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문제 정의
- 이에 본 연구자는 천연물로부터 항미생물 활성을 갖는 물질의 분석 및 동정을 통해 식품이나 동물 또는 어패류 양식장의 어병 치료제 등에 적용하는 방법을 연구하던 중 우리나라 전역에 걸쳐 자생 또는 재배되고 있는 식물로 주로 과실을 수확하여 식용하거나 일부를 한약재 및 앙금 등의 가공식품으로 이용하고 있는 밤나무가 과실 이외에도 수피, 뿌리, 꽃, 잎을 달인액이나 분말은 창상 및 염증의 치료에 효과가 있고 특히 잎은 알레르기 억제제나 창상에 효과가 있어 민간20,21)긔)으로 사용해온 것에 주목하여, 밤나무 잎의 항미생물 효과를 검색하고 이에 함유된 물질 규명을 시도하여 보고하고자 한다.
제안 방법
- 건조한 밤나무 잎 1 kg을 5 L의 "-hexane에 하룻밤침지시킨 후 homogenizer로 마쇄하여 재차 추출한 다음 Whatman No. 2와 G3 glass Hl ter 로 여과하였다. 여과 후 남은 잔사를 다시 EtOAc 5 L 와 MeOH 5 L를 가해동일한 방법으로 추출하여 여과한 다음, 각각의 여액 을 cooling aspirator가 장치된 vacuum evaporator를, 사용하여 37℃에서 감압농축한 후 얻어진 n-hexane, EtOAc, MeOH 추출물의 항미생물 활성을 검정하였다.
- Sephadex LH-20(25~100 mesh, Pharmacia사)을 Me- OH-CHC13(4:1, V/V) 용매계로 하룻밤 팽윤시킨 후, co- lumn(3.3x100 cm, bed volume 1,000 mL)에 충전하고 동 용매계를 사용하여 용출 분획한 다음 활성을 검정하였다. 4 * * * * *
- 1 mL를 혼합시킨 후 petri dish에 넣고 응고시켰다. 다음 일정 량의 시료를 흡착시킨 후 용매를 제거한 paper disc를 올린 뒤 0.85%의 식염수 75 ul로 확산 시 킨 다음, 세균 중 Streptococcus mutans ATCC 25175, Staphylococcus aureus ATCC 6538, Staphylococcus epi- dermidis ATCC 12228, Escherichia coli ATCC 10536, Salmonella typhimurium ATCC 19430, Pseudomonas aeruginosa ATCC 1628은 37 ℃ 에서 16시간, Bacillus subtilis ATCC 6633, Micrococcus luteus ATCC 9341, Lactobacillus plantarum KCTC 3104, Leuconostoc mesenteroides KCTC 3100, Vibrio vulnificus CDC C7184는 30℃에서 16시간, 효모 Saccharomyces cerevisiae IFO 1850와 Candida albicans ATCC 10231은 30℃에서 16시간 배양하여 clear zone의 크기(mm)로 활성을 측정하였으며, 대조구로 benzoic acid를 사용하였다. 이때 활성 검정을 위해 사용된 미생물은 해당조건에서 3회 반복하여 전배 양을 실시한 후 접종균주로 사용하였으며, 사용된 배지는 세균의 경우, S.
- 또 하 시료의 약 10배량에 상당하는 silica gel을 CHCh으로 slurry를 만들어 column에 충전시킨 후, MeOH- CHC13 용매계로 MeOH 농도를 단계적으로 증가시켜용출 분획한 다음 활성을 검정하였다.
- 밤나무 잎 추출물의 항미생물 활성은 항균활성 물질의 검정법으로 확립된 paper disc법으로 시료를 각각 H-hexane, EtOAc, MeOH로 순차 추출하여 정제한 다음각각의 추출물에서 항미생물 활성을 측정하였다. 그 결과 MeOH 추출물에 대부분 활성이 집중되는 것으로 나타나 밤잎차 0.
- 밤나무 잎에 함유된 기능성 물질 검색의 일환으로항미생물 효과를 검정하고 활성물질의 분석을 시도하였다. 예비실험을 통해 추출물의 활성을 확인한후 시료를 n-hexane, EtOAc, MeOH로 순차 추출하여 정제한 다음 활성이 강한 MeOH 분획의 0.
