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문제 정의
- 이런 견지에서 제주산 감귤을 이용한 고 부가가치 상품 개발을 위하여 감귤식초 발효에 적합한 균주를 선발할 목적으로 본 연구를 수행하였으며, 선발된 균주를 분리ㆍ동정하고 현재 산업적인 감식초 및 사과식초 발효에 이용되고 있는 균주와 발효력을 대비 시험하였다.
제안 방법
- (2) 2차 분리 : 분리한 총 10개 균주를 에탄올 배지에 streaking하여 30℃에서 48시간 정치배양하는 한편으로 감귤와인에 접종하여 각 14일간 3회 반복 계대배양하여 배양액의 산도를 검정하고 산 생성능력과 clear zone의 넓이와 투명도가 가장 높은 균주를 재료 별로 각각 1개 균주를 선발하였다. 선발된 발효균은 분리한 재료에 따라 CV1(농축과즙) 및 CV2(착즙액)로 명명하였다.
- 감귤와인에 10%(v/v)의 종초를 첨가하고 초기산도를 1.0%로 조정한 후 30℃에서 200 rpm으로 8일간 진탕배양한 후 pH와 산도, 잔류 알콜 및 잔당량을 측정하였다.
- 감귤와인에 균체를 접종하여 8일 간 발효한 발효액 0.1 ㎖를 직경 8.0 mm의 멸균한 paper disc(No.2, Toyo, Japan) 에 주가하고 30 ℃에서 48시간 배양 한 후 disc 주변에 형성된 growth zone, clear zone 및 effect zone의 폭을 측정하였다. 각 zone은 통상의 방법에 따라 Fig.
- 고체 사면배지로부터 균체 1백금이를 취하여 에탄올 배지에 streaking한 후 30℃에서 48시간 정치배양하고 생성된 streaking 한 cell line의 가장자리로부터 clear zone의 넓이를 측정하였다.
- 분리한 2종의 식초산 발효균의 발효력을 산업적으로 식초산 발효에 사용되고 있는 균주와 대비하여 평가하였다. 발효력은 ① streaking법에 의한 clear zone 생성능력 ② paper disc법에 의한 clear zone 생성능력 및 ③ 발효액 중 기질 소비량 및 산도변화의 3가지 방법으로 평가하였으며, 대비시험용 균주로는 경북과학대학 부설 식품가공공장으로부터 분양받은 감식초발효균 (Acetobacter sp. PA97)과 사과식초발효균 (Acetobacter sp. ATI 및 AT2)을 사용하였다.
- 분리균의 형태는 크리스탈 바이올렛으로 1분간 염색한 후 여분의 염료를 증류수로 세척하여 제거하고 광학현미경 (Ecripse E400, Nicon, Japan)으로 관찰하였으며, 건조 피막 후 주사형현미경(S-800, Hitachi, Japan)으로 관찰하였다.
- 분리한 2종의 식초산 발효균의 발효력을 산업적으로 식초산 발효에 사용되고 있는 균주와 대비하여 평가하였다. 발효력은 ① streaking법에 의한 clear zone 생성능력 ② paper disc법에 의한 clear zone 생성능력 및 ③ 발효액 중 기질 소비량 및 산도변화의 3가지 방법으로 평가하였으며, 대비시험용 균주로는 경북과학대학 부설 식품가공공장으로부터 분양받은 감식초발효균 (Acetobacter sp.
- 분리한 감귤 식초산 발효균을 (주)마이크로아이디(서울 관악구 신림동 56-1)에 의뢰하여 16S rDNA의 염기서열을 분석하고 한국 유전자은행이 보유한 표준균주의 염기서열과 비교하여 97% 이상의 유사성과 아울러 계통수(accession no.)가 일치하는 경우에 종을 확정하였다.
- 5 cm 이상의 넓은 폭의 clear zone을 형성하였다. 이 결과로부터 1번 균주와 6번 균주를 식초산 발효균으로 최종 선발하고 균주명을 각각 CV1 과 CV2로 설정하였다.
