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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 발아길이별 메밀싹의 생리활성 변화를 확인하기 위해서 발아길이별 메탄{{= match }} 추출물에 대한 항산화 효과와 항미생물 활성 그리고 세포독성의 효과를 검정하였다. 이러한 생리활성을 구명함으로써 건강기능성 식품 제조용 신소재나 천연물질 생산원료 및 의약품 신소재 개발의 기초자료를 제공함으로써 발아메밀의 이용성을 높이는 데 기여하고자 하였다.
- 검정하였다. 이러한 생리활성을 구명함으로써 건강기능성 식품 제조용 신소재나 천연물질 생산원료 및 의약품 신소재 개발의 기초자료를 제공함으로써 발아메밀의 이용성을 높이는 데 기여하고자 하였다.
제안 방법
- M DPPH 용액을 180 |iL씩 96 well plate에 분주하고, 여기에 1, 10, 50, 100, 200μg/mL으! 농도로 제조한 시료를 20rL씩 첨가하여 최종 반응용액이 200{{= match }}가 되도록 하였다. 30분 동안 반응시킨 후 ELISA reader (Bio-Tek, USA> 사용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하여 DPPH의 환원에 의한 흡광도 감소 를 조사하였고, 무발아구와 발아 길이별 구의 값을 비교하여 free radical 소거 활성을 검정하였다. Free radical 소거 활성은 DPPH의 50%를 환원시키는 데 필요한 시료의 양({{= match }})을 RC50으로 나타냈으며, 기존의 항산화제로 많이 이용되고 있는 Vit.
- Free radical 소거 활성은 DPPH의 50%를 환원시키는 데 필요한 시료의 양({{= match }})을 RC50으로 나타냈으며, 기존의 항산화제로 많이 이용되고 있는 Vit. C, butylated hydroxytoluene (BHIQ와발아 길이 별 메밀의 항산화 활성을 비교하였다.
- 사용하였다. Calu-6, MCF-7 및 SNU-601은 RPMI 1640 배지를 이용하였고, Caco-2는 DMEM 배지를 이용하였으며 56{{= match }}C에서 30분간 열처리된 FBS 10%와 항생제(antibioticantimycotic)을 함유한 각각의 복합배지를 사용하여 3TC, 5% {{= match }}의 습윤화된 배양기내에서 적응시켜 배양하였으며, 이 때 배지는 2{{= match }}3일에 한 번씩 교환하였다.
- MTT 분석에 의한 세포 생존율 측정: 발아메밀의 길이별 추출물에 의한 농도의존적 세포생육의 저해효과는 MTT 방법 (Dnizot and Rita, 1986)을 약간 변형하여 분석하였다. 종양세포를 2~4xl04cells/mL의 농도가 되도록 조절한 후 96 well microplate에 90 pL/well씩 분주하고 37{{= match }}C, 5% CO2 세포배양기에서 12시간 배양하여 세포를 부착시킨 다음 50, 100, 200, 400, 800 {{= match }}mL 농도의 시료를 10 {{= match }}L씩 첨가하였다.
- Paper disc 방법으로 발아길이 2 nn, 5 mm, 10 mm 의 메밀과 발아시키지 않은 메밀을 대조군으로 하여 메탄올로 추출한 다음 각종 식품 부패 및 식중독에 관련된 그람양성균 2종과 그람 음성균 3종에 대한 항균력을 테스트하였다. 그 결과 Table 2 에 나타낸 바와 같이 발아길이 중각 추출물의 최고농도 40nig/mL에서 5종의 균주에 대한 항균 활성은 그람 양성균인 S.
- 이와 같이 시료가 첨가된 well plate를 72시간 동안 배양시킨 후, MTT 용액을 각 well당 10pL씩 넣고 세포 배양기에서 4시간 동안 반응시킨 후, MTT 용액을 제거하 고 DMSO 150|iL를 첨가하여 각 세포를 용해시켜 microplate reader (Bio-Rad, USA)를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 세포의 시료 무첨가군을 100%로 하{{= match }} 상대적인 세포 성장율을 측정하였다.
