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문제 정의
- 이러한 과정에서 생성된 NO는 급성 또는 만성 염증반응에 의해 유발되는 질병을 유발한다. 본 연구에서는 열수 주출된 여러가지 한약재 중에서 lipopolysaccharide (LPS)에 의해 유도된 NO의 생성을 억제하는 한약재를 탐색하였다. 그결과 木瓜, 虎杖根 및 乳香에서 주출된 산물이 LPS에 의해 유도된 NO의 생성을 억제하는 것을 관찰 하였다 또한 이러한 NO의 증가는 木瓜, 虎杖根 및 乳香의 농도가 증가함에 따라 NO의 생성이 농도 의존적으로 감소하였다.
- 본 연구에서는 열수 추출된 다양한 한약재를 대상으로 혈압조절, 신경전달, 혈액응고, 면역기능 등의 역할을 조절하는 것으로 알려져 있는 NO의 생성을 억제하는 한약재를 검색하고 NO 생성을 억제하는 그 기전을 규명하고자 실험을 진행하였다. Raw 264.
- 이에 저자들은 열수추출법으로 추출한 여러 한약재로부터 LPS의 처리에 의해 유도되는 NO의 생성을 억제하는 한약재를 검색하여 그중에서 비교적 높은 활성을 나타내는 木瓜, 虎杖根 및 乳香을 대상으로 LPS로 활성화된 Raw 264.7 세포에서의 NO 생성, iNOS, COX-2의 발현에 관한 연구를 실시하였다.
제안 방법
- 1% DEPC가 함유된 PBS로 세척한 후 TRIzol를 첨가하여 세포를 lysis시켰다 여기에 클로로포름을 첨가한 다음 원심 분리하여 상층액을 수확하고, isopropan이을 이용하여 RNA를 침강시킨 후 건조하여 RNA를 분리하였다. 5x RT buffer 2 双, 10mM dNTP 1 戒, MMLV reverse transcriptase (200 U/以, (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD) 0.25 憫, RNase inhibitor 0.25 處 50 ㈣ oligo dT primer 0.5 畝, DEPC-water 4 必를 PCR tube에 넣어 RT mixture를 만들고 여기에 total RNA 2 傩를 첨가한 후 42℃에서 1 시간동안 cDNA 합성을 수행하였다: 증폭된 PCR 산물은 1.2% agarosegel에서 전기 영동하여 UV transilluminatere 이용하여 DNA band를 확인하였다. PCR에 사용한 primer의 염기서열은 아래와 같다.
- Raw 264.7 세포에서 열수 추출한 여러 한약재를 마우스 대식세포인 Raw 264.7 세포에 먼저 1시간동안 전처리하고 50 ng/ml LPS를 24시간 동안 처리한 후 Griess 반응으로 NO 생성을 측정하였다. Fig.
- Raw 264.7 세포주로부터 생성된 NO의 양은 세포 배양액 중에 NO2'^ 형태로서 존재히고 이것을 Griess (1% sulfanilamide in 5% phosphoric acid +1% N-(l-naphthyl)-ethylenediamine in HQ) 시약을 이용하여 측정하였다. 실험과정을 간략하게 설명하면 세포배양액 100 成와 Griess 시약 100 成를 혼합하여 96 well plated에서 10 분간 반응시킨 후 54施에서 ELISA reader 로 흡광도를 측정하였다.
- 7 Mis pretreated with indicated concentrations of CS, PC and BC before incubation with LPS for 24 hr. Total RNA was prepared and RT-PCR analysis was performed as described in Materials and Methods. The whole lysates were analyzed by immunoblot analysis using against iNOS and ERK antibodies.
