RAW 264.7 대식세포에서 NO, TNF-α, IL-6 생산에 관한 Squalene, Alkoxy Glycerol, Batyl, Chimyl의 효과 Production of NO, TNF-α and IL-6 by Squalene, Alkoxy Glycerol, Batyl and Chimyl Solutions in RAW 264.7 Macrophage Cells원문보기
본 연구에서는 대식세포인 RAW 264.7 세포주에 SQ ($0.1{\%}$), AG($0.1{\%}$), Batyl(1 mg/mL), Chimyl(1 mg/mL) 용액 등을 단독 혹은 C. albicans와 함께 첨가하여 배양한 후LDH, NO, TNF-$\alpha$, IL-6 발현에 어떤 영향을 주는 지를 관찰하였다. 모든 실험군에서 실험에 사용한 농도는 LDH, NO생산에 영향을 주지 못하였다. 실험에 사용한 용액을 단독 처리한 실험의 경우 TNF-$\alpha$와 IL-6발현의 경우 6시간째에는 큰 차이를 나타내지는 못하였으나, 24시간째에는 발현에 영향을 주었다(p < 0.05). C. albicans을 함께 처리한 실험의 경우에는 C. albicans단독 처리군에 비해 실험 용액을 함께 처리한 군에서 C. albicans유도 TNF-$\alpha$와 IL-6발현을 감소시키는 효과를 관찰하였다(p < 0.05, p < 0.01). 본 연구를 통해 SQ, AG, Batyl, Chimyl 용액이 C. albicans 유도에 의해 감소된 면역반응을 증가시킬 수 있을 것으로 생각되어진다.
본 연구에서는 대식세포인 RAW 264.7 세포주에 SQ ($0.1{\%}$), AG($0.1{\%}$), Batyl(1 mg/mL), Chimyl(1 mg/mL) 용액 등을 단독 혹은 C. albicans와 함께 첨가하여 배양한 후LDH, NO, TNF-$\alpha$, IL-6 발현에 어떤 영향을 주는 지를 관찰하였다. 모든 실험군에서 실험에 사용한 농도는 LDH, NO생산에 영향을 주지 못하였다. 실험에 사용한 용액을 단독 처리한 실험의 경우 TNF-$\alpha$와 IL-6발현의 경우 6시간째에는 큰 차이를 나타내지는 못하였으나, 24시간째에는 발현에 영향을 주었다(p < 0.05). C. albicans을 함께 처리한 실험의 경우에는 C. albicans단독 처리군에 비해 실험 용액을 함께 처리한 군에서 C. albicans유도 TNF-$\alpha$와 IL-6발현을 감소시키는 효과를 관찰하였다(p < 0.05, p < 0.01). 본 연구를 통해 SQ, AG, Batyl, Chimyl 용액이 C. albicans 유도에 의해 감소된 면역반응을 증가시킬 수 있을 것으로 생각되어진다.
The purpose of the present study was to evaluate the effect of Squalene, Alkoxy Glycerol, Batyl and Chimyl solutions on the production of nitric oxide (NO), tumor necrosis factor-alpha (TNF- $\alpha$ ) and interleukin-6 (IL-6) in RAW 264.7 macrophage cells after treatment of C.albicans. T...
The purpose of the present study was to evaluate the effect of Squalene, Alkoxy Glycerol, Batyl and Chimyl solutions on the production of nitric oxide (NO), tumor necrosis factor-alpha (TNF- $\alpha$ ) and interleukin-6 (IL-6) in RAW 264.7 macrophage cells after treatment of C.albicans. The cytotoxic effects was evaluated by the lactate dehydrogenase (LDH). All solutions did not affect on the LDH and NO production by itself. At 6th hour, the TNF- $\alpha$ and IL-6 production was not affected by each solutions. However, at 24th hour, the TNF- $\alpha$ and IL-6 production was affected by itself (p < 0.05). Each solution in the presence of C. albicans decreased the C. albicans-induced TNF- $\alpha$ and IL-6 production compared with C. albicans only (p < 0.05, p < 0.01). These results suggest that Squalene, Alkoxy Glycerol, Batyl and Chimyl solutions will increase the immune response on the C. albicans-induced damage.
