대식세포로 활성화시켜 시료 처리 후 NO 생성능과 TNF-α 분비능 변화를 알아보기 위해 사용하였다.
- 생마늘 및 증숙마늘 에탄올 추출물의 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) 라디칼 소거활성 측정은 Kwon 등11)방법을 응용하여 일정 농도의 시료와 DPPH(1.0 × 10−3M)용액을 잘 혼합한 다음 37℃에서 30분간 반응시킨 후 517nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 소양인(Soyangin), 태음인(Taeumin) 및 소음인(Soeumin)혈액에서 분리한 림프구에 한국, 일본 및 미국에서 재배된 생마늘 또는 121℃에서 60분간 증숙시킨 증숙마늘 추출물을 처리한 후 림프구의 증식률을 알아본 결과는 Fig. 1과 같다. 한국산, 일본산 및 미국산 모두 생마늘 70% 에탄올 추출물(K-RG, J-RG 그리고 A-RG)보다 증숙마늘 70%에탄올 추출물(K-SG, J-SG 그리고 A-SG)이 유의적으로 높은 림프구 증식률을 나타내었다(Fig.
대상 데이터
- 단핵구(monocyte)는 대식세포(macrophage)로 활성화시키는 Granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GMCSF; Sigma-Aldrich Co.) 10 μL를 첨가하여 배양하였다.
- 본 연구에 사용된 면역세포는 Choi 등10)의 방법에 의해 소양인(Soyangin), 태음인(Taeumin) 그리고 소음인(Soeumin)으로부터 면역세포를 분리하여 본 연구에 사용하였다. 면역세포는 37℃와 5% CO2 조건 하에서 10% fetal bovineserum (FBS; Sigma-Aldrich Co.)이 첨가된 RPMI 1640 배지로 배양하였다. 단핵구(monocyte)는 대식세포(macrophage)로 활성화시키는 Granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GMCSF; Sigma-Aldrich Co.
- 본 실험에 사용한 한국(의성) 마늘, 일본(도쿄) 마늘 및 미국(캘리포니아) 마늘은 (주)다움푸드앤케어(Chuncheon, Korea)로부터 제공받아 사용하였다. 마늘시료 200 g을 껍껍질/속껍질 모두 제거한 후 증류수로 세적하고 실온에서 건조하여 분쇄하였으며 121℃에서 60분간 증숙 시킨 마늘(steamed garlic)은 실온에서 냉각시켰다.
- 본 연구에 사용된 면역세포는 Choi 등10)의 방법에 의해 소양인(Soyangin), 태음인(Taeumin) 그리고 소음인(Soeumin)으로부터 면역세포를 분리하여 본 연구에 사용하였다. 면역세포는 37℃와 5% CO2 조건 하에서 10% fetal bovineserum (FBS; Sigma-Aldrich Co.
데이터처리
- 본 실험 결과 통계처리는 SPSS ver 12.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하여 평균값을 분산분석(oneway ANOVA test) 후 Duncan의 다중검정법으로 P < 0.05 수준에서 유의적 차이를 검정하였다.
이론/모형
- Choi 등10)의 방법에 따라 배양 후 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT; Sigma-Aldrich Co.)용액을 DPBS에 5 mg/mL의 농도로 희석하여 20 μL씩 각 well에 첨가하여 4시간 동안 재배양 한 후 0.1 N HCl에 용해시킨 10% SDS를 100 μL 넣어주고 암실에서 12시간동안 배양하였다.
- TNF-α 생성능은 상업적 human TNF-α ELISA kit (Amersham Biosciences, Glattbrugg, Switzerland)을 사용하여 Amersham Biosciences사에서 제공한 제품 사용설명서에 따라 측정하였다.
- 시료의 NO 생성 저해 활성은 Nitrite Assay10)를 사용하여 측정하였다. 즉 배양된 세포에 배지 100 μL와 Griess reagent 시약 100 μL를 혼합하여 570 nm에서 ELISA reader (BioTek Instruments)를 사용하여 측정하였으며 배양한 후에 생성된 NO는 Griess법으로 측정하였다.
- 즉 배양된 세포에 배지 100 μL와 Griess reagent 시약 100 μL를 혼합하여 570 nm에서 ELISA reader (BioTek Instruments)를 사용하여 측정하였으며 배양한 후에 생성된 NO는 Griess법으로 측정하였다.
성능/효과
- 한국에서 재배된 생마늘이 일본산과 미국산 생마늘보다 유의적으로 더 높게 림프구 증식률을 증가시켰고, 일본산과 미국산은 유사한 효과를 나타내었다. 3개국에서 재배한 생마늘은 모두 특정체질에 높은 림프구 활성을 나타내어 체질에 영향을 미쳤다. 생마늘 추출물은 소양인(Soyangin) 보다는 음인(Taeumin과 Soeumin)에서 분리한 림프구의 증식률을 더증가시켰으며, 음인 중에도 태음인(Taeumin)보다 소음인(Soeumin)에서 분리된 림프구의 증식률을 증가시켰다(Fig.
