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문제 정의
- 따라서 당뇨병 실험동물을 이용한 chiro- inositol feeding 실험을 통하여 chiro- inositol의 대사를 조사하고 인슐린 비의존성 당뇨병환자에게 chiro- inositol를 투여하여 당뇨병을 예방할 수 있는 therapeutic/nutraceutic supplement개발을 위한 연구[2]의 일환으로 혈당강하효과를 갖는 chiro- inositol을 다량 함유하고 있는 일반적인 일상 식품이나 식용물질을 분석하여 조사하였다" 이는 therapeutic/nutraceutic supplement로서 chiro- inositol의 대량 생산방법이 지금까지는 kasugamicin이나 pinEtol에서 유도체를 분리하거나 유기합성으로 생산되고 있어 화학적 공정 상의 소량생산과 고 비용의 문제를 가지고 있어 이러한 문제점을 해결하기 위하여 실시하였고, 그 결과 식품으로 안전한 대두와 대두 부산물인 탈지대두와 두부 순물이 5 mg/g 이상의 높은 chiro- inositol을 함유하고 있음을 밝히고, 분리한 대두 chiro- inositol을 당뇨병 실험동물에 경구투여 하여 혈당강하효과를 증명하였다.
제안 방법
- chiro- inositol의 혈당 조절효과는 streptozotocm (STZ) (40 ㎎/㎏ BW, 복강투여)을 처리하여 고혈당 쥐로 유발한 뒤 혈당이 300 -500 mg/dl인 쥐를 선택하여 하룻밤 동안 절식시키고, 실험직전 혈당(0 time)을 확인한 후 chiro- inositol (50 ㎎/㎏ BW)을 경구 투여하여 30분 간격으로 혈당을 미정맥(tail 지ein)의 전혈을 채취하여 glucose oxidation method를 이용한 GLUCOCARD II (Arkray, Kyoto Daiichi Kagaku, KYOTO, JAPAN)로 조사하였다. Glucose tolerance test는 D-glucose (4 g/kg BW)를 실험직전 혈당(0 time)을 확인하기 60분전에 복강투여한 후 위와 같이 chiro-inositol (50 ㎎/㎏ BW)을 경구 투여하여 30분 간격으로 혈당을 조사하였다. 대조물질(vehicle)은 멸균생리식염수를 사용하였으며 각각의 실험에 사용된 실험군과 대조군은 최소 7마리에서 10마리를 사용하였다.
- 2 um, Costar Spin-X 8169)에 통과시켜 HPLC로 각 시료에 함유된 chiro- inositol을 정량화 하였다. HPLC 에 사용된 columne Dionex Carbopak MA-1 이고 pulsed electrochemical detector로 확인하였다[2,11]. 사용한 완충용액은 60 mM NaOH이 었으며 분당 0.
- 수용성 성분 중에서 이온성 물질 을 제거하기 위하여 anion/cation-mixed ion exchange column (Amberlite MB-150) 및 C18 Sep-pak cartridge를 통과시켜 소수성 불순물도 흡착시켜 제거하였다[2,11,,12,14]. Sep-pak cartridge를 통과한 chiro-inositol 함유용액을 동결 건조시켜 재 분말화시키고, 다시 적당량의 증류수에 녹인 후 microcentrifuge nylon membrane (0.2 um, Costar Spin-X 8169)에 통과시켜 HPLC로 각 시료에 함유된 chiro- inositol을 정량화 하였다. HPLC 에 사용된 columne Dionex Carbopak MA-1 이고 pulsed electrochemical detector로 확인하였다[2,11].
- chiro- inositol을 정상혈당의 쥐에 경구 투여하여 Fig. 4와 같이 혈당제거율(glucose tolerance test)을 관찰하였다.chiro- inositol을 처리하지 않은 대조군(-•-)의 경우 30분과 60분에 각각 42% 와 28%의 혈당 제거율을 나타낸 반면,chiro- inositol을 처리한 실험군(-■-)에서는 90분에 24%의 혈당 제거율을 나타내었다.