The purpose of the present study was to evaluate the effect of Squalene, Alkoxy Glycerol, Batyl and Chimyl solutions on the production of nitric oxide (NO), tumor necrosis factor-alpha (TNF- $\alpha$ ) and interleukin-6 (IL-6) in RAW 264.7 macrophage cells after treatment of C.albicans. The cytotoxic effects was evaluated by the lactate dehydrogenase (LDH). All solutions did not affect on the LDH and NO production by itself. At 6th hour, the TNF- $\alpha$ and IL-6 production was not affected by each solutions. However, at 24th hour, the TNF- $\alpha$ and IL-6 production was affected by itself (p < 0.05). Each solution in the presence of C. albicans decreased the C. albicans-induced TNF- $\alpha$ and IL-6 production compared with C. albicans only (p < 0.05, p < 0.01). These results suggest that Squalene, Alkoxy Glycerol, Batyl and Chimyl solutions will increase the immune response on the C. albicans-induced damage.
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문제 정의
있으면서 숙주 세포의 항상성 변화, 신경결핍, 외상, AIDS, 백혈병, 백혈구결핍 등의 증상을 유발시 킨다(32-36). 본 연구에서는 C.albicans에 의해 유도된 급성 염증 반응 시 유도 되는 사이 토카인의 발현 에 관한 SQ와 AG의 효과를 관찰하고자 하였다.
제안 방법
RAW 264.7세포에 SQ, AG 및 AG의 주요 성 분인 Batyl, Chimyl 용액을 세포배양액에 첨가. 배양한 후, LDH를 관찰한 결과, 배양액만 단독으로 처리한 정상군에 비해 실험에 관련된 용액을 함께 처치한 군의 경우 차이를 보이지 않았으나, C.
RAW 264.7 세포주로부터 생성된 LDH 활성을 측정하여 정량화 하였다. 실험방법은 Supernatant 100 11L를 취해서 96-well microplate에 분주하였다.
RAW 264.7 세포주로부터 생성된 NO의 양은 세포 배양액 중에 존재하는 NO「의 형 태 로서 Griess 시 약을 이 용하여 측정 하였다. 상층액을 96 well plate에 각각 분주한 후 Griess reagent(0.
albicans를 처리한 후, :QI%.alkoxy glycerol를 동시에 처리한 군, 실험군 4는 RAW 264.7 세포주에 C.albicans 를 처리 한 후, Bathy 용액 (1 mg/mL)를 동시에 처리 한 군, 실험군 5는 RAW 264.7 세포주에 C.albicans를 처리한 후, Chimyl 용액(1 mg/mL)을 동시에 처리한 군 등으로 각각의 실험군별로 12 well plate에 6, 24시간 배 양한 후 각각을 측정하였다.
단백질 농도는 Bicincchoninic acid protein assay kit(이하, BCA, USA)를 이용하여 분석하였다. 소혈청 알부민(BCA) 을 표준물질로 사용하여 각각의 단백 시료 25 J1L를 96 well plate에 분주하고 시 약 A와 시 약 B(50: 1)로 구성된 BCA 약물(200 UL)을 각각 첨가한 후, 37℃에서 1시간 동안 배양하였다.
4%) 에 비해 적게 유리되었다(4~9%)고 보고하였다. 본 연구에서 는 RAW 264.7 세 포주에 SQ(0.1%), AG(0.1%) 그리고 AG 의 주요 성분인 BatyKl mg/mL), ChimyKl mg/mL) 용액을 6, 24시간 동안 각각 처리 하여 배 양한 후, LDH를 관찰하였는데, 각 실험에 사용한 용액이 정상군에 비해 오차 범위안에 들어 있기 때문에 독성이 없는 것으로 생각되어진다 (Fig. 1). 그러나, C.
