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문제 정의
- 咨⑸ 그러나 매생이에 대한 종의 분류학적 기재 및 번식, 생태 및 생활사, 분포, 형태 및 분류 등 에 관한 기초적인 연구가 있으나 박 등''이 bromobenzen으로 간독성을 유발한 흰쥐에서 지질과산화 생성을 억제한다고 보고 하였을 뿐 생리활성 등에 대한 연구는 미미한 실정이다.毋⑸ 따라서 본 연구에서는 매생이가 B16 세포의 멜라닌 합성과정에 미치는 영향을 조人卜하여 멜라닌 생성을 억제하는 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
가설 설정
- 인체 피부에서 멜라닌세포의 tyrosinase 발현을 조사한 연구 결과를 보면 흑인의 경우 tyrosinase 활성이 백인보다 6〜8배가 높지만 tyrosinase mRNA오!* protein lev이은 동일하였다." Fuller 등財)은 yohimbine0] 멜라닌세포의 tyrosinase 활성을 효 과적으로 억제하였지만, tyrosinase proein과 mRNA 발현에는 변화가 없으며, Franchi 등鴻)은 calcium D-pantetheine-S- sulfonate가 tyrosinase와 TRP-1 활성을 억제하였는데, 이는 이 스들의 glycosylation pattern 변화오卜 같은 post-transcriptional 조절에 의한 것이라고 보고하였다.
제안 방법
- 배양완료 후 0.1% MTT 용액 50 B 를 넣어 3시간, 37。(2에서 배양한 다음 상층액을 제거하고 formazan 침전물에 1W의 DMSC를 가하여 15분간 실온에서 방치한 후 540 nm의 파장에서 ELISA reader로 흡광도를 측정하여 세포 생존율을 계산하였다.
- 멜라닌 세 포의 멜라닌화를 자극하는 것으로 알려진 a-MSH 10nM을 처리하여 양성 대조군으로 하였다.I%。) 배양이 완료된 세포는 trypsin/EDTA로 분리하여 세척하고, 각 군당 5X106 세포를 수집한 후에 육안으로 세포 침전물의 색 변화를 관찰하였다.
- 멜라닌 정량은 Hosoi 등18의 방법을 변형하여 사용하였다. B16 세포를 10 cm 세포 배양 접시에 ixio5 cells/dishS 분주하고 24시간 배양하여 세포를 부착시킨 후 매생이 추출물을 10, 20, 40 卩血 농도로 처리 하고 5일 동안 배양하였다. 배양세 포를 phosphate buffered saline(PBS)으로 2회 세척하고 세포를 분리하여 각 군당 동일한 수의 세포를 수집하였다.
- B16 세포를 10 cm 세포 배양 접시에 lx 105 cells/dish로 분주하고 24시간 배양하여 세포를 부착시킨 후 매생이 추출물을 10, 20, 40 昭/m/ 농도로 처리하고 5일 동안 배양하였다. 멜라닌 세 포의 멜라닌화를 자극하는 것으로 알려진 a-MSH 10nM을 처리하여 양성 대조군으로 하였다.
- B16 세포에 매생이 추출물을 5 卩効m/에서 40 卩g/mZ까지 다양 한 농도로 처리하고, 3일과 5일 동안 배양한 후 MTT 측정 방법 2로 세포의 생존율을 관찰하였다. 3일군의 경우 5, 10, 20, 40 ng/ ml 농도에서 세포생존율은 각각 대조군의 93.
- 분리된 단백질은 Nitrocelluose membrane에 옮긴 후 실온에서 2시간 동안 blocking buffer(5% skimmilk in TBST)에서 incubation시 켰다. Tyrosinase, Tyrosinase-related protein 1 & 2 antibody(Santa Cruz Biotechnology, Inc.)는 각각 1:5002로 희석하여 2시간 동안 반응시킨 후 TBST에 3회 세척하고 1:1, 000으로 희석시킨 secondary peroxidase-conjugated anti-mouse antibody(Sigma) 에 반응된 단백질을 Amersham ECL system으로 확인하였다.
- 3). 또한 멜라닌 합성 억제효과를 육안으로 확인하기 위하여 각 군당 5X 1()6개의 세포를 수집하여 관찰하였다. 매생이 처리군은 연한 회색으로 대조군보다 멜라닌 색소가 감소하였고, 특히 40ng/m/ 농 도에서 현저히 감소하였다.