- Sprague-Dawley (male, 5주령, 150-160 g, 중앙실험동물)를 구입 후 최소한 일주일 간의 순화 시간을 거친 후 시험 시 체중이 180 — 200 g인 동물을 사용하였다. chiro- inositol의 혈당 조절효과는 streptozotocm (STZ) (40 ㎎/㎏ BW, 복강투여)을 처리하여 고혈당 쥐로 유발한 뒤 혈당이 300 -500 mg/dl인 쥐를 선택하여 하룻밤 동안 절식시키고, 실험직전 혈당(0 time)을 확인한 후 chiro- inositol (50 ㎎/㎏ BW)을 경구 투여하여 30분 간격으로 혈당을 미정맥(tail 지ein)의 전혈을 채취하여 glucose oxidation method를 이용한 GLUCOCARD II (Arkray, Kyoto Daiichi Kagaku, KYOTO, JAPAN)로 조사하였다. Glucose tolerance test는 D-glucose (4 g/kg BW)를 실험직전 혈당(0 time)을 확인하기 60분전에 복강투여한 후 위와 같이 chiro-inositol (50 ㎎/㎏ BW)을 경구 투여하여 30분 간격으로 혈당을 조사하였다.
- 다량의 chiro- inositol을 함유하고 있는 식용자원을 탐색하기 위하여 대두와 대두의 부산물을 비롯한 약 300여종의 식품 및 식용물질에서chiro- inositol의 함량을 분석하여 원료를 선정 하였다. 'olnositol의 분석은 시중에서 구입한 시료 적당량에 최종농도가 6N HCl 이 되도록 HCl원액을 처리하여 heating block으로 110ºC에서 48시간 동안 산 분해시켰다.
- 대두 부산물로부터 분리한 chiro- inositol을 멸균생리식염수에 녹여 STZ로 유발된 당뇨병 쥐에 경구투여(체중 1kg당 50 mg)한 후, 시간의 경과에 따라 혈당의 변화를 관찰하였다. 혈당 량 조사는 쥐의 꼬리로부터 혈액을 채취하여 당산화(glucose oxidation)법에 의한 GLUCOCARD를 사용하였다.
- Table 1에서와 같이 chiro- inositol의 함량을 조사한 결과, 대부분의 식용물질에서는chiro- inositol의 함량이 1 mg/g (건조시료) 이하로 아주 낮았으며 대두 및 그 부산물인 탈지대두, 두부순물, 콩잎에서는 5 mg/g (건조시료) 이상으로 높았다. 또한 솔잎이나 솔순에서 17 mg/g (건조시료)정도의 chiro- inosito이 분석되었으나 원료의 구입이 용이하고 가격이 상대적으로 낮은 대두의 부산물인 탈지대두와 두부를 만들 때 생성되는 두부 순물을 선택하여 chiro- inositol 추출하고 분리 정제하는 공정을 lab-scale로 완성하여, 생산된 시제품(chiro- inositol 순도 : 90% 이상(w/w))을 동물실험에 사용하였다.
- 산으로 분해 된 시료를 동결 건조시키고, 시료 중에 함유되어 있는 불순물을 제거하고 chiro- inositol의 순도를 높이기 위하여 분말 화된 시료를 2~5배의 증류수에 용해시킨 다음, 원심 분리하여 수용성 성분인 상등 액만을 취하였다. 수용성 성분 중에서 이온성 물질 을 제거하기 위하여 anion/cation-mixed ion exchange column (Amberlite MB-150) 및 C18 Sep-pak cartridge를 통과시켜 소수성 불순물도 흡착시켜 제거하였다[2,11,,12,14]. Sep-pak cartridge를 통과한 chiro-inositol 함유용액을 동결 건조시켜 재 분말화시키고, 다시 적당량의 증류수에 녹인 후 microcentrifuge nylon membrane (0.
대상 데이터
- Sprague-Dawley (male, 5주령, 150-160 g, 중앙실험동물)를 구입 후 최소한 일주일 간의 순화 시간을 거친 후 시험 시 체중이 180 — 200 g인 동물을 사용하였다. chiro- inositol의 혈당 조절효과는 streptozotocm (STZ) (40 ㎎/㎏ BW, 복강투여)을 처리하여 고혈당 쥐로 유발한 뒤 혈당이 300 -500 mg/dl인 쥐를 선택하여 하룻밤 동안 절식시키고, 실험직전 혈당(0 time)을 확인한 후 chiro- inositol (50 ㎎/㎏ BW)을 경구 투여하여 30분 간격으로 혈당을 미정맥(tail 지ein)의 전혈을 채취하여 glucose oxidation method를 이용한 GLUCOCARD II (Arkray, Kyoto Daiichi Kagaku, KYOTO, JAPAN)로 조사하였다.