7 세포주에 LPS(1 UgZL) 유도염 증 반응을 유발시 킨 후, 오가피 (1~ 100 Jig/mL)를 첨 가하여 배양한 후 NO 생성량을 관찰한 결과 10, 100 Rg/mL을 첨가해 준 군에서 NO 생성량이 감소하였다고 보고하였다. 본 연구에서는 CW况cms(3x iWmL)을 RAW 264.7 세포주에 첨가하여 NO를 관찰하였는데 , C.albicans 처 리군에 대 해 SQ(0.1%), AG(0.1%) 그리고 AG의 주요 성분인 Batyl(1 mg/mL), Chimyl(1 mg/mL) 용액이 큰 차이를 보이지 않아본 실험에 사용한 농도가 NO 생성과는 관련이 없는 것으로 보여 NO 관련 추후 실험의 경우 농도가 중요할 것으로 생각된다(Fig. 2 참조).
본 연구에서는 대식세포인 RAW 264.7 세포주에 SQ (0.1%), AG(0.1%), Batyld mg/mL), Chimyld mg/mL) 용액 등을 단독 혹은 C.albicans와 함께 첨가하여 배양한 후 LDH, NO, TNF-a, IL-6 발현에 어떤 영향을 주는 지를 관찰하였다. 모든 실험군에서 실험에 사용한 농도는 LDH, NO 생산에 영향을 주지 못하였다.
7 세포주에 SQ, AG, Batyl, Chimyl 용액 단독 처리 시 LDH, NO, TNF- a , IL-6 발현 효과 : 실험군은 다음과 같다. 실험군 1은 RAW 264.7 세포주(5x 104/mL) 단독 배양한 군, 실험군 2는 RAW 264.7 세포주에 0.1% SQ를 처리한 군, 실험군 3은 RAW 264.7 세포주에 0.1% alkoxy glycerol를 처리한 구 실험군 4는 RAW 264.7 세포주에 Batyl 용액(1 mg/mL)을 처리한 군, 실험군 5는 RAW 264.7 세포주에 Chimyl 용액(1 mg/mL)을 처리한 군 등으로 각각의 실험 군 별로 12 well plate에 6, 24시간 배 양한 후 각각을 측정하였다.
이bicans을 처리한 후, SQ, AG, Batyl, Chimyl 용액 을 동시에 처리 한 경우 TNF- a , IL-6 발현 효과 : 실험군은 다음과 같다. 실험군 1은 RAW 264.7 세포주(5xl04/mL)에 Ga卽ams(3x 10%丄)를 처리해 배 양한 군, 실험 군 2는 RAW 264.7 세 포주에 C.albicanse: 처 리한 毛 0.1% SQ를 동시에 처리한 군, 실험군 3은 RAW 264.7 세포주에 C.albicans를 처리한 후, :QI%.alkoxy glycerol를 동시에 처리한 군, 실험군 4는 RAW 264.
대상 데이터
Candida albicanseC.albicans) NIH A-207는 임 선 영 교수 (전남대학교, 광주)로부터 공급받아 사용하였다. Calbicans 는 Sabouraud dextrose broth(BBL Microbiology Systems, Cockeysville, MD)에서 교반을 하면서 28℃에서 배양하였다.
DMEM(WelGENE Inc, KOREA), FBS(Wel GENE Inc, KOREA), LDH 측정 kit는 Roche사(U.S.A), Antibody는 Santa Cruz(U.S.A), TNF- a, IL-6에 대한 단클론항체 (mo~ noclonal antibody)의 ELISA kits(R&D systems, MIN, U.S.A)를 사용하였다.
Murine macrophage cell line인 RAW 264.7세포주는 한국세포주은행 (KCLB, KOREA)에서 구입 하였으며, Dulbecco's modified Eagle's medium(°] 하, DMEM이 라 함, Wei GENE Inc, KOREA)에 10% fetal bovine serum(이하, FBS라 함, Wei GENE Inc, KOREA), 100 g/mL penicillin, 100 Ug/mL streptomycin을 혼합한 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 배 양하였다.
