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문제 정의
- 진행될수록 높아졌다. 0-Glucan의 점도는 혈중 glucose의 농도를 낮추는 등 [3-glucan이 나타내는 생리활성의 주요인으로 해석되고 있을 뿐 아니라(1, 2) 식품산업에서 식감이 좋은 우수한 증점제로서의 가치도 인정받고 있으므로(15, 22, 23) 정제과정 중의 β-glucan의 점도 변화를 살펴보고자 하였다. 정제하지 않았을 때 점도는 A, B, C 및 D 분획에서 각각 6.
- 효과적으로 제거할 수 있음을 알 수 있었다. p-Glucan 정제 시 a-amylase의 이용은 이미 small laboratory scale 일 때 여러문헌에서 보고된 바 있는 바, 본 문헌에서는 산업적인 규모에서의 활용 가능성을 제안하고자 한다. 그러나 산업적인 규모에서 고순도 β-glucan 분획을 얻기 위해서는 정제공정의 반복적인 수행이나 농축공정 등의 보다 더 정교한 작업을 추가하거나 Beer 등(10)의 제안과 같이 알코올 침전법 대신 ultrafiltration 방법을 사용함으로써 전분 및 단백질의 혼입율을 낮추는 것도 고려해 볼 수 있을 것이다.
- 본 연구에서는 귀리의 β-glucan을 건강 기능성 식품소재로 개발하기 위한 연구의 일환으로 생리활성이 우수한 것으로 보고(18)된 바 있는 crude β-glucan 분획의 정제 시 특성 변화를 살펴보고자, 열에 안정한 a-amylase를 사용하여 정제하면서 β-glucan의 이화학적 특성변화를 조사한 결과를 보고하고자 한다.
제안 방법
- (3-Glucan의 추출은 전보(19>와 같은 방법으로 추출온도, 에탄올 농도 및 용매 pH를 조합한 조건 하에서 수행하였다. 본 실험에서는 15개의 분획 중 in vitro 실험 결과 항암성이 높았던 분획 (B 및 C, 18)과 혈당 저하능이 상대적으로 높았던 분획(A 및 D, not shown) 등 4개의 분획을 선정하여 정제특성을 조사하였다.
- 3 μL를 TLC plate에 점적 하였다. Acetonitrile-water(85 : 15, v/v)를 전개 용매로 3회 반복적으로 전개하였으며, 발색 시약은 에탄올에 황산 5%, a-naphtol 0.5%를 용해하여 사용하였고, 전개 후에는 건조하여 spot을 확인하였다. HPLC 분석은 TLC 분석 시와 동일하게 전 처리한 다음 수행하였다.
- 5%를 용해하여 사용하였고, 전개 후에는 건조하여 spot을 확인하였다. HPLC 분석은 TLC 분석 시와 동일하게 전 처리한 다음 수행하였다. 컬럼은 carbohy- drate(3.
- 구성당은 thin layer chromatography(TLC) 및 HPLC를 이용하여 분석하였다(22). |3-Glucan(30 mg)에 2mol/mL trifluoroacetic acid(TFA) 5 mL를 가한 다음 1211에서 1시간 동안 가수분해하고 감압농축하여 산을 제거하였다.
- 귀리 β-glucan 시료 중의 p-(l-^3):p-(1^4) 결합비는 Izydorczyk등의 방법(H)을 변형하여 분석하였다. 즉, 0-읺ucan 전체에서 유리되어 나온 glucose의 양과 P-(W3) 결합이 분해되어 생성된 glucose의 양을 구한 다음 두 양의 차이로부터 p-(1^4) 결합 분해 시 생성되는 glucose의 양을 추정하였다.