- 제주산 감귤과즙을 이용하여 감귤식초를 제조할 목적으로 식초산 발효균 CV1 과 CV2를 분리하고 식초산 생성능력을 산업적으로 이용되고 있는 균주와 비교 검정하고 16S rDNA 염기서열을 분석하고 동정하였다. 분리균은 8일간의 발효에 의하여 산도 5.
대상 데이터
- 제주산 감귤과즙을 식초산 발효용으로 사용하였으며, 과즙은 2001년 12월 제주도 서귀포 일대에서 생산된 감귤을 착즙한 것과 가공된 농축과즙을 제주 감귤 복합가공공장으로 부터 발효용 재료로 공급 받아 사용하였다. 감귤 착즙액은 당도 10〜 13°Brix로서 원액을 발효액으로 사용하였고, 농축액은 증류수로 희석하여 당도를 13°Brix로 조정하여 발효액으로 사용하였다.
- 감귤과즙에 효모를 접종하고 28℃ 에서 36시간 정치 배양하여 발효하였다. 발효용 효모로는 제주 감귤시험장에서 분리한 감귤와인 제조용 citrus malomelo-yeast (CMY-28)를 분양받아 사용하였다. 감귤과즙 알콜발효액(이하 감귤와인으로 약함)은 5.
- 제주산 감귤과즙을 식초산 발효용으로 사용하였으며, 과즙은 2001년 12월 제주도 서귀포 일대에서 생산된 감귤을 착즙한 것과 가공된 농축과즙을 제주 감귤 복합가공공장으로 부터 발효용 재료로 공급 받아 사용하였다. 감귤 착즙액은 당도 10〜 13°Brix로서 원액을 발효액으로 사용하였고, 농축액은 증류수로 희석하여 당도를 13°Brix로 조정하여 발효액으로 사용하였다.
이론/모형
- pH는 배양액을 원심분리 (8, 000rpmxl5min)하여 균체를 제거한 후 pH meter (model 691, Methrom, Swiss)로 측정하였으며, 배양액 중 총산 함량은 AOAC법13)에 따라 erlenmeyer flask에 배양액 10 ㎖를 취한 다음 phenolptalein 용액 2방울을 적하하고 0.1N NaOH로 중화 적정하였으며 NaOH의 소비량으로부터 아래 계산 식으로 acetic acid로 환산하였다.
- 배양액을 원심분리하여 균체를 제거한 후 상등액을 수증기 증류하고 alcohol hydrometer 로 중류액의 비중을 측정하였으며 Gay Lussac table에 준하여 알콜농도로 환산하였다.
성능/효과
- CV1 과 CV2는 모두 직경 0.6〜0.8 ㎛, 길이 1.5〜3.0 ㎛의 Gram 음성의 호기성 간균으로서 Fig. 2와 같이 Scetobacfer 의 전형적 형태를 나타내었으며, CV1 과 CV2는 유사한 형태를 나타내었다.
- 공시균을 에탄올 배지에 streaking하였을 때 분리균은 Fig. 3과 같이 명확한 clear zone을 형성한 반면에, 분양받은 균주인 PA97(plate A)과 AT1 (plate B)은 clear zone 생성여부가 불명확하였으며, AT2 (plate C)는 clear zone은 형성하였으나 그 면적은 분리균의 약 50%에 불과하였다. 분리균 CV1 과 CV2가 생성한 clear zone의 넓이에는 유의적인 차이가 없었다.
- 감귤와인에 각 균주로 제조한 종초 10%(v/v)를 첨가하여 8일간 발효한 발효액(감귤식초)의 pH, 산도, 잔당 및 알콜 함량을 조사한 결과는 Table 7과 같다. 공시한 5개 균주가 모두 5% 이상의 식초산을 생성하였으며 산도는 AT2가 6.15%로 가장 높았고 CV1과 CV2의 산도는 각각 5.89%와 5.54%로 PA97 및 AT1보다는 높았다. 발효기간 중 AT2와 CV1, CV2는 발효액 중의 알콜을 모두 소비한 반면에 PA97과 ATI은 0.