15분간 실온에서 방치한 후, 540 nm 파장에서 microplate reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 nitrite 농도를 측정하였다. Sodium nitrate(0.5~100 M)를 nitrite 표준으로 이용하였다.
BCA, USA)를 이용하여 분석하였다. 소혈청 알부민(BCA) 을 표준물질로 사용하여 각각의 단백 시료 25 J1L를 96 well plate에 분주하고 시 약 A와 시 약 B(50: 1)로 구성된 BCA 약물(200 UL)을 각각 첨가한 후, 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 배양 후, microplate reader(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 540 mm에서 흡광도를 측정하였다.
데이터처리
The results are expressed the mean ± SD (n=10) in the triplicate experiment. Statistically significant value compared with normal data by ANOVA test (*p<0.05).
The results are expressed the mean ± SD (n=10) in the triplicate experiment. Statistically significant value compared with normal group data by ANOVA test (*p<0.05).
The results are expressed the mean ± SD (n=10) in the triplicate experiment. Statistically significant value compared with only treated with C.albicans group data by ANOVA test (*p<0.05, **p<0.01).
각 실험군 별 통계학적 유의성은 개 인용 컴퓨터 프로그램인 SAS를 이용한 ANOVA test에 의하여 검정 하였으며, 각 p값은 0.05 미만의 것을 유의한 수준으로 고려하였다.
이론/모형
TNF- a, IL-6 등의 사이 토카인 측정 방법은 manufacturers instruction에 따랐다. 먼저, 50 11L 분석 희석 액(assay diluent)을 제공된 well에 각각 넣고, 각 사이토카인에 대한표준액 (standard solution)과 실험 액을 각각 50 "L씩 well의 중심부에 첨가하여 잘 섞이도록 plate를 가볍 게 바닥에 두들긴 다음 제공된 밀폐용 테이프로 덮어 2시간 동안 실온에서 반응시켰다.
성능/효과
05). C.albicans을 함께 처리한 실험의 경우에는 C.albicans 단독 처리군에 비해 실험 용액을 함께 처리한 군에서 C.albicans 유도 TNF-a와 IL-6 발현을 감소시키는 효과를 관찰하였다(p<0.05, p<0.01). 본 연구를 통해 SQ, AG, Batyl, Chimyl 용액 이 C.
배양한 후, NO, TNF- 叫, 1!厂6의 발현량을 배양 6, 24시간 후에 각각 관찰하였다. NO의 경우 6, 24시간 배양 후 정상군에 비해서는 약간의 증가 경향을 보였으나, C.albicans의 단독 처리군에 비해 거의 차이를 나타내지 않아 이들 물질이 NO 생산에는 효과가 없는 것으로 관찰되었다(Fig. 2). TNF-a의 경우 배양 6시간째 군에서는 발현량에 특별한 변화가 없었으나, 24시간째 군에서 는 Batyl, Chimyl 용액을 첨가한 군에서 정상군에 비해 발현량이 증가하는 경향을 보여 두 용액 이 TNF- a 발현에 영향을 주는 것으로 보인다(Fig.
TNF- « 발현량 변화에 관한 실험의 경우 C.albicans을세포에 단독 처리한 군의 경우 TNF- a 발현량이 6, 24시간 모두 급격히 증가하는 경향을 보였다. 그러나, 6시 간째 군에서 는 SQ, AG, Batyl, Chimyl 등 각각의 용액 을 C.
albicans을세포에 단독 처리한 군의 경우 TNF- a 발현량이 6, 24시간 모두 급격히 증가하는 경향을 보였다. 그러나, 6시 간째 군에서 는 SQ, AG, Batyl, Chimyl 등 각각의 용액 을 C.albicans와 함께 처리한 군은 C.albicans 단독 처리군에 비해 발현량을 현저 히 감소시 켰고(Fig. 5), 24시 간째 군에서는 Batyl, Chimyl 용액만 발현량을 감소시키는 것을 관찰할 수 있었다(Fig. 5). IL-6 발현량 변화에 관한 실험의 경우 C.