- , Denmark)을 가하고 95℃에서 1시간 동안 반응시킨 다음, 50-60℃ 정도로 냉각하고 원심분리하여 1 회 정제한 제 1 분획을 얻었다. 나머지 2개의 상등액에 다시 a-amylase(0.5 mL/100 mL)을 가하여 1회 정제 시와 동일하게 처리하여 2회 정제한 제 2 분획을 얻었으며, 마지막 분획에 a- amylase(0.5 mL/100 mL)를 한번 더 처리 하여 3회 정제분획 인 제 3 분획을 얻었다. 이후 각 추출물 제 1, 2, 3 분획의 원심분리 상등액을 Jeong 등의 방법(19)에 따라 침전분리한 다음, 95% ethanol(대한주정)을 가해 균질화하여 2회 세척하고 탈수시킨 후 80℃ 건조기에서 1-2시간 동안 건조하고 분쇄하여 β-glucan 정제 시료를 얻었다.
- 따라서 1차 흡열 곡선이 Biliaderis 등(27)이 보고한 하나의 성분이 수분의 존재없이 순전히 열에 의해서만 녹는 온도인 B-잉ucan 의 true melting point 이고 2차 흡열곡선은 β-glucan 외에 다른 미지의 성분이 나타내는 융점으로 판단되어 1차 곡선에 대하여 고찰하였다.
- 이 후에는 원심분리(2,000Xg, 10min)하여 불용성 물질을 제거하고 그 상등액 중의 일부를 취하여 점도를 측정하였다. 또, HMC(hydroxy methyl cellulose, Sigma Co., St. Louis, MO,USA)의 점도를 동일조건에서 측정하여 비교하였다.
- 및 용매 pH를 조합한 조건 하에서 수행하였다. 본 실험에서는 15개의 분획 중 in vitro 실험 결과 항암성이 높았던 분획 (B 및 C, 18)과 혈당 저하능이 상대적으로 높았던 분획(A 및 D, not shown) 등 4개의 분획을 선정하여 정제특성을 조사하였다. 각 분획의 추출조건은 A(55℃, 15%, pH 6), B(45℃, 15%, pH 6), C(50℃, 0%, pH 7) 및 D(50℃, 10%, pH 5)이었다.
- 8 X 300 mm, Waters)을 사용하였고, 오븐온도는 35, C로 유지하였으며 검출기는 RI(Waters 410 differential refractometer detecter)를 사용하였다. 시료는 1.5mg/mL의 농도로 60℃, 120rpm에서 15시간 동안 sodium nitrate(0.1 M)에 용해시킨 후 0.2 |im fHtei로 여과하고 20 μL를 주입 하였고 0.7 mL/min의 유속 하에서 0.1 M sodium nitrate를 용매로 사용하여 분석하였다.
- 시차주사열량계 (DSC 2910, TA instrument, USA)를 사용하여 귀리 0-glucan의 열적특성을 조사하였다. 이때 온도는 30℃부터 250℃까지 질소기류 하에서 lITC/min의 속도로 가열하였으며 얻어진 흡열 곡선의 면적을 계산하여 엔탈피를 구하였고 개시온도 및 피크온도를 얻었다.
- 2 &20 mL) 농도로 55-60℃ 온도에서 magnetic stirrer를 사용하여 2-3시간 동안 교반하여 용해시켰다. 이 후에는 원심분리(2,000Xg, 10min)하여 불용성 물질을 제거하고 그 상등액 중의 일부를 취하여 점도를 측정하였다. 또, HMC(hydroxy methyl cellulose, Sigma Co.
- 0-glucan의 열적특성을 조사하였다. 이때 온도는 30℃부터 250℃까지 질소기류 하에서 lITC/min의 속도로 가열하였으며 얻어진 흡열 곡선의 면적을 계산하여 엔탈피를 구하였고 개시온도 및 피크온도를 얻었다.
- 5 mL/100 mL)를 한번 더 처리 하여 3회 정제분획 인 제 3 분획을 얻었다. 이후 각 추출물 제 1, 2, 3 분획의 원심분리 상등액을 Jeong 등의 방법(19)에 따라 침전분리한 다음, 95% ethanol(대한주정)을 가해 균질화하여 2회 세척하고 탈수시킨 후 80℃ 건조기에서 1-2시간 동안 건조하고 분쇄하여 β-glucan 정제 시료를 얻었다. 각 정제 단계별로 얻은 시료의 수율은 3회 반복 측정하여 원료에 대한 건물량(%)으로 나타내었다.