- RNA 분리는 TRIzol를 이용하여 분리하였다. 간략하게 설명하면, 대식세포에서 RNA를 분리하기위해서 0.1% DEPC가 함유된 PBS로 세척한 후 TRIzol를 첨가하여 세포를 lysis시켰다 여기에 클로로포름을 첨가한 다음 원심 분리하여 상층액을 수확하고, isopropan이을 이용하여 RNA를 침강시킨 후 건조하여 RNA를 분리하였다. 5x RT buffer 2 双, 10mM dNTP 1 戒, MMLV reverse transcriptase (200 U/以, (Life Technologies, Inc.
- 농도에 따■른 LPS에 의한 NO 생성 억제 정도를 관찰하기 위해 모과 (10-80 飓/ml), 호장근 (10-80 姻/ml), 유향 (10-120 此 /ml)을 1시간동안 전처리한 후 50 ng/ml LPS를 12 시간 또는 24 시간 동안 처리하여 NO 생성을 측정하였다. Fig.
- 단백질은 전기영동한 후 Immobilon-P membranes으로 transfer 하였다. 단백질의 검출은 ECL Western blotting kit (Amersham, USA)를 사용하여 검출하였다.
- 그결과 木瓜, 虎杖根 및 乳香에서 주출된 산물이 LPS에 의해 유도된 NO의 생성을 억제하는 것을 관찰 하였다 또한 이러한 NO의 증가는 木瓜, 虎杖根 및 乳香의 농도가 증가함에 따라 NO의 생성이 농도 의존적으로 감소하였다. 이러한 LPS에 의해 유도된 NO 생성을 억제하는 기전을 규명하기 위해서 iNOS와 COX-2의 mRNA 및 단백질 발현을 조사하였다. 木瓜, 虎杖根 및 乳 香에서 열수 추출된 산물은 LPS에 의해 유도된 iNOS의 mRNA 와 단백질의 발현을 감소시켰다.
대상 데이터
- 7 세포주를 ATCC (Livingstone, MT, USA)로부터 분양받아 2 mM glutamine이 함유된 DMEM 배지에 10% FBS, 100 U/ml penicillin 및 100 瓯 /ml streptomycin을 첨가한 배지에서 배양하여 실험에 사용하였다. 20 passage를 넘기지 않은 세포만 실험에 사용하였다. iNOS, COX-2 및 ERK antibody 는 Santa cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)로 구입하여 사용하였다.
- LPS (E.coli 026:B6, Difco, Detroit, MI, USA)는 Sigma (St. Louis, MOZ USA)에서 구입히였고, fetal bovine serum (FBS) 및 antibiotics 는 Gibco-BRL (Eggenstein, Germany)로부터 구입하여 사용하였다
- 20 passage를 넘기지 않은 세포만 실험에 사용하였다. iNOS, COX-2 및 ERK antibody 는 Santa cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)로 구입하여 사용하였다.
- 마우스 대식세포주인 Raw 264.7 세포주를 ATCC (Livingstone, MT, USA)로부터 분양받아 2 mM glutamine이 함유된 DMEM 배지에 10% FBS, 100 U/ml penicillin 및 100 瓯 /ml streptomycin을 첨가한 배지에서 배양하여 실험에 사용하였다. 20 passage를 넘기지 않은 세포만 실험에 사용하였다.
- 본 연구에 사용한 木瓜, 虎杖根 및 乳香을 포함한 한약재들은 대구한의대학교 附屬 韓方病院에서 구입하였고, 良質의 것을 精選하여 열수 추출한 후 상층액 만을 취하여 0.2^ filter (Nalgen, New York, USA)로 여과하였다. 여과액을 rotary evaporator (EYELA, Tokyo, Japan)로 동결건조하고 사용할 때까지 -20 ℃ 에 보관하면서 사용하였다.
이론/모형
- 木瓜, 虎杖根 및 乳香에 의한 LPS로 유도된 COX-2의 발현억제기 전을 규명하기 위하여 RT-PCR 및 Western blotting 법을 이용하여 COX-2의 발현을 분석하였다. LPS를 처리하였을 경우 COX-2의 mRNA 및 단백질 발현이 강하게 유도되었다.