1). 그러나, C.albicans 단독처리 군의 경우는 LDH가크게 증가한 것을 관찰할 수 있어 세포 독성을 유발한다는 것을 관찰할 수 있었다(Fig. 1 참조).
albicans을 세포에 단독 처리한 군과 SQ, AG, Batyl 등의 물질을 함께 첨가 . 배양한 후, 6시간째 경과 군에서는 큰 차이를 관찰할 수 없었으나, 통계학적 으로 유의 성을 가지고 있는 것은 Chimyl 용액을 함께 처리한 군이고(Fig. 6), 24시간째 군에서는 모든 실험군에서 C.albicans을 세포에 단독 처리한 군에 비해 통계학적으로 유의한 감소 효과를 관찰할 수 있었다(Fig. 6). Sung 등(37)은 홍삼 및 백삼 사포닌(50~500 Rg/mL)을각각 일차배양 교세포(이ial cells)에 첨가한 후, 세포 독성을 관찰을 위해 LDH를 측정한 결과 홍삼 사포닌 50-100 Ug/ mL, 백삼사포닌 50~ 200pg/mL에서 LDH가 대조군(10.
7세포에 SQ, AG 및 AG의 주요 성 분인 Batyl, Chimyl 용액을 세포배양액에 첨가. 배양한 후, LDH를 관찰한 결과, 배양액만 단독으로 처리한 정상군에 비해 실험에 관련된 용액을 함께 처치한 군의 경우 차이를 보이지 않았으나, C.albicans을 세포에 처리한 군은 높은 LDH 생산이 관찰되었다 (Fig. 1).
- 1P, NO의 경우는 유의하게 감소시키는 효과가 있었으나, IL-6 분비에는 효과가 없다고 보고하였다. 본 실험에서는 C.albicans로 유도된 TNF- a , IL-6 등이 배 양 시간에 따라 생성 되는 경향이 달랐으며, 실험에 사용한 각각의 용액 등은 C.albicans로 유도된 TNF- a, IL-6 생성 을 유의 하게 감소시키는 효과를 관찰할 수 있었다(p<0.05).
본 연구를 통해서 SQ, AG, Batyl, Chimyl 용액 등이 C.albicans 유도로 증가된 TNF- «, IL-6와 같은 사이 토카인의 조절에 영향을 주는 것을 알 수 있었다.
pneumoniae 항원이나 B-16 흑색종세포로 자극 시 증가하는 경향을 보인다(40). 본 연구에서 는 C.albicans(, 3 x 10’/mL)을 RAW 264.7 세 포주에 단독으로 첨가하여 배 양한 결과 TNF- a, IL-6 발현 이 다량 증가하는 경향을 관찰할 수 있었다(Fig. 5, 6 참조).
TNF- a 의 양적 증가를 유발시 킨다고 보고하였다. 본 연구에서는 SQ, AG, Batyl, Chimyl 용액을 대식세포(RAW 264.7) 에 첨가한 후 6, 24시간 동안 배 양한 결과 6시 간째 에 는 별다른 차이가 관찰되지 않았지만, 24시간째에 Batyl, Chimyl 용액 이 TNF- a 의 발현을 증가하는 것으로 보아 실험 용액 단독 처리의 경우에도 TNF- a 발현에 영향을 주는 것을 관찰할 수 있었다(p<0.05, Fig. 3 참조).
모든 실험군에서 실험에 사용한 농도는 LDH, NO 생산에 영향을 주지 못하였다. 실험에 사용한 용액을 단독 처리한 실험의 경우 TNF-a와 IL-6 발현의 경우 6시간째에는 큰 차이를 나타내지는 못하였으나, 24시간째에는 발현에 영향을 주었다(P<0.05). C.
후속연구
01). 본 연구를 통해 SQ, AG, Batyl, Chimyl 용액 이 C.albicans 유도에 의 해감소된 면역반응을 증가시킬 수 있을 것으로 생각되어진다.
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