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문제 정의
- 본 연구는 濕熱을 제거하는 防己가 消炎, 항알러지, 解熱, 鎭 痛, 抗癌의 약리적 작용을 가지는 것에 근거하여, 防己의 추출물 (STRE; Stephanniae Tetrandrae Radix Extract)이 LPS로 활성화된 Raw 264.7 cell의 NO production, inducible nitric oxide synthase (iNOS) 와 cyclooxygenase-2 (COX-2) 발현 및 interleukin-1 P (1L-1P)Z IL-6, tumor necrosis factor-a (TNF-a) 등의 cytokine에 미치는 영향을 살펴보고자 실시하였다.
제안 방법
- 防己 (Wolsung, Daegu, Korea) 300 g을 물 9 L에 넣고 3시간 전탕한 후 추출물을 거어즈로 1차 여과하고 3000xg에서 3분간 원심분리하고, 상층액만을 취하여 0.2 ㎛ filter (Nalgene, New York, NY, USA)로 여과하였다. 이를 freezer dryer (EYELA, Tokyo, Japan)로 동결건조하고 사용 때까지 -20 ℃에서보관하였다.
- Raw 264.7 cells을 96 well plate에 5><103 4 * cells/well로 분주한 다음 STRE를 농도별로 처치하여 세표의 생존율을 구하였다. 세포에 0.
- Raw 264.7 세포주로부터 생성된 nitric oxide (NO)의 양은 세포 배양액 중에 존재하는 NO』의 형태로서 Griess 시약을 이용하여 측정하였다. 간략하게 설명하면 세포배양 상등액 100 以와 Griess시약 (1% sulfanilamide in 5% phosphoric acid + 1% a -naphthylamide in HQ) 100 成를 혼합하여 96well plates에서 1。분 동안 반응시킨 후 540 nm에서 Titertek Multiskan Automatic ELISA microplate reader (Model MCC/340, Huntsville, AL)로 흡광도를 측정하였다.
- 5), 1% Triton X-100, 137 mM sodium chloride, 10 % glycerol, 2 mM EDTA, 1 mM sodium orthovanadate, 25 mM b-glycerophosphatez 2 mM sodium pyrophosphate, 1 mM phenylmethylsulfonylfluorideal]- 1 mg/ml leupeptin-g- 함유하는 buffei를 사용하여 c이1을 lysis 시켰다 Cell lysates를 IQOOOxg로 10분간 원심분리하여 debris를 제거하였다. iNOS와 COX-2의 발현은 antimouse iNOS, COX-2 antibodies# 사용하여 면역화학적 방법으로 분석하였다. 2차 antibody 는 alkaline phosphatase conjugated anti-mouse 오] anti-goat antibody를 사용하였다.
- LPS 처치 후 6」2시간에 배지를 수거하여 cytokine 을 측정하였다. 수거된 배지는 측정전까지 -70 ℃에서 보관하였다.
- 수거된 배지는 측정전까지 -70 ℃에서 보관하였다. TNFq IL-1B와 IL-6 는 ELISA Kit (Pierce endogen, Rockford, IL, USA)를 사용하여 측정하였으며, 실험의 방법은 manufacturer's instruction에 따럇云다.
- Raw 264.7 c이1에서 STRE의 NO 생성억제정도를 관찰하기 위하여 STRE를 0.1-3.0 mg/畝의 농도로 세포에 처리하여 생성되는 NO양을 측정하였다. LPS군에서는 control군에 비교하여 NO 의 생성량이 LPS의 농도 및 시간 의존적으로 증가하였으며, STRE를 0.
- STRE가 1.0 및 3.0 mg/畝 (6 h, 12 h, 18 h, 24 h)의 농도에서 LPS로 유도된 NO의 생성을 감소시킨 결과가, STRE의 세포독성으로 인한 cell population의 저하에서 기인하였는지를 관찰하기 위하여 STRE의 농도별 시간별 정도에 띠라, MTT assay를 실시하여 cell viability# 측정하였다. 실험결과 STRE의 1.