- 木瓜, 虎杖根 및 乳香에 의한 LPS로 유도된 NO 생성억제기 전을 규명하기 위하여 RT-PCR 및 Western blotting법을 이용하여 NO의 생성에 관여하는 iNOS의 mRNA 및 단백질의 발현을 분석하였다. 50 ng/ml LPS를 처리하였을 경우 iNOS의 mRNA 및 단백질 발현이 강하게 유도되었다.
성능/효과
- 7 세포에 먼저 1시간동안 전처리하고 50 ng/ml LPS를 24시간 동안 처리한 후 Griess 반응으로 NO 생성을 측정하였다. Fig. 1에서 보는 바와 같이 LPS에 의해 NO의 생성이 대조군에 비해 2.5배 정도 증가 하였고, 처리한 여러가지 한약재 중에서 木瓜, 虎杖根 및 乳香 등이 LPS에 의해 유도되는 NO의 생성을 가장 많이 억제하는 것을 관찰하였다.
- 시간 동안 처리하여 NO 생성을 측정하였다. Fig. 2에서 보는 바와 같이 모과 40 您/讪이상의 농도에서 LPS를 처리했을 때 NO의 생성이 억제되는 것을 관찰하였고, 虎杖根과 乳香은 木瓜 에 비해 상대적으로 낮은 농도인 10 陽/ml의 농도부터 농도 의존적으로 LPS에 의한 NO의 생성억제효과를 보였다. 또한 NO 생성의 억제효과는 12 시간 보다 24시간 LPS를 처리했을 때 보다 높은 것을 알 수 있었다.
- 木瓜, 虎杖根 및 乳 香에서 열수 추출된 산물은 LPS에 의해 유도된 iNOS의 mRNA 와 단백질의 발현을 감소시켰다. iNOS의 발현을 억제하는 木瓜, 虎杖 根 및 乳香 중에서 乳香이 가장 낮은 농도에서 효과적으로 iNOS의발현을 저해함을 알 수 있었다. 반면에 LPS에 의해 유도된 COX-2 의 발현은 木瓜, 虎杖根 및 乳香 등에 의해서 영향을 받지 않음을 관찰하였다.
- 50 ng/ml LPS를 처리하였을 경우 iNOS의 mRNA 및 단백질 발현이 강하게 유도되었다. 木瓜, 虎杖根 및 乳香에의해서 농도 의존적으로 iNOS의 mRNA와 단백질 발현양이 감소되는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 3). 이러한 결과를 종합하여보면 木瓜, 虎杖根 및 乳香에 의해 LPS로 유도되는 NO의 생성을 억제하는 것은 iNOS의 발현조절과 깊은 관련이 있으며, 木 瓜, 虎杖根 및 乳香 등은 LPS에 의한 iNOS의 발현의 증가를 mRNA의 합성단계에서 억제하는 전사조절 단계에서 조절한다는 것을 알 수 있었다.
- 본 연구에서는 열수 주출된 여러가지 한약재 중에서 lipopolysaccharide (LPS)에 의해 유도된 NO의 생성을 억제하는 한약재를 탐색하였다. 그결과 木瓜, 虎杖根 및 乳香에서 주출된 산물이 LPS에 의해 유도된 NO의 생성을 억제하는 것을 관찰 하였다 또한 이러한 NO의 증가는 木瓜, 虎杖根 및 乳香의 농도가 증가함에 따라 NO의 생성이 농도 의존적으로 감소하였다. 이러한 LPS에 의해 유도된 NO 생성을 억제하는 기전을 규명하기 위해서 iNOS와 COX-2의 mRNA 및 단백질 발현을 조사하였다.
- 2에서 보는 바와 같이 모과 40 您/讪이상의 농도에서 LPS를 처리했을 때 NO의 생성이 억제되는 것을 관찰하였고, 虎杖根과 乳香은 木瓜 에 비해 상대적으로 낮은 농도인 10 陽/ml의 농도부터 농도 의존적으로 LPS에 의한 NO의 생성억제효과를 보였다. 또한 NO 생성의 억제효과는 12 시간 보다 24시간 LPS를 처리했을 때 보다 높은 것을 알 수 있었다.