- 메밀 종자가 발아하기 시작하면 발아길 이 별로 각각 2 mm, 5 mm, 10 m 로 분 리한 시료를 추출에 적합하도록 분말화하여 시료 중량 10 배의 메탄올을 첨가하고 40{{= match }}C에서 5{{= match }}6시간 추출한 후, 여과하여 감압농축기를 사용하여 추출용매를 제거한 후 동결 건조시킨 다음 실험에 사용하였다.
- , 2004; Park, 2001).메밀의 경우 플라보노이드 계통인 rutin 성분의 항균 활성에 관한 연구 (Rym et al., 1996)가 일부 이루어진 바 있으나, 그 외에 수행된 연구는 거의 없는 실정이므로 본 실험에서는 메밀의 발아단계별 항미생물 활성 테스트를 실시하였다.
- 발아메밀의 길이별 추출물을 각각 50, 100, 200, 400, 800 Ug/mL의 농도가 되도록 Calu-6, SNU-601, MCF-7 및 Caco-2, 의암세포주에 첨가하여 72시간 배양한 후에 나타난 암세포의 증식능을 측정하였다. 그 결과 Table 3과 Fig.
- , USA)로 여과하여 제균한 다음 멸균된 filter paper disc (Toyo roshi kaisha, 8 {{= match }})에 50 {{= match }}[/씩 흡수시킨 후, 추출용매를 무균적으로 풍건하여 완전히 제거한 다음 각각의 균생육적온에서 2478시간 동안 배양 후 paper disc 주변의 투명 저지대의 직경(mm)을 측정히.여 항균 활성을 비교하였다. 이때 각 시료를 녹이기 위해 사용한 용매 및 계면활성제에 대한공실험을 실시하였다.
- 여 항균 활성을 비교하였다. 이때 각 시료를 녹이기 위해 사용한 용매 및 계면활성제에 대한공실험을 실시하였다.
- 종양세포를 2~4xl04cells/mL의 농도가 되도록 조절한 후 96 well microplate에 90 pL/well씩 분주하고 37{{= match }}C, 5% CO2 세포배양기에서 12시간 배양하여 세포를 부착시킨 다음 50, 100, 200, 400, 800 {{= match }}mL 농도의 시료를 10 {{= match }}L씩 첨가하였다. 이와 같이 시료가 첨가된 well plate를 72시간 동안 배양시킨 후, MTT 용액을 각 well당 10pL씩 넣고 세포 배양기에서 4시간 동안 반응시킨 후, MTT 용액을 제거하 고 DMSO 150|iL를 첨가하여 각 세포를 용해시켜 microplate reader (Bio-Rad, USA)를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다.
- , 1996).즉, 10, 20, 30, 40n{{= match }}mL 농도의 메탄올 추출물을 0.45 {{= match }}in membrane filter (Millipore Co., USA)로 여과하여 제균한 다음 멸균된 filter paper disc (Toyo roshi kaisha, 8 {{= match }})에 50 {{= match }}[/씩 흡수시킨 후, 추출용매를 무균적으로 풍건하여 완전히 제거한 다음 각각의 균생육적온에서 2478시간 동안 배양 후 paper disc 주변의 투명 저지대의 직경(mm)을 측정히.여 항균 활성을 비교하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 메밀은 2004년도에 전남 나주시 노안면에서 재배한 것으로써 풍건, 석발, 정선 과정을 거쳐서 종실이 충실한 것을 선별하여 물에 12시간 침지후 30{{= match }}C, 상대습도 90%에서 24시간마다 물을 살포하면서 발아시켰다. 메밀 종자가 발아하기 시작하면 발아길 이 별로 각각 2 mm, 5 mm, 10 m 로 분 리한 시료를 추출에 적합하도록 분말화하여 시료 중량 10 배의 메탄올을 첨가하고 40{{= match }}C에서 5{{= match }}6시간 추출한 후, 여과하여 감압농축기를 사용하여 추출용매를 제거한 후 동결 건조시킨 다음 실험에 사용하였다.