- NO 생성 억제기작에 관련된 iNOS단백질의 발현량을 관찰하기 위하여 immunoblot analysis를 이용하여 세포질내에서의 iNOS단백질의 발현량을 조사하였다. LPS처치시에는 iNOS 단백질이 강하게 유도되었으나, LPS에 STRE 1.
- IL-6의 levele 염증병소에서 항상 증가하는 것으로 알려져 있다히. 본 실험에서 LPS는 IL-6의 분비를 유의성 있게 증가시켰으며, STRE 1.0 및 3.0 ing/inee LPS로 유도된 Ⅱ.-6 를 농도의존적으로 유의성있게 감소시켰으며, 특히 3.
- Raw 264.7 cell에서 STRE의 NO 생성억제정도를 관찰하기 위하여 STRE를 0.1-3.0mg/ml5] 농도로 세포에 처리하여 생성되는 NO양을 측정하였다. LPS군에서는'control군에 비교하여 NO 의 생성량이 LPS농도 의존적으로 증가하였으며, STRE를 0.
- 0 mg/mC을 처리한 실험군에서는 18 h 및 24 h에서 유의한 NO생성억제를 나타내었다. STRE가 1.0 및 3.0 mg/m« (18 h, 24 h)의 농도에서 LPS로 유도된 NO의 생성을 감소시킨 것이, STRE 의 세포독성으로 인한 cell population의 저하에서 기인하였는지를 관찰하기 위하여, STRE 의 농도별 시간별 정도에 따라, MTT assay를 실시하여 cell viabilitye 측정하였다. 실험결과 STRE의 1.
- NO 생성 억제 기작에 관한 iNOS단백질의 관련성을 조사하기 위하여 immunoblot analysis를 이용하여 세포질내에서의 iNOS단백질의 발현량을 조사하였다. LPS처치시에는 iNOS 단백질이 강하게 유도되었으나, LPS에 STRE 1.
- 防己 추출물 (STRE)이 LPS로 활성화된 Raw 264.7 cell의 NO 생성량, iNOS, COX-2발현 및 IL-1P, IL-6, TNF-a 등의 cytokine 에 미치는 영향을 살펴본 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
대상 데이터
- Murine macrophage cell line인 Raw 264.7 cellse 한국세포주연구재단 (서울)에서 구입하였으며, Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)에 10 % fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin 및 100 pg/ml streptomycin을 혼합한 배지를 사용하여 37 ℃, .5 % CO2 incubator■에서 배양하였다. 실험과정의 모든 cellse 80-90 %의 confkiency에서 실험하였고, 20 passages 를 넘기지 않은 cell만 사용하였다.
- 5 % CO2 incubator■에서 배양하였다. 실험과정의 모든 cellse 80-90 %의 confkiency에서 실험하였고, 20 passages 를 넘기지 않은 cell만 사용하였다.
- LPS (lipopolysac난taride)와 MTT (3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5 -diphenyltetrazoleum)는 Sigma (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였고, fetal bovine serum (FBS) 과 antibi어ics는 Gibco/BRL (Eggenstein, Germany)로부터 구입하였으며, Antibody는 BD Bioscience (USA), Cayman (USA), Zymed (USA)에서 구입하였고, NC paper는 Schleicher & Schuell (USA)에서 구입하였다. TNF-a, IL-10와 IL-6의 ELISA Kit는 Pierce endogen (Rockford, IL, USA)에서 구입하였다.
- Louis, MO, USA)에서 구입하였고, fetal bovine serum (FBS) 과 antibi어ics는 Gibco/BRL (Eggenstein, Germany)로부터 구입하였으며, Antibody는 BD Bioscience (USA), Cayman (USA), Zymed (USA)에서 구입하였고, NC paper는 Schleicher & Schuell (USA)에서 구입하였다. TNF-a, IL-10와 IL-6의 ELISA Kit는 Pierce endogen (Rockford, IL, USA)에서 구입하였다.
데이터처리
- 실험 결과는 mean士S.D로 나타내었으며, t-test의 통계처리 방법으로 통계적 유의성 검정을 조사하였다. 유의수준은 p<0.