- 5)으로 수상(buffer fiaction)과 중성획분 (EtOAc-soluble neutral fiaction)으로 분획하였다. 수상획분을 0.1 M HC1 을 이용하여 pH 3.0으로 조절한 뒤 다시 EtOAc로 분배하여 산성 획분(EtOAc-soluble acidic fraction)과 수용액획분(aqueous fraction)을 얻은 후이들 중성 획분, 산성 획분, 수용액 획분에 대하여 항미생물 활성을 검정하였다.
- 시료를 filter(GELMAN Acrodisc LC 13 PVDF, 0.2 μm)로 여과한 후, Delta-pak Cis column(l.9x30.0 cm)과80% MeOH을 이용하여 용출 분획 하였으며, 이때 사용한 HPLC의 조건은 Waters associates model 510, Waters 486 UV detector, Wave length 210 nm, MeOH-HzO (80:20, V/V)용매계, Delta-pak Qs column (01.9 x30.0 cm), Flow rate 9.0mL/min 이었으며, 동조건 에서 Ra- dial-pak Cis column(8><100 mm)으로 70%와 60% MeOH 용매를 사용하여 재차 정제하였다.
- 시료의 약 10배 량에 상당하는 silica gel을 EtOAc로 slurry를 만들어 column에 충전시킨 후, MeOH-EtOAc 용매 계로 MeOH 농도를 단계적으로 증가시킨 step- wise 용출방법으로 분획하여 활성을 검정하였다. 또 하 시료의 약 10배량에 상당하는 silica gel을 CHCh으로 slurry를 만들어 column에 충전시킨 후, MeOH- CHC13 용매계로 MeOH 농도를 단계적으로 증가시켜용출 분획한 다음 활성을 검정하였다.
- 2와 G3 glass Hl ter 로 여과하였다. 여과 후 남은 잔사를 다시 EtOAc 5 L 와 MeOH 5 L를 가해동일한 방법으로 추출하여 여과한 다음, 각각의 여액 을 cooling aspirator가 장치된 vacuum evaporator를, 사용하여 37℃에서 감압농축한 후 얻어진 n-hexane, EtOAc, MeOH 추출물의 항미생물 활성을 검정하였다.
- 페놀성 획분에서 활성이 인정되었다. 이때 얻어진 산성 획분과 페놀성 획분의 양은 각각 10.85 g과 8.9 g이었으며, 이들 획분 중 산성 획분의 구조 분석을 실시하였다. 용매 분획하여 얻어진 산성 획분(10.
- 8 mg)을 농축하여 소량의 MeOH을 가하자 MeOH에 용해되지 않는 비교적 깨끗한 결정성 물질이 분리되었다. 이에 MeOH을 가하여 시료를 더욱 정제한 후 7.8 mg의 CHCh가용 물질을 분리해 기기분석을 통해 물질을 분석하였다.
- 정제된 활성물질의 구조를 MS, ’H-NMR 13C-NMR, 'h-'h COSY, HMBC 등의 기기분석을 통해 분석하였다. 활성물질을 직접주입구(Direct injection port, DIP)가 장치된 MS (JMS-DX 302 WA, Jeol, Japan)를 이용하여 EI-MS(electron inpact mass spectrometiy) 로 분석하였으며, 조건은 Jeol JMS-DX 302 WA mass spectrometer, Ion Source chamber Tenp).
- 항미생물 활성의 측정은 paper disc법끄, 끼으로 실시하였다. Pour-plate method에 의해 45 ℃ 로 조절된 각각의 멸균배지 15 mL에 검정에 사용된 각 미생물의 전 배양액 0.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 밤나무(C&fcmea crenata S. et Z.)잎은 전라남도 순천시 야산에서 자생하고 있는 밤나무에서 잎이 여리지 않고 또한 경화되지 않은 5월 하순에 엽장 14cmx 엽폭 5cm 크기로 채취하여 잎자루를 제거하고 수분 5% 이하로 음건하여 시료로 하였다.