- nf-kB, AP-1z C/EBP등이 있다끼. 본 연구 결과에서 보는 바와 같이 Raw 264.7 세포에서 LPS는 iNOS 및 COX-2 의 발현을 강하게 유도하였고 이렇게 유도된 iNOS의 mRNA 및 단백질의 발현을 木瓜, 虎杖根 및 乳香 등이 억제하였지만, COX-2의 발현은 억제하지 못하였다
- 저해활성을 나타낸다고 알려져 있다. 본 연구결과에서 보여주는 바와 같이 木瓜, 虎杖根 및 乳香이 iNOS 유도단계를 억제하는 저해제들과 동일한 저해활성 경향을 나타내는 것으로 볼 때, 木瓜, 虎杖根 및 乳香은 LPS에 의해 Raw 264.7 세포가 활성화 될 때 iNOS의 전사 유도단계를 억제한다고 추정 할 수 있었다.
- 이러한 결과를 종합하여 보면 木瓜, 虎杖根 및 乳香 등이 LPS에 의한 iNOS mRNA 전사를 조절하는 전사조절인자 NF-kB, AP-1Z C/EBP 중 promoter에 binding하는 활성을 저해하거나 발현량을 감소시켜 iNOS의 mRNA 및 단백질의 합성을억제시키는 것으로 생각된다. 지금까지 알려진 바로는 iNOS의 promoter 부위에 존재하는 NF-kB부위가 LPS에 의해 유도되는 NO의 생성에 관여한다고 보고 되었다끼.
- 3). 이러한 결과를 종합하여보면 木瓜, 虎杖根 및 乳香에 의해 LPS로 유도되는 NO의 생성을 억제하는 것은 iNOS의 발현조절과 깊은 관련이 있으며, 木 瓜, 虎杖根 및 乳香 등은 LPS에 의한 iNOS의 발현의 증가를 mRNA의 합성단계에서 억제하는 전사조절 단계에서 조절한다는 것을 알 수 있었다.
후속연구
- 본 연구에서 NO의 생성을 억제한다고 관찰된 木瓜, 虎杖根 및 乳香의 어떠한 성분이 LPS에 의해 유도되는 NO의 생성을 억제하는지 또한 어떠한 기전을 통해 억제하는지는 연구가 더 진행 되어야 할 것으로 생각된다.
- 반면에 LPS에 의해 유도된 COX-2 의 발현은 木瓜, 虎杖根 및 乳香 등에 의해서 영향을 받지 않음을 관찰하였다. 이러한 결과를 종합하여 보면 木瓜, 虎杖根 및 乳香 등에서 열수추출된 산물은 iNOS의 발현을 조절하여 NO 생성량을 조절하여 LPS에 의해 유발되는 항염증반응을 조절하므로 염증반응에 관련된 면역치료제로 활용할 수 있음을 시사한다.
- 지금까지 알려진 바로는 iNOS의 promoter 부위에 존재하는 NF-kB부위가 LPS에 의해 유도되는 NO의 생성에 관여한다고 보고 되었다끼. 추후 NF-kB luciferase reporter system을 이용한 실험을 통해 木瓜, 虎杖根 및 乳香 등이 NF-kB의 promoter 활성에 영향을 주어 LPS에 의한 iNOS의발현을 억제하는지 아니면 AP-1, C/EBP등과 같은 다른 전사조절인자를 통해 iNOS의 발현을 조절하는지 검정해야 될 것으로 생각된다. 그러나, 木瓜, 虎杖根 및 乳香 등은 LPS에 의한 COX-2 의 유도를 저해하지 못하는 것으로 보아 LPS에 의한 iNOS 및 COX-2의 발현 조절은 상호 다른 전사조절인자에 의해 조절될 것이라는 가능성을 제시해 준다.
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