- B16 세포를 10 cm 세포 배양 접시에 lx 105 cells/dish로 분주하고 24시간 배양하여 세포를 부착시킨 후 매생이 추출물을 10, 20, 40 昭/m/ 농도로 처리하고 5일 동안 배양하였다. 멜라닌 세 포의 멜라닌화를 자극하는 것으로 알려진 a-MSH 10nM을 처리하여 양성 대조군으로 하였다.I%。) 배양이 완료된 세포는 trypsin/EDTA로 분리하여 세척하고, 각 군당 5X106 세포를 수집한 후에 육안으로 세포 침전물의 색 변화를 관찰하였다.
- B16 세포를 10 cm 세포 배양 접시에 ixio5 cells/dishS 분주하고 24시간 배양하여 세포를 부착시킨 후 매생이 추출물을 10, 20, 40 卩血 농도로 처리 하고 5일 동안 배양하였다. 배양세 포를 phosphate buffered saline(PBS)으로 2회 세척하고 세포를 분리하여 각 군당 동일한 수의 세포를 수집하였다. 세포침전물에 1 ml 의 증류수를 넣어 현탁하고, 초음파로 분쇄한 다음, 원심분리하여 침전물을 얻었다.
- 한국 세포주 은행에서 분양 받은 B16 세포의 배양은 C02 배양기 (37°C, 5%)에서 10% FBS가 포함된 DMEM 배지를 이용하였고, ImM glutamine, 500U penicillin3]- 20卩以m/ streptomycin 을 첨가하여 사용하였으며, 약 48시간 주기로 배양액을 교체하여 주었다. 세포의 형태는 배양완료 후 Inverted Microscope (phase contrast, Leica, Germany)를 이용하여 관찰하였다.
- 본 실험에 사용한 (Capsosiphon fulvescence^ 전라남도 장흥, 내저마을에서 채취하였고, 증류수로 수회 세척하여 염분을 제거하였다. 염분을 제거한 매생이 2 kg에 95% EtOH 10 Z를 첨가하여 3일 동안 침지추출하였고, 추출액을 여과한 후 여액을 감압농축한 다음 동결 건조하여 매생이 EtOH 추출물 590 g(수 득률 : 29.5%)을 얻었다. 試料는 10 mg/m/ 농도로 Ethanol: 1, 3- buthyleneglycol(4 :1) 용매에 녹인 후 실험에 사용하였다.
- 1 mM PMSF)을 넣고 4°C 얼음에서 30분간 때询로 흔들어주 면서 세포를 파괴하였다. 이를 원심분리하고 50 pi의 상층액에 100 mM sodium phosphate(pH 6.8) 100 p/를 넣고 30°C 물중탕 기에서 5분간 보온한 후 100 mM catechol 50 B를 넣어 온도조 절장치가 있는 분광광도계로 37°C, 405 nM에서 흡광도의 변화 를 1시간 관찰하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용한 (Capsosiphon fulvescence^ 전라남도 장흥, 내저마을에서 채취하였고, 증류수로 수회 세척하여 염분을 제거하였다. 염분을 제거한 매생이 2 kg에 95% EtOH 10 Z를 첨가하여 3일 동안 침지추출하였고, 추출액을 여과한 후 여액을 감압농축한 다음 동결 건조하여 매생이 EtOH 추출물 590 g(수 득률 : 29.
- 한국 세포주 은행에서 분양 받은 B16 세포의 배양은 C02 배양기 (37°C, 5%)에서 10% FBS가 포함된 DMEM 배지를 이용하였고, ImM glutamine, 500U penicillin3]- 20卩以m/ streptomycin 을 첨가하여 사용하였으며, 약 48시간 주기로 배양액을 교체하여 주었다. 세포의 형태는 배양완료 후 Inverted Microscope (phase contrast, Leica, Germany)를 이용하여 관찰하였다.
데이터처리
- 실험 결과는 one-way ANOVA test를 이용하였으며, P 값이 0.05 이하인 경우 유의성을 인정하였다.
이론/모형
- Tyrosinase 활성은 Martinez-Esparza 등幻)의 방법에 의하여 즉정하였다. B16 세포에 5일 동안 매생이 추출물을 10, 20, 40 卩g/ ml 농도로 처리한 후 세포를 분리하였다.
- 세포생존율 측정은 Mosmann의 방법”)에 의하여 실시하였다. 24 well plate에 B16 세포를 1X104 cell 분주하여 24시간 배양한 후 매생이 추출물을 5, 10, 20, 40 ng/m/ 농도로 처리하고 3 일 또는 5일간 배양하였다.