- 종양세포 배양 : 실험에 사용된 암세포주는 모두 인체 기원의 암세포 주들로서 , 폐 암세포주인 Calu-6, 유방암세 포주인 MCF-7 및 위암 세포주인 SNU-601, 그리고 대장 임세포주인 Caco-2 를 사용하였다. Calu-6, MCF-7 및 SNU-601은 RPMI 1640 배지를 이용하였고, Caco-2는 DMEM 배지를 이용하였으며 56{{= match }}C에서 30분간 열처리된 FBS 10%와 항생제(antibioticantimycotic)을 함유한 각각의 복합배지를 사용하여 3TC, 5% {{= match }}의 습윤화된 배양기내에서 적응시켜 배양하였으며, 이 때 배지는 2{{= match }}3일에 한 번씩 교환하였다.
이론/모형
- 메밀의 발아길이별 추출물의 in 에서의 세포독성을 규명하기 위해 대장암(Caco-2, {{= match }}{{= match }}), 폐암(Calu-6), 유방암 (MCF-7) 및 위암(SNU-601) 등의 인체 암세포주를 이용하여 세포 생존율을 MTT 방법 (Dnizot and Rita, 1986){{= match }}로 조사하였다.
- 메밀의 발아길이별 추출물의 항균 활성 검색은 disc 한천배지 확산법으로 측정하였다 (Bauer et al., 1996).즉, 10, 20, 30, 40n{{= match }}mL 농도의 메탄올 추출물을 0.
- 항산화 활성은 DPPH법 (Brand-Wiliams et al., 1995) 에의하여 시료의 free radical 소거능을 측정했다.즉.
성능/효과
- 각각의 추출물에 의한 폐암 세포 Calu-6의 항암효과는 실험 최고 농도인 800/zg/mL에서 발아길이 5 mm 의 경우 95.12% 의 높은 사멸 효과를 나타내었고, 무발아 추출물과 발아 길이 10 mm 추출물의 경우도 80% 이상의 높은 억제 효과를 보였다. 위암세포인 SNU-601에 대한 세포독성 효과는 Calu-6세포주에대한 결과와 유사한 양상을 보였지만, 메밀의 발아길이에 따른 암세포 억제 효과는 SNU-601 세포에서 보다 Calu-6세포에서 그 효과가 훨씬 크게 나타났다.
- 각종 식품 부패 및 식중독에 관련된 그람양성균 2종과 그람 음성균 3종에 대한 항균력을 테스트하였다. 그 결과 Table 2 에 나타낸 바와 같이 발아길이 중각 추출물의 최고농도 40nig/mL에서 5종의 균주에 대한 항균 활성은 그람 양성균인 S. aureuse: 4{{= match }}10 mm, 그람 음성균인 P. aeruginosae 2{{= match }}9 min 였으며, 그 외의 다른 균주에서는 활성을 나타내지 않았다.
- 증식능을 측정하였다. 그 결과 Table 3과 Fig. 2어서 보는 바와 같이 전반적으로 메밀 추출물의 첨가량이 많아질 수록증식억제 효과가 더 뚜렷함을 알 수가 있었다.
- 그 결과 농도 의존적으로 항산화 효과가 증가함을 알 수 있었다. 각 추출물의 최고 농도인 200μg/mL에서 무발아 시료는 87.
- 그리고 그람음성균보다 그람 양성균에 대한 항균 효과가 더 높게 나타났다. 이는 Nakamura 등(1991)도 보고한 바와 같이 그람양성균의 세포벽은 peptidoglycan이 표면에 노출되어 항균 활성 물질의 공격을 받기 쉽지만 그림 음성균은 lipopolysaccharidee-주성분으로 하는 외막이peptidoglycan을 보호하는 작용을 하기 때문이라고 사료된다.
- aeruginosefie 대한결과를 보면, 10 mg/mL 와 20 mg/mL농도에서는 무발아 추출물만이 각각 2 mm와 4 mm 로 나타났고, 30 mg/mL와 40 mg/mL 농도에서는 무발아 추출물이 각각 8 mm, 9 mm로 다른 처리구에 비해 상대적으로 항미생물 효과가 높게 나타났다. 따라서 메밀은 발아가 진행 될수록 항균력이 떨어지는 것을 알 수 있었다. 다른 천연물들의 그람양성균과 그람 음성균의 항균 효과는 정향 (Lee et al.