- 2는 소양인, 태음인 및 소음인의 혈액에서 분리한 대식세포에 각 나라별로 재배한 생마늘과 증숙마늘의 70% 에탄올 추출물을 처리한 대식세포의 NO 생성능을 나타낸 결과이다. 림프구 증식능과 마찬가지로 한국산, 일본산 및 미국산 모두 생마늘 70% 에탄올 추출물보다 증숙마늘 추출물이 더 높은 NO 생성량을 나타내었다. 생마늘 추출물은 소음인 체질에 가장 높은 NO 생성능을 보였으나 증숙마늘은 체질에 관계없이 모든 체질에서 생마늘 추출물보다 높은 NO 생성능을 나타내었다.
- 생마늘 및 증숙마늘 모두 한국산이 일본산과 미국산보다 더 높은 DPPH 라디칼 소거활성을 나타내었고, 일본산과 미국산은 유사한 DPPH 라디칼 소거활성을 나타내었다. 모든 처리군은 양성 대조군으로 사용한 ascorbic acid 보다 현저히 낮은 DPPH 라디칼 소거활성을 나타내었다(Fig. 4).
- 본 연구결과, 생마늘 추출물은 소음인에서 림프구 증식능, NO 생성능, TNF-α 생성능이 가장 높았고 태음인과 소양인 순으로 나타났다. 반면에, 증숙마늘 추출물은 각 체질에 차이가 없이 모든 체질에서 생마늘 추출물에 비하여 면역활성이 높은 것으로 나타났다. 뿐만 아니라, 생마늘은 물론 증숙마늘은 나라별로 재배된 마늘의 환경상태에 따라 면역활성의 차이가 있는 것으로 나타났으며 한국산, 일본산 그리고 미국산 순으로 면역활성이 높았다.
- 반면에, 한국산, 일본산 및 미국산 모두 증숙마늘 추출물은 생마늘 추출물보다 더 높은 TNF-α 생성능을 나타내었으며 면역활성은 한국산, 일본산 그리고 미국산 순으로 높은 것으로 나타났다.
- 본 연구결과, 생마늘 추출물은 소음인에서 림프구 증식능, NO 생성능, TNF-α 생성능이 가장 높았고 태음인과 소양인 순으로 나타났다.
- 이처럼 장류식품이 특정 체질에 영향을 미치는 요인 중 하나는 주요 생리활성물질인 배당체로 존재하는 이소플라보노이드(isoflavone glycosides) 물질이 많이 존재하면 특정 체질에 영향을 미치고 효소, 물리적처리, 장내미생물 등에 의해 비배당체로 전환되면 체질에 영향을 주지 않고 면역활성을 더 증가시키는 것으로 보고되었다15). 본 연구결과에서 나타난 생마늘과 증숙마늘의 경우도, 생마늘은 배당체가 많이 존재하지만 증숙 과정에서 비배당체로 전환되어 증숙마늘 추출물이 체질에 영향을 주지 않고 면역활성을 증가시키는 것으로 판단된다.
- 반면에, 증숙마늘 추출물은 각 체질에 차이가 없이 모든 체질에서 생마늘 추출물에 비하여 면역활성이 높은 것으로 나타났다. 뿐만 아니라, 생마늘은 물론 증숙마늘은 나라별로 재배된 마늘의 환경상태에 따라 면역활성의 차이가 있는 것으로 나타났으며 한국산, 일본산 그리고 미국산 순으로 면역활성이 높았다. 이러한 면역활성의 차이는 한국산 마늘이 일본산이나 미국산 마늘보다 면역활성에 영향을 미치는 것으로 알려진 Sallyl-cysteine 성분을 더 많이 함유하고 있기 때문인 것으로 나타났다(data not shown).
- 4). 생마늘 및 증숙마늘 모두 한국산이 일본산과 미국산보다 더 높은 DPPH 라디칼 소거활성을 나타내었고, 일본산과 미국산은 유사한 DPPH 라디칼 소거활성을 나타내었다. 모든 처리군은 양성 대조군으로 사용한 ascorbic acid 보다 현저히 낮은 DPPH 라디칼 소거활성을 나타내었다(Fig.
- 림프구 증식능과 마찬가지로 한국산, 일본산 및 미국산 모두 생마늘 70% 에탄올 추출물보다 증숙마늘 추출물이 더 높은 NO 생성량을 나타내었다. 생마늘 추출물은 소음인 체질에 가장 높은 NO 생성능을 보였으나 증숙마늘은 체질에 관계없이 모든 체질에서 생마늘 추출물보다 높은 NO 생성능을 나타내었다. 생마늘은 소양인보다는 태음인과 소음인의 대식세포에 더 높은 NO 생성능을 나타내었고, 소음인이 태음인보다 더 많은 NO 생성능을 나타내었다.