- 22). 즉 온도 jacket과 소량의 시료측정용 adapter 가 부착된 점도계 (Brookfield D*, V-U Brookfield Eng. Lab., Inc., Middleboro, MA, USA)를 사용하여 측정하였다. 수용액은 1% 귀리 β-glucan(0.
- 귀리 β-glucan 시료 중의 p-(l-^3):p-(1^4) 결합비는 Izydorczyk등의 방법(H)을 변형하여 분석하였다. 즉, 0-읺ucan 전체에서 유리되어 나온 glucose의 양과 P-(W3) 결합이 분해되어 생성된 glucose의 양을 구한 다음 두 양의 차이로부터 p-(1^4) 결합 분해 시 생성되는 glucose의 양을 추정하였다. "(173) 결합 유리 glucose 함량은 β-glucan(2 mg/mL, 0.
이론/모형
- [3-Glucan의 평균 분자량은 high-performance size-exclusion chromatography(HPSEC)를 사용하여 측정하였다(11). 컬럼은 Ultrahydrogel™ mixed bed linear column(7.
- 수분 함량은 적외선 수분측정기(FD 600, Kett Electronic Lab., Japan)를 사용하여 측정하였고, β-glucan 함량은 McCleaty and Codd의 방법 (20)에 준하여 Megazyme β-glucan assay kit(Mega- zyme Pty. Ltd., Australia)를 사용하여 정량하였으며, 조단백질 함량은 Kjeldahl 법으로 측정하였고, 회분은 직접 회화법으로 측정하였다 (21).
성능/효과
- 단백질 및 회분 함량은 감소하였다. p-Glucan 함량은 정제하지 않았을 때 A, B, C 및 D 분획에서 각각 29.6, 38.3, 22.8 및 24.5% 였으며, 정제 1 단계에서 각각 83.8, 80.9, 38.1 및 70.9%로 C 분획을 제외한 모든 분획에서 급격히 증가하였다. 이 후 정제 공정이 진행될수록 증가폭은 감소하여 3 단계 정제 후에는 각각 86.
- B-Glucan의 분자량은 추출온도가 높아질수록 증가하며, 저분자량의 β-glucan 고분자량 -이ucan 보다 쉽게 추출할 수 있고 고농도의 ammonium sulfhte를 이용하여 침전할 경우 분자량이 작은 분획을 얻을 수 있다고 한다(11, 12). 본 실험에서는 추출용매인 에탄올 농도는 높고 추출온도는 낮을수록 P- glucan의 추출속도가 감소했던 보고(19>와 에탄올 농도가 높았던 분획의 ethanol 침전물이 powder 형태를 나타내는 것을 볼 때 저온 및 고농도 용매를 사용할수록 저분자 형태의 β-glucan분획을 얻을 수 있을 것으로 예상되었으나 분획간의 뚜렷한 경향은 확인할 수 없었다. 정제 단계별 평균 분자량은 2.
- 정제하지 않은 β-glucan 분획에서는 용매를 제외한 2개 또는 3개의 peak 가 검출되다가 정제가 진행될수록 peak 수가 감소하여 retention time(RT)이 짧은 앞쪽의 peak만이 검출되는 것을 볼 수 있었다. 이 결과를 정제과정 중 0-glucan의 함량이 증가하는 것과 관련지어 볼 때 RT가 짧은 peak가 β-glucan 분자량 peak로, RT가 긴 peak는 기타 성분들의 분자량 peak로 판단되었다.
- 9%로 C 분획을 제외한 모든 분획에서 급격히 증가하였다. 이 후 정제 공정이 진행될수록 증가폭은 감소하여 3 단계 정제 후에는 각각 86.0, 84.6, 81.4 및 88.2% 의 함량을 보였다. 한편。분획은 정제 단계별로 38.