이론/모형
- 2차 antibody 는 alkaline phosphatase conjugated anti-mouse 오] anti-goat antibody를 사용하였다. iNOS와 COX-2 protein의 band는 ECL western blotting detection reagents (Amer sham)를사용하여 manufacturer's instruction에 따라 발색하였다.
성능/효과
- 0 mg/畝의 농도로 세포에 처리하여 생성되는 NO양을 측정하였다. LPS군에서는 control군에 비교하여 NO 의 생성량이 LPS의 농도 및 시간 의존적으로 증가하였으며, STRE를 0.1-0.3 mg/ni£ 처치한 실험군에서는 LPS로 유도된 NO 의 분비증가를 억제하지 못하였으며, STRE 1.0과 3.0 mg/r旭을 처리한 실험군에서는 18 h 및 24 h에서 유의한 NO생성억제를 나타내었다 (Fig. 1).
- 0 mg/畝 (6 h, 12 h, 18 h, 24 h)의 농도에서 LPS로 유도된 NO의 생성을 감소시킨 결과가, STRE의 세포독성으로 인한 cell population의 저하에서 기인하였는지를 관찰하기 위하여 STRE의 농도별 시간별 정도에 띠라, MTT assay를 실시하여 cell viability# 측정하였다. 실험결과 STRE의 1.0 및 3.0 mg /戒농도는 6-18시간 동안 LPS군에 비교하여 유의한 세포 독성을 나타내지 않았다 (Fig. 2). 이러한 결과는 STRE에 NO의 생성 억제효능이 있음을 시사하는 결과이다.
- 또한, Prooxidant나 TPA, LPS, TNF-a 등의 proinflammatory stimuli에 의해 MEKK-L NFkB의 활성화를 경유하여 생성되는 COX-2는 prostaglandin synthesis를 증가시켜 염증반응에 있어서 중추적 역할을 한다22, 23). 본 실험에서 LPS 처치시에는 COX-2 단백질이 강하게 유도되었으나, LPS에 STRE 1.0 mg/畝을 처치한 실험군에서는 COX-2의 량이 줄어들었으며, STRE 3.0 mg/戒을 처리한 실험군에서는 COX-2의 량이 현저히 감소하여, STRE는 농도 의존적으로 COX-2 단백질의 량을 감소시킴을 관찰할 수 있었다.
- 중요한 역할을 한다约. Macrophage와 mast c이1에서 분비되는 TNF-a는 tumor c이1에 세포독성을 나타내며, 만성염증성 반응과 관련되어 있다气 본 실험에서 LPS는 TNF-q의 분비를 유의성 있게 증가시켰고, STRE 1.0 및 3.0 mg/被은 LPS로 유도된 TNF-a를 농도 의존적으로 유의성있게 감소시켰다. 특히 3.
- 2次). 본 실험에서 LPS는 IL-고의 분비를 유의성있게 증가시켰으며, STRE 3.0 mg/i此은 LPS로 유도된 를 유의성있게 감소시켰다. 그러나 STRE 1.
- 0 mg/m« (18 h, 24 h)의 농도에서 LPS로 유도된 NO의 생성을 감소시킨 것이, STRE 의 세포독성으로 인한 cell population의 저하에서 기인하였는지를 관찰하기 위하여, STRE 의 농도별 시간별 정도에 따라, MTT assay를 실시하여 cell viabilitye 측정하였다. 실험결과 STRE의 1.0 및 3.0 mg/畝 농도는 6-24시간 동안 유의한 세포독성을 나타내지 않았다. 이러한 결과는 STRE이 어떠한 경로로든 NO의 생성 억제에 연루되어있음을 시사하는 결과이다.
- 발현량을 조사하였다. LPS처치시에는 iNOS 단백질이 강하게 유도되었으나, LPS에 STRE 1.0 mg/i戒을 처치한 실험군에서는 iNOS의 량이 줄어들었으며, STRE 3.0 mg/戒을 처치한 실험군에서는 iNOS의 량이 더욱 현저히 감소하여, LPS와 STRE를 동시처리시 STRE 농도 의존적으로 iNOS단백질의 량이감소되는 것을 관찰할 수 있었다. STRE단독으로는 1.