- 85%의 식염수 75 ul로 확산 시 킨 다음, 세균 중 Streptococcus mutans ATCC 25175, Staphylococcus aureus ATCC 6538, Staphylococcus epi- dermidis ATCC 12228, Escherichia coli ATCC 10536, Salmonella typhimurium ATCC 19430, Pseudomonas aeruginosa ATCC 1628은 37 ℃ 에서 16시간, Bacillus subtilis ATCC 6633, Micrococcus luteus ATCC 9341, Lactobacillus plantarum KCTC 3104, Leuconostoc mesenteroides KCTC 3100, Vibrio vulnificus CDC C7184는 30℃에서 16시간, 효모 Saccharomyces cerevisiae IFO 1850와 Candida albicans ATCC 10231은 30℃에서 16시간 배양하여 clear zone의 크기(mm)로 활성을 측정하였으며, 대조구로 benzoic acid를 사용하였다. 이때 활성 검정을 위해 사용된 미생물은 해당조건에서 3회 반복하여 전배 양을 실시한 후 접종균주로 사용하였으며, 사용된 배지는 세균의 경우, S. rmitans는 BHI배지(Dift:o), V.vulvificusus 는 LB 배지 (Ditto), 젖산균은 Lactobacilli MRS 배지(Difbo)였으며, 그 밖의 세균은 Nutrient 배지 (Difco)를 사용하였고, 효모는 YM 배지(Difco)를 사용하였다.
성능/효과
- 그 결과 MeOH 추출물에 대부분 활성이 집중되는 것으로 나타나 밤잎차 0.2 g, 0.5 g에 해당하는 (시료 1 g당 수율 = 0.19 g, 0.21 g) MeOH 추출물 8 mg과 20 mg으로 13종의 미생물에 대해 생육 저해 활성을 측정한 결과, Table 1에 제시한 바와 같이 Gram 양성 세균 중에서 S.aureus와 S. epidertnidis는 대조구로 사용한 benzoic acid 0.65 mg보다 강한 활성이 나타났고, M. luteus와 L. mesenteroides, B. subtilis에서도 활성이 인정되었으며, Gram 음성 세균인 E. coll, S. typhimurium, P. aeru- gzTiosa에서도 강한 활성이 나타났다. 그외 S.
- 52 위치에 OH를 갖는 C의 proton(proton on hydroxylated carbon, 'H, m, H-3)의 존재가 확인되었다. 또한 동용매로 bc-nw분석을 실 시 한 결과(Fig. 4) 6개의 methyl carbon [ § 11.8(C-25), 12.0(C-29), 18.8(C-26), 19.0(C-27), 19.4(C-24), 19.8(C- 28)〕, 11 개의 methylen carbon〔321.0(011), 23.0(C-20), 24.3 (C-15), 26.0(C-23), 28.2(C-16), 31.6(C-2), 31.9 (C-7), 33.9(C-19), 37.2(C-1), 39.7(C-12), 42.2(C-4)], 2개의 olefimic carbon〔 S 121.2(C-6), 140.3(C-5)], 1 개의 hydroxylated methin carbon〔67L3(C-3)〕, 7개의 methin carbon〔S29.1(C-22), 3L8(C・8), 36.1(C-18), 45.8 (C-21), 50.0(C-9), 56.0(C-17), 56.7(C・14)〕그리고 2개의 quaternary carbon〔636.4(010), 422(013)〕등 총 29 개의 carbon signal0] 관찰되었으며, 이 결과는 DEPTexperiment의 결과와도 일치하였으며, 이 data와 authentic san車le의 NMR data를 비교한 결과, 일치 하는 것을 확인하여 산성 획분에서 분리된 밤나무 잎 활성물질은 stigmagt・5-en-3-ol(&sitosterol)로 분석되었다.
- 예비실험을 통해 추출물의 활성을 확인한후 시료를 n-hexane, EtOAc, MeOH로 순차 추출하여 정제한 다음 활성이 강한 MeOH 분획의 0.2 g, 0.5 g에 해당하는 추출물로 13종의 미생물에 대해 활성을 측정한 결과, Gram 양성 세균 중에서 S. (物?杉어s와 S. epidermidis는 대조구로 사용한 benzoic acid보匸} 강한 활성이 나타났고, M.