- C 분획은 전분함량이 높은 분획으로 정제 전 추출물의 전분함량이 정제 속도를 늦추면서 수율을 증가시키는 것으로 알 수 있었다. 이러한 현상은 전분함량이 두 번째로 높았던 D 분획(25.5%)의 1차 정제시에β-glucan 함량이 70.9%로 다소 낮고, 수율이 2.4%로 높았던 것에서도 확인할 수 있었다.
- 이상의 결과로부터 medium laboratory 규모의 β-glucan 추출 및 정제 시에 추출물 중의 주된 혼입물인 전분 및 단백질 성분은 a-amylase 효소나 효소반응을 위한 열처리 조작에 의하여 효과적으로 제거할 수 있음을 알 수 있었다. p-Glucan 정제 시 a-amylase의 이용은 이미 small laboratory scale 일 때 여러문헌에서 보고된 바 있는 바, 본 문헌에서는 산업적인 규모에서의 활용 가능성을 제안하고자 한다.
- 이상의 결과로부터 본 정제조건에 의하여β-glucan 함량을 80%이상으로 높일 수 있고 P-(1t3)에 대한 p-(W4) 결합비는 증가하면서 평균 분자량은 점도의 큰 변화를 일으키지 않는 범위에서 감소하는 것을 확인하였다. 그러나 미세한 구조적인 변화에 대해서는 충분한 연구가 이루어지지 못하였다.
- 본 실험에서는 추출용매인 에탄올 농도는 높고 추출온도는 낮을수록 P- glucan의 추출속도가 감소했던 보고(19>와 에탄올 농도가 높았던 분획의 ethanol 침전물이 powder 형태를 나타내는 것을 볼 때 저온 및 고농도 용매를 사용할수록 저분자 형태의 β-glucan분획을 얻을 수 있을 것으로 예상되었으나 분획간의 뚜렷한 경향은 확인할 수 없었다. 정제 단계별 평균 분자량은 2.0X106- 5.1X106범위로 나타났으며, 분획간 다소 차이는 있으나 정제가 진행됨에 따라 감소하는 경향을 보였다. 이는 정제시에 분자량이 감소한다는 결과(17)와 유사하며, 점도를 감소시키지 않는 범위에서 이루어졌다.
- 정제과정 중 결합비는 A 분획이 정제전에 2.22에서 정제 단계가 높아질수록 4.68, 4.41 및 4.63으로 증가했고 B 분획은 2.52에서 4.27, 4.48 및 4.52로, C 분획은 2.48에서 2.36, 4.25 및 5.16으로 D 분획은 2.20에서 4.44, 5.54 및 5.50으로 각각 현저히 증가하였다. 이는 정제공정 중 열처리 등의 물리적인 조작에 의하며 P-(W3) 결합이 β-(1→4)결합보다 쉽게 분해됨을 나타내는 결과이며, 정제 시의 분자량이 감소한 결과와도 관련이 있는 것으로 보인다.
- 진행될수록 감소하였다. 정제하지 않았을 때 수율은 A, B C 및 D 분획에서 각각 10.2, 7.1, 17.9 및 11.9% 이었으며, 정제 1 단계에서 각각 1.6, 1.2, 6.4 및 2.4%로 감소하였으며 정제 단계가 높아질수록 계속 감소하여 3 단계 정제 후에는 각각 1.4, 1.1, 2.4 및 1.8% 로 나타났다. 분획별로는 정제 전.
- 정제하지 않았을 때 융점은 132-136℃ 범위로 개시온도(onset) 는 82-99℃ 범위로 나타났고 융점 및 개시온도 모두 C 분 획이 가장 낮았고 D 분획이 가장 높았다. 엔탈피는 139.