- 또 Monocyte에서 COX-2의 발현은 proinflammatory agent 인 IL-lpz TNF-a 와 LPS, fibroblast growth factor등에 의해서 증가하고, glucocorticoid와 IL-4, IL-13에 의해 발현억제가 유도된다ML 그러므로 COX-2에 선택적인 inhibitor의 개발은 염증의 치료의 target molecule이 되고 있다的. 본 실험에서는 LPS 처치시에 COX-2 단백질이 강하게 유도되었고, LPS에 STRE 1.0 및 3.0 mg/m2은 LPS로 유도된 COX-2를 농도의존적으로 감소시켰다.
- Macrophage와 mast c이1에서 분비되는 TNF-a는 tumor cell에 세포독성을 나타내며, 만성염증성 반응과 관련되어 있다히. 본 실험에서 LPS는 TNF-a 의 분비를 촉진시켰고, STRE 1.0 및 3.0 mg/mle LPS로 유도된 TNF-a를 농도 의존적으로 유의성있게 감소시켰다.
- 또한 이은 septic shock36', bum 明, 간이식 수술 후의 ischemia-reperfusion injurye>의 경우에 prostaglandins, leukotrienes/ platelet-activating factor, nitric oxide등의 매개 물질합성을 증가시켜 염증반응을 나타낸다對. 본 실험에서 LPS는 IL-10의 분비를 유의성있게 증가시켰으며, STRE 3.0 mg/mle LPS로 유도된 IL-고를 유의성있게 감소시켰다. 그러나 Ⅱ.
- -고의 감소가 STRE 의 농도에 의존적이지는 않았다 Monocyte 나 macrophage에서 분비되는 또 다른 cytokine인 IL-6 는, B-cello] plasma cell로 분화되는 마지막 단계를 활성화시키고, antobody 의 분비를 촉진하는 것으로, IL-6의 lev이은 염증병소에서 항상 증가하는 것으로 보고되고 있다25). 본 실험에서 LPS는 IL-6의 분비를 유의성있게 증가시켰으며, STRE 1.0 및 3.0 mg/mle LPS 로 유도된 IL-6를 농도 의존적으로 유의성있게 감소시켰다.
- 0 mg/戒을 처리한 실험군에서는 18 h 및 24 h에서 유의한 NO 생성억제를 나타내었다. NO를 억제하는 농도인 STRE 1.0 및 3.0 mg/圳농도는 실험기간동안 LPS군에 비교하여 유의한 세포독성을 나타내지 않았다. STRE는 1.
- 0 mg/m£ 의 농도에서만 유의한 억제를 나타내었다. 특히 3.0 nig/砒의 STRE는 LPS로 유도된 이들 proinflammatory cytokine의 증가를 완벽하게 억제하였다.
- 발현량을 조사하였다. LPS처치시에는 iNOS 단백질이 강하게 유도되었으나, LPS에 STRE 1.0 mg/叫을 처치한 실험군에서는 iNOS의 량이 줄어들었으며' STRE 3.0 mg/戒을 처치한 실험군에서는 iNOS의 량이 더욱 현저히 감소하여, STRE는 농도 의존적으로 iNOS단백질의 량을 감소시킴을 관찰할 수 있었다. 또한, Prooxidant나 TPA, LPS, TNF-a 등의 proinflammatory stimuli에 의해 MEKK-L NFkB의 활성화를 경유하여 생성되는 COX-2는 prostaglandin synthesis를 증가시켜 염증반응에 있어서 중추적 역할을 한다22, 23).
후속연구
- 이러한 결과들은 防己가 gram-negative bacterial infection에 의한 염증질환 또는, 과량의 NO 및 과량의 cytokine생성으로 유도된 면역질환의 치료에 활용될 수 있음을 시사한다.
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