- 제주산 감귤과즙을 이용하여 감귤식초를 제조할 목적으로 식초산 발효균 CV1 과 CV2를 분리하고 식초산 생성능력을 산업적으로 이용되고 있는 균주와 비교 검정하고 16S rDNA 염기서열을 분석하고 동정하였다. 분리균은 8일간의 발효에 의하여 산도 5.5% 이상의 식초산을 생성하였으며, 감귤식초 발효에는 사과식초나 감식초 발효에 이용되고 있는 균주 보다 더욱 적합한 것으로 판정되었다. 분리한 균주는 Gluconacetobacter hansenii(CV2) 및 G.
- 분리균의 16S rDNA의 염기서열을 분석한 결과 농축과즙발효액에서 분리한 CV1은 Table 2와 같이 총 700개의 염기쌍으로 구성되었으며, 염기서열은 Table 3과 같이 한국 유전자은행에서 보유한 표준균주Gluconacetobacter(G) europaeus, G. hansenii, G. xylinus, Acetobacter(A) intermedius 및 A. oboediens 와 96% 이상의 유사성을 나타내었다. 한편, 감귤착즙액에서 분리한 CV2의 16S rDNA는 Table 4와 같이 총 645개의 염기쌍으로 구성되었으며 염기서열은 Table 5와 같이 Gluconacetobacter hansenii와 97%의 다소 높은 유사성을 보인 것을 제외하면 CV1 과 비슷한 유사성을 나타 내었다.
- 5% 이상의 식초산을 생성하였으며, 감귤식초 발효에는 사과식초나 감식초 발효에 이용되고 있는 균주 보다 더욱 적합한 것으로 판정되었다. 분리한 균주는 Gluconacetobacter hansenii(CV2) 및 G. hansenii의 변이주(CV1)로 동정되었다.
- 알콜배지에 도말한 감귤농축액과 감귤과즙 배양액으로부터 clear zone을 형성한 세균 colony를 각각 5개씩 분리한 후 각 균주를 신선한 감귤와인에 접종하여 배양 6일과 14일에 균주별 배양액의 산도를 측정한 결과 Table 1과 같이 1번 균주와 6번 균주가 각각 6.0% 이상의 산도를 나타내었으며 6〜14일 사이에 산도의 변화도 적었다. 한편, 균체를 알콜배지에 streaking하였을 때에도 1번 균주와 6번 균주는 균체증식선의 가장 자리로부터 2.
- 동정되었다. 한편, CV1은 공시한 표준균주와의 유사도에 현저한 차이가 없어서 동정은 어려웠으나 계통수 분석결과 G. ewropaews보다는 G. hansenii group에 가까웠기 때문에 식초 발효에 적합한 성상을 지닌 것으로 판단된다.
- 현행의 식품위생법 상 4.0% 이상의 식초산을 함유하면 조미용 식초로 사용가능하며, 세계적으로도 조미 식초의 규격이 4〜6%의 범위에 속하는 바, 분리균을 이용한 감귤식초 생산이 가능 한 것으로 판단된다. 아울러 주정을 첨가하지 아니한 천연과즙 식초는 식초산 농도가 5%를 넘기 어려운 것으로 알려져 있으나17) 분리균으로 발효한 감귤식초는 곡류식초에 가까운 5.
후속연구
- 0%의 높은 산도에 도달하였다는 점에서 우수한 발효균으로 판정된다. 다만, 산업생산을 위해서는 감귤식초의 관능적 특성과 유기산 조성 및 저장성 등의 품질 특성과 아울러 발효기간을 단축시키는 방안이 강구되어야 할 것으로 분석된다.
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