- Glucose tolerance test는 D-glucose (4 g/kg BW)를 실험직전 혈당(0 time)을 확인하기 60분전에 복강투여한 후 위와 같이 chiro-inositol (50 ㎎/㎏ BW)을 경구 투여하여 30분 간격으로 혈당을 조사하였다. 대조물질(vehicle)은 멸균생리식염수를 사용하였으며 각각의 실험에 사용된 실험군과 대조군은 최소 7마리에서 10마리를 사용하였다.
데이터처리
- 결과분석은 평균士표준편차로 나타내고 각 군 유의성 검정은 student-t test 분석을 하여 p<(105에서 유의성을 검정하였다.
이론/모형
- 대두 부산물로부터 분리한 chiro- inositol을 멸균생리식염수에 녹여 STZ로 유발된 당뇨병 쥐에 경구투여(체중 1kg당 50 mg)한 후, 시간의 경과에 따라 혈당의 변화를 관찰하였다. 혈당 량 조사는 쥐의 꼬리로부터 혈액을 채취하여 당산화(glucose oxidation)법에 의한 GLUCOCARD를 사용하였다. Fig.
성능/효과
- 따라서 chiro- inositol의 투여는 당뇨병에서 나타난 inositol phosphate, inositol 인지질, inositol당지질, inositol phosphoglycan 및 glycosylphosphatidylinositol과 같은 chiro- inositol의 대사산물 및 유도체의 생합성 결함을 sal.,age pathway를 통하여 chiro- inositol의 대사기작 결함과 장애를 교정할 수 있고, 구체적으로는 당뇨병 환자에게 chiro- inositol의 투여가 chiro-inositol 생합성의 결함을 bypass하여 치료할 수 있는 가능성과 chiro-inositol 의 therapeutic/nutraceutic supplement 역할을 제공하는 중요한 정보를 얻었다. 더불어 산업화를 통한 치료제 및 치료보조제, 식품첨가물로서의 기능성을 확인하였고 기술개발을 통한 산업화로 발전할 경우 당뇨병의 insulin resistance와 관련된 다른 질병, 즉 insulin deficiency, obesity, hypertension 및 다른 cardiovascular diseases에서도 chiro- inositol과 csinositol함유 mediator의 결핍을 초래하는 cfa'ro-inositol 대사의 결함으로 발생하는 여러가지 성인병의 치료에도 적용이 가능할 것으로 생각된다.
- chiro- inositol을 처리하지 않은 대조군(-•-)의 경우 30분과 60분에 각각 42% 와 28%의 혈당 제거율을 나타낸 반면,chiro- inositol을 처리한 실험군(-■-)에서는 90분에 24%의 혈당 제거율을 나타내었다. 90분 이후부터 대조군에서는 점차 혈당이 회복되기 시작하는 반면, 실험군에서는 90분 이후부터 혈당 제거율이 현저히 증가 하기 시작하여 150분경에는 정상에 가까운 정도까지 혈당 제거율 을 나타내었고 이후 240분까지 그 효력이 지속되었다. 이는 발표 된 연구결과들 [9,11,12]에서 언급하는 내용과 같이 인슐린에 민감 하게 반응하는 대사조직 즉, 말초의 근육, 지방 및 간 조직에 작용함으로써 그 효력이 지연되어 나타나며, 작용시간 또한 오래 지속되는 것으로 생각된다.
- Fig. 3echiro- inositol을 STZ로 유발된 당뇨병 쥐에 경구투여 하였을 때 혈당제거율의 변화를 조사한 것으로, cftfro-inositol 을 처리한 실험군(#)은 혈당이 30분경부터 감소하기 시작하여, 60분경에는 약 25%, 180분에는 38%, 그리고 360분에는 28%의 감소율을 유지함으로써 혈당 감소율을 일정하게 장시간 지속시 키는 효력을 가지는 것으로 나타났다. 반면에 chiro- inositol을 처리하지 않은 대조군(#)은 전혀 혈당 제거율이 없었다.
- 여기에 다시 인슐린을 처리했을 때, 혈당은 정상에 가까운 감소를 나타내었는데 이는 chiro- inositol 체내 대사가 원활히 이루어짐으로써 당대사 조직에 독성을 나타내거 나 인슐린 수용체에 결함을 초래하지 않았음을 나타낸 것으로 보인다. 그리고 인슐린과 chiro- inositol을 복합 처리했을 때, 인슐린만을 단독으로 사용했을 때와 같은 저혈당중은 동반되지 않았으므로, chiro- inositol이 부작용이 없는 안전한 혈당강하제 로 사용될 수 있음을 확인할 수 있었다.