- 9 g이었으며, 이들 획분 중 산성 획분의 구조 분석을 실시하였다. 용매 분획하여 얻어진 산성 획분(10.85 g)을 CHCh-MeOH 혼합 용매 계로 silica gel adsorption column chromatography를 실시하여 분획하고 활성을 검정한 결과, CHCh-MeOH, 95:5에서 90:10사이의 용매 계에서 활성이 집중되어 이를 CHCh-EtOAc를 사용하여 re-silica gel adsorption column chromatography# 실시한 결과, CHC13-EtOAc(V/V), 95:5와 80:20, 0:100의 세 부분에서 활성을 갖는 분획으로 분리되었다. 이들 중 가장 활성이 강하고 집중된CHCh-EtOAcfW), 95: 5(69 mg)을 MeOH-CHC13((V/V, 4:1) 용매계의 Sephadex LH-20 column chromatography에 의해 분획하고 활성을 검정한 결과 bed volume에 대한 elution volume의 비 (Ve/Vt)가 0.
- 85 g)을 CHCh-MeOH 혼합 용매 계로 silica gel adsorption column chromatography를 실시하여 분획하고 활성을 검정한 결과, CHCh-MeOH, 95:5에서 90:10사이의 용매 계에서 활성이 집중되어 이를 CHCh-EtOAc를 사용하여 re-silica gel adsorption column chromatography# 실시한 결과, CHC13-EtOAc(V/V), 95:5와 80:20, 0:100의 세 부분에서 활성을 갖는 분획으로 분리되었다. 이들 중 가장 활성이 강하고 집중된CHCh-EtOAcfW), 95: 5(69 mg)을 MeOH-CHC13((V/V, 4:1) 용매계의 Sephadex LH-20 column chromatography에 의해 분획하고 활성을 검정한 결과 bed volume에 대한 elution volume의 비 (Ve/Vt)가 0.64~0.74의 용출획분(23 mg, 980 g fr. wt.eq.)에서 활성이 집중되었으며, 이 활성 획분을 re-Se-phadex LH- 20 column chromatography에 의해 재정제하여 13.8 mg(976 g fr. wt. eq.)의 활성 획분을 얻었다. Sephadex LH-20 column chromatography에 의해 정제된산성 획분의 활성 분획(13.
- 이에 CDCh를 용매로 1H-NMR을 분석한 결과(Eg.3), 6개의 Methyl Proton [d 0.68(3H, S, H-25), 0.82 (3H, d, J=8.5, H-28), 0.85(3H, d, J=8.5, H=27), 0.87(3H, t, overlapped with H-27, H-29), 0.92(3H, d, J=6.5, H-26) 1.01( 3H, S, H-24)], 3 3.52 위치에 OH를 갖는 C의 proton(proton on hydroxylated carbon, 'H, m, H-3)의 존재가 확인되었다. 또한 동용매로 bc-nw분석을 실 시 한 결과(Fig.
- 활성 물질의 분석을 위해 활성이 집중된 시료 1 kg 에서 얻어진 MeOH 추출물 187 g을 용매 분획하여 산성, 중성, 염기성 획분으로 나누고 이들 분획에 대하여항미생물 활성을 검정한 결과 대부분의 활성이 산성획분과 중성 획분에서 나타났으며, 중성 획분은 다시 중성과 페놀성 획분으로 분획하여 활성을 확인한 결과 페놀성 획분에서 활성이 인정되었다. 이때 얻어진 산성 획분과 페놀성 획분의 양은 각각 10.
후속연구
- 또한 최근에는 박테리아가 생산하는 항균 peptide *?1 nisin 등의 bacteriocin고} polylysine, 유산균 등 미생물이 생산하는 항균물질들이 안전성을 확보할 수 있다는 점에서 식품첨가물로의 이용성에 관심이 모아지고 있다15-19). 따라서 추후 보존료에 대한 연구는 자연계에 존재하는 천연물 성분 및 미생물이 생산하는 물질 등 보다 안전성을 확보할 수 있는 쪽으로 초점이 맞추어질 것으로 보여지며, 국내에서도 이들 물질의 확보를 위해 다양한 식물 및 부산물 등 다양한 자원에 대한 검색과 이들 물질의 추출, 정제방법의 확립, 추출물의 분리 . 동정 및 대 량 생산, 안전성 검사 등 많은 부분에 연구가 이루어져야 할 것으로 사료된다.
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