- TNF-α 생성능은 림프구의 증식률 및 대식세포의 NO 생성능과 비슷한 경향을 나타내었다. 생마늘 추출물은 소음인에게 가장 높은 활성을 나타내었으며, 태음인과 소양인 순으로 나타났다. 반면에, 한국산, 일본산 및 미국산 모두 증숙마늘 추출물은 생마늘 추출물보다 더 높은 TNF-α 생성능을 나타내었으며 면역활성은 한국산, 일본산 그리고 미국산 순으로 높은 것으로 나타났다.
- 생마늘 추출물은 소음인 체질에 가장 높은 NO 생성능을 보였으나 증숙마늘은 체질에 관계없이 모든 체질에서 생마늘 추출물보다 높은 NO 생성능을 나타내었다. 생마늘은 소양인보다는 태음인과 소음인의 대식세포에 더 높은 NO 생성능을 나타내었고, 소음인이 태음인보다 더 많은 NO 생성능을 나타내었다. 증숙마늘은 한국산 마늘이 일본산 및 미국산마늘 추출물보다 더 높은 NO 생성량을 나타내었으며 일본산과 미국산 마늘의 순으로 NO 생성능을 보였다.
- 증숙마늘은 한국산 마늘이 일본산 및 미국산마늘 추출물보다 더 높은 NO 생성량을 나타내었으며 일본산과 미국산 마늘의 순으로 NO 생성능을 보였다. 이러한 결과는 림프구의 증식능에서 얻어진 결과와 유사하였으며 한국산 마늘이 일본산과 미국산에 비하여 생마늘 및 증식마늘 모두 더 높은 면역효능을 나타내었다.
- 생마늘은 소양인보다는 태음인과 소음인의 대식세포에 더 높은 NO 생성능을 나타내었고, 소음인이 태음인보다 더 많은 NO 생성능을 나타내었다. 증숙마늘은 한국산 마늘이 일본산 및 미국산마늘 추출물보다 더 높은 NO 생성량을 나타내었으며 일본산과 미국산 마늘의 순으로 NO 생성능을 보였다. 이러한 결과는 림프구의 증식능에서 얻어진 결과와 유사하였으며 한국산 마늘이 일본산과 미국산에 비하여 생마늘 및 증식마늘 모두 더 높은 면역효능을 나타내었다.
- 따라서, 생마늘은 소양인보다는 특히 소음인의 면역 활성을 증가시키기에 좋은 식품인 것으로 생각된다. 특정 체질에 영향을 미치는 생마늘과는 달리, 3국에서 재배한 생마늘을 121℃에서 60분간 처리한 증숙마늘 70% 에탄올추출물은 모두 생마늘 추출물에 비하여 유의적으로 높은 림프구 증식률을 나타내었으며, 생마늘 추출물과는 달리소양인(Soyangin), 태음인(Taeumin) 및 소음인(Soeumin) 체질에 동일한 림프구 증식능을 나타내어 체질에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다. 이러한 결과는, 백삼이 소음인에게 높은 면역활성을 나타냈지만, 백삼을 증숙 처리한 홍삼의 경우 체질에 상관없이 모든 체질에서 동일한 면역활성을 나타냈다는 보고13)와 유사한 결과를 나타내었다(Fig.
- 1과 같다. 한국산, 일본산 및 미국산 모두 생마늘 70% 에탄올 추출물(K-RG, J-RG 그리고 A-RG)보다 증숙마늘 70%에탄올 추출물(K-SG, J-SG 그리고 A-SG)이 유의적으로 높은 림프구 증식률을 나타내었다(Fig. 1). 한국에서 재배된 생마늘이 일본산과 미국산 생마늘보다 유의적으로 더 높게 림프구 증식률을 증가시켰고, 일본산과 미국산은 유사한 효과를 나타내었다.
- 4와 같다. 한국산, 일본산 및 미국산 생마늘 70%에탄올 추출물(K-RG, J-RG 그리고 A-RG)과 증숙마늘 70%에탄올 추출물(K-SG, J-SG 및 A-SG)은 모두 농도 의존적으로 DPPH 라디칼 소거활성을 나타내었고, 2 mg/mL와 4mg/mL 처리군에서는 한국, 일본 및 미국산 증숙마늘이 생마늘 보다 유의적으로 높은 DPPH 라디칼 소거활성을 나타내었다(Fig. 4). 생마늘 및 증숙마늘 모두 한국산이 일본산과 미국산보다 더 높은 DPPH 라디칼 소거활성을 나타내었고, 일본산과 미국산은 유사한 DPPH 라디칼 소거활성을 나타내었다.
- 1). 한국에서 재배된 생마늘이 일본산과 미국산 생마늘보다 유의적으로 더 높게 림프구 증식률을 증가시켰고, 일본산과 미국산은 유사한 효과를 나타내었다. 3개국에서 재배한 생마늘은 모두 특정체질에 높은 림프구 활성을 나타내어 체질에 영향을 미쳤다.
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