- 그러나 발아길이 lOmni에서는 활성을 보이지 않았다. 또한 P. aeruginosefie 대한결과를 보면, 10 mg/mL 와 20 mg/mL농도에서는 무발아 추출물만이 각각 2 mm와 4 mm 로 나타났고, 30 mg/mL와 40 mg/mL 농도에서는 무발아 추출물이 각각 8 mm, 9 mm로 다른 처리구에 비해 상대적으로 항미생물 효과가 높게 나타났다. 따라서 메밀은 발아가 진행 될수록 항균력이 떨어지는 것을 알 수 있었다.
- 또한, 메밀의 발아길이에 따른 암세포주 50%를 사멸하는데 필요한 세포 성장 저해농도 (IC50)는, Calu-6에서 발아 5 mm (301.06 μg/mL)> 발아 10 mm (306.48 μg/mL) > 무발아 (513.66 μg/mL)> 발아 2 mm (537.49 Ag/mL) 순으로 나타나 발아길이 5 {{= match }}오{{= match }} 10 mm에서 310 {{= match }}/mL 이하의 낮은 농도에서 세포독성을 보였으며, SNU-601 에서는 2 mm 추출물이 510.20-657.79 μg/mL로 다른 추출물에 비해 탁월한 효과를 보였다. 즉, Calu-6와 SNU-601 세포주에 대한 {{= match }}{{= match }}은 대조군에 비해 발아에 의하여 세포독성 효과가 증가되었지만, MCF-7와 Caco-2의경우에서는 항암효과가 없는 것으로 나타났다.
- 위암세포인 SNU-601에 대한 세포독성 효과는 Calu-6세포주에대한 결과와 유사한 양상을 보였지만, 메밀의 발아길이에 따른 암세포 억제 효과는 SNU-601 세포에서 보다 Calu-6세포에서 그 효과가 훨씬 크게 나타났다. 반면, 발아길이 2 mm 의 추출물은 다른 발아 처리군에 비해서 그 효과가 아주 미약하였으나, 유방암 세포 MCF-7에 대한 증식억제 효과는 4{{= match }}6배의 높은 세포독성을 보였다. 유방암 세포인 MCF-7과 대장암세포인 Caco-2의 경우 Calu-6과 SNU-601 세포주에 비해 4가지 추출물의 효과가 모두 낮게 나타났다.
- 12% 의 높은 사멸 효과를 나타내었고, 무발아 추출물과 발아 길이 10 mm 추출물의 경우도 80% 이상의 높은 억제 효과를 보였다. 위암세포인 SNU-601에 대한 세포독성 효과는 Calu-6세포주에대한 결과와 유사한 양상을 보였지만, 메밀의 발아길이에 따른 암세포 억제 효과는 SNU-601 세포에서 보다 Calu-6세포에서 그 효과가 훨씬 크게 나타났다. 반면, 발아길이 2 mm 의 추출물은 다른 발아 처리군에 비해서 그 효과가 아주 미약하였으나, 유방암 세포 MCF-7에 대한 증식억제 효과는 4{{= match }}6배의 높은 세포독성을 보였다.
- 79 μg/mL로 다른 추출물에 비해 탁월한 효과를 보였다. 즉, Calu-6와 SNU-601 세포주에 대한 {{= match }}{{= match }}은 대조군에 비해 발아에 의하여 세포독성 효과가 증가되었지만, MCF-7와 Caco-2의경우에서는 항암효과가 없는 것으로 나타났다. 이와 같이 암세포 종류에 따라 상이한 결과를 보이는 것은 발아과정 중에 효소의 변화에 의해 생성된 2차 대사물질이 효과일 것으로 추측되며, 앞으로 이에 대한 보다 심도 있는 연구가 필요할 것으로 생각된다.
후속연구
- 즉, Calu-6와 SNU-601 세포주에 대한 {{= match }}{{= match }}은 대조군에 비해 발아에 의하여 세포독성 효과가 증가되었지만, MCF-7와 Caco-2의경우에서는 항암효과가 없는 것으로 나타났다. 이와 같이 암세포 종류에 따라 상이한 결과를 보이는 것은 발아과정 중에 효소의 변화에 의해 생성된 2차 대사물질이 효과일 것으로 추측되며, 앞으로 이에 대한 보다 심도 있는 연구가 필요할 것으로 생각된다.
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