- 대두 부산물에서 분리 정제된 chiro- inositol로 당뇨 쥐와 정상 쥐에서 혈당강하효과를 조사해 본 결과, STZ으로 유발된 고혈당 쥐의 혈당제거율 검사에서 강한 혈당강하 효과(약 40%)를 나타내었으며 지속시간은 약 12시간이었고, 인슐린과 복합처리 했을 때 상승작용(synergy)을 나타내었으며, 저혈당증으로 전혀 발전하지 않았다. 따라서 이러한 결과는 chiro- inositol이 인슐린 의존성 및 인슐린 비의존성 당뇨병으로 인한 혈당상승을 억제 또는 예방할 수 있어 혈당강하제 및 영양학적 건강식품으로 사용될 수 있고, 당뇨병에 인슐린과 함께 적용할 수 있으므로, 상승적 혈당강하 효과를 가질 수 있음을 증명하였다.
- 대두 부산물에서 분리 정제된 chiro- inositol로 당뇨 쥐와 정상 쥐에서 혈당강하효과를 조사해 본 결과, STZ으로 유발된 고혈당 쥐의 혈당제거율 검사에서 강한 혈당강하 효과(약 40%)를 나타내었으며 지속시간은 약 12시간이었고, 인슐린과 복합처리 했을 때 상승작용(synergy)을 나타내었으며, 저혈당증으로 전혀 발전하지 않았다. 따라서 이러한 결과는 chiro- inositol이 인슐린 의존성 및 인슐린 비의존성 당뇨병으로 인한 혈당상승을 억제 또는 예방할 수 있어 혈당강하제 및 영양학적 건강식품으로 사용될 수 있고, 당뇨병에 인슐린과 함께 적용할 수 있으므로, 상승적 혈당강하 효과를 가질 수 있음을 증명하였다. 따라서 chiro- inositol의 투여는 당뇨병에서 나타난 inositol phosphate, inositol 인지질, inositol당지질, inositol phosphoglycan 및 glycosylphosphatidylinositol과 같은 chiro- inositol의 대사산물 및 유도체의 생합성 결함을 sal.
- 2에서 보여 주는 바와 같이, chiro- inositol을 처리한 실험군은 30분경부터 혈당이 감소되기 시작하였으나, chiro- inositol을 처리하지 않은 대조군은 혈당의 변화가 관찰되지 않았다. 또한 실험군은 약 6시간 동안 강한 혈당의 감소효과(500 mg/dl -^300 mg/dl)를 나타내고, 12시간 이후에 처음의 혈당으로 회복됨으로써 chiro- inositol의 작용 지속시간이 12시간 이상임 을 보여 주었다. 여기에 다시 인슐린을 처리했을 때, 혈당은 정상에 가까운 감소를 나타내었는데 이는 chiro- inositol 체내 대사가 원활히 이루어짐으로써 당대사 조직에 독성을 나타내거 나 인슐린 수용체에 결함을 초래하지 않았음을 나타낸 것으로 보인다.
- 반면에 chiro- inositol을 처리하지 않은 대조군(#)은 전혀 혈당 제거율이 없었다. 이러한 결과는 ctooinositol을 다른 물질과 복합처리 함으로써 상승 효과를 장시간 기대할 수 있을 뿐만 아니라, 다른 약물에 의한 부작용에 따른 일시적인 혈당상승의 치명적인 문제점을 예방할 수 있음을 나타내 주는 결과로 생각된다.
후속연구
- ,age pathway를 통하여 chiro- inositol의 대사기작 결함과 장애를 교정할 수 있고, 구체적으로는 당뇨병 환자에게 chiro- inositol의 투여가 chiro-inositol 생합성의 결함을 bypass하여 치료할 수 있는 가능성과 chiro-inositol 의 therapeutic/nutraceutic supplement 역할을 제공하는 중요한 정보를 얻었다. 더불어 산업화를 통한 치료제 및 치료보조제, 식품첨가물로서의 기능성을 확인하였고 기술개발을 통한 산업화로 발전할 경우 당뇨병의 insulin resistance와 관련된 다른 질병, 즉 insulin deficiency, obesity, hypertension 및 다른 cardiovascular diseases에서도 chiro- inositol과 csinositol함유 mediator의 결핍을 초래하는 cfa'ro-inositol 대사의 결함으로 발생하는 여러가지 성인병의 치료에도 적용이 가능할 것으로 생각된다.
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