성능/효과
- 이러한 생존율의 감소 현상이 단순한 세포의 사멸이나 손상에 의한 것인지 조사하기 위하여 매생이 추출물을 각 농도별로 처리하고 5일 후 세포의 상태를 관찰한 결과, 매생이 10 jig/血오!" 20ng/m/ 농도에서 세포의 형태적 특성이 대조군과 동일하였다 (Fig. 2B & C). 매생이 40 昭/m/ 농도에서는 세포의 수가 감소 하였으나 세포질 내의 공포(cytoplasmic vacuoles), 핵 응축 (nucleus shrinkage)과 같은 세포고사(apoptosis)나 괴사(necrosis) 현상은 관찰되지 않았으며, 세포의 형태적 특성 또한 대조군과 동일하였다(Fig.
- 지금까지 알려진 멜라닌 생성 억제 물질로는 kojic acid, arbutin, hydroquinone 등이 있으며, hydroquinone은 효능이 탁월하지만 세포독성이 강하여 잠재적인 돌연변이원이 될 수 있다고 보고&22)되고 있어, 천연물에서 세포독성이 적으면서 멜라닌 합성을 감소시키는 부작용이 적은 물질을 찾는 방향으로 연구가 진행되고 있다. 따라서 본 실험 결과 매생이 추출물은 세포독성이 없이 매우 안정적으로 멜라닌생성을 억제하는 것으로 사료된다.
- 매생이가 멜라닌 생성에 미치는 영힝을 조사하기 위하여 세포 증식, 멜라닌, tyrosinase 활성과 단백질 발현을 조사한 결과, 매생이 추출물은 B16 세포의 증식을 억제하였으나, 세포 내의 공 포 (cytoplasmic vacuoles)나 핵 응죽 (nucleus shrinkage) 등의 세포독성은 나타내지 않았다. 또한 매생이 추출물은 B16 세포의 멜라닌 합성을 억제하였고, 세포 내 tyrosinase 활성고} tyrosinase 단백질 발현을 억제하였다. 이상의 결과 매생이 추출물은 세포 독성이 없이 세포의 증식과 tyrosinase 활성을 억제함으로서 결과적으로 멜라닌의 생성을 감소시킨 것 。昱 판단된다.
- 또한 멜라닌 합성 억제효과를 육안으로 확인하기 위하여 각 군당 5X 1()6개의 세포를 수집하여 관찰하였다. 매생이 처리군은 연한 회색으로 대조군보다 멜라닌 색소가 감소하였고, 특히 40ng/m/ 농 도에서 현저히 감소하였다. 대조군으로서 멜라닌 생성을 촉진시키는 호르몬인 a-MSHi9, 2。)를 처리한 세포군은 검정색으로 멜라닌이 증가되었음을 확인하였다(Fig.
- 매생이 추출물을 여러 가지 농도로 B16 세포에 처리하고 5일 동안 배양한 후 각 군당 IX 1()6개의 세포를 수집하여 멜라닌의 양을 측정한 결과, 10, 20, 40|ig/m/ 농도에서 대조군(100%)에 비하여 각각 89.4%, 71.1%, 63.6%로 감소하였다(Fig. 3). 또한 멜라닌 합성 억제효과를 육안으로 확인하기 위하여 각 군당 5X 1()6개의 세포를 수집하여 관찰하였다.
- 매생이가 멜라닌 생성에 미치는 영힝을 조사하기 위하여 세포 증식, 멜라닌, tyrosinase 활성과 단백질 발현을 조사한 결과, 매생이 추출물은 B16 세포의 증식을 억제하였으나, 세포 내의 공 포 (cytoplasmic vacuoles)나 핵 응죽 (nucleus shrinkage) 등의 세포독성은 나타내지 않았다. 또한 매생이 추출물은 B16 세포의 멜라닌 합성을 억제하였고, 세포 내 tyrosinase 활성고} tyrosinase 단백질 발현을 억제하였다.
- 이상의 결과 매생이 추출물의 처리농도가 증가함에 따라 세포 의 증식이 억제되었으나 세포 내에 공포와 핵 응축 등의 세포독성은 나타나지 않았다(Fig. 1 & 2).
후속연구
- 이상의 결과 매생이 추출물은 세포 독성이 없이 세포의 증식과 tyrosinase 활성을 억제함으로서 결과적으로 멜라닌의 생성을 감소시킨 것 。昱 판단된다. 따라서 매생이는 피부 부작용이 없는 화장품의 미백물질로서 개발 가능성이 높으며 , 더욱 정확한 작용기전의 규명과 활성성분의 분리 및 정저], 응용법 등의 연구가 필요할 것2로 사료된다.
- 본 실험 결과에서는 매생이 추줄 물은 B16 세포의 tyrosinase 활성과 protein level을 억제함으로써 결과적으로 멜라닌의 생성을 감소시킨 것으로 사료되며 , 보다 정확한 멜라닌 생성 조절기 전을 조사할 필요가 있다고 사료된다.
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