- 0-Glucan의 점도는 혈중 glucose의 농도를 낮추는 등 [3-glucan이 나타내는 생리활성의 주요인으로 해석되고 있을 뿐 아니라(1, 2) 식품산업에서 식감이 좋은 우수한 증점제로서의 가치도 인정받고 있으므로(15, 22, 23) 정제과정 중의 β-glucan의 점도 변화를 살펴보고자 하였다. 정제하지 않았을 때 점도는 A, B, C 및 D 분획에서 각각 6.6, 4.3, 2.2 및 13.6cP로 나타났으며, 정제될수록 A 분획은 100.3, 100.3 및 100.1 cP로, B 분획은 99.7, 99.8 및 90.0 cP로, C 분획은 60.3, 99.7 및 99.7 cP로, D분획은 100.0, 100.0 및 99.7cP로 각각 증가하면서 유사해졌다. C 분획을 제외한 모든 분획에서 1 단계 정제시 급격히 점도가 증가하여 일정한 수준을 유지한 반면, C 분획은 1 단계 정제 후에는 완만히 증가하다가 2 단계 정제 후에 급격히 증가하여 다른 처리구와 유사해졌다.
- 분석한 결과는 Table 3과 같다. 정제하지 않은 β-glucan 분획에서는 용매를 제외한 2개 또는 3개의 peak 가 검출되다가 정제가 진행될수록 peak 수가 감소하여 retention time(RT)이 짧은 앞쪽의 peak만이 검출되는 것을 볼 수 있었다. 이 결과를 정제과정 중 0-glucan의 함량이 증가하는 것과 관련지어 볼 때 RT가 짧은 peak가 β-glucan 분자량 peak로, RT가 긴 peak는 기타 성분들의 분자량 peak로 판단되었다.
- 정제하지 않은β-glucan 분획의 평균분자량은 2.8X 106-4.8X 106 범위로 A 분획이 가장 작았고 나머지 3개의 분획은 유사한 범위였으며, Wood 등(17)의 HPSEC로 분리한 후 calcoflour 검출하여 얻은 귀리겨의 β-glucan 분자량인 3X106과 유사한 결과였다. B-Glucan의 분자량은 추출온도가 높아질수록 증가하며, 저분자량의 β-glucan 고분자량 -이ucan 보다 쉽게 추출할 수 있고 고농도의 ammonium sulfhte를 이용하여 침전할 경우 분자량이 작은 분획을 얻을 수 있다고 한다(11, 12).
- C 분획을 제외한 모든 분획에서 1 단계 정제시 급격히 점도가 증가하여 일정한 수준을 유지한 반면, C 분획은 1 단계 정제 후에는 완만히 증가하다가 2 단계 정제 후에 급격히 증가하여 다른 처리구와 유사해졌다. 즉, 겉보기 점도는 β-glucan 함량이 64.2% 이상인 모든 분획에서 100±3 cP 범위에서 유사해지는 것으로 나타났다. 이와 같이 정제될수록 점도가 유사해지는 경향은 ammonium sulfate 정제 후에 추출온도가 다른 처리구간의 내부 점도 차이가 작아졌다는 보고(7)와 일치하는 결과였다.
- β-glucan 의 구성 당을 산가수분해한 다음 TLC를 이용하여 정성한 결과 정제 전 .후 모두 대부분의 당이 glucose 인 것으로 확인되었고, arabinose와 xylose는 소량으로 존재하는 것으로 나타났다. 이러한 arabinose와 xylose 등의 pentosane 귀리 세포벽에 존재하는β-glucan 이외의 주된 다당류 성분으로 귀리 추출물 중에 쉽게 혼입되는 것으로 알려져 있다.
후속연구
- 그러나 미세한 구조적인 변화에 대해서는 충분한 연구가 이루어지지 못하였다. 따라서 정제공정의 실용화를 위해서는 정제시의 DP3/DP4 비율 등 추가적인 구조 분석 및 정제도에 따른 생리활성 연구를 통하여 기초 자료를 확보하여야 할 것이다.
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