친환경 배 및 관행재배 배 추출물이 간세포 성장에 미치는 효과 Effects of Pear Extracts Cultured Under Conventional and Environment-friendly Conditions on Cell Proliferation in Rat Hepatocytes원문보기
Sprague-Dawley 랫트(실험용 쥐)에서 간을 적출하여 Collagen coating된 세포 배양 접시에 간세포 배양을 하여 친환경 재배 배 추출물과 일반 관행 재배 배 추출물의 간세포 기능성을 분석하였다. 3일간 적응 시킨 후 관행 재배 배 추출물과 친환경 재배 배 추출물을 농도 별(동결 건조된 $5\;{\mu}g/ml$, $20\;{\mu}g/ml$, $40\;{\mu}g/ml$) 처리하여 간세포의 에너지원인 ATP assay를 실시한 결과 관행 재배 배 추출물의 경우는 대조군과 유의한 차이는 인정이 되지 않았으나 친환경 재배 배 추출물의 경우 농도 의존적으로 정상군에 비해 180%까지 증가하는 것으로 나타났다. 한편 세포 성장의 경우도 DNA의 특유 염기 구성성분중의 하나인 thymine의 전구체인 $[^3H]$-thymidine을 간세포에 처리하여 DNA 합성을 알아본 결과 친환경 재배 배 추출물 을 농도별로 처리하였을 때 관행재배 배 추출물에 비해 간세포의 세포 성장율이 증가하는 것으로 나타났다($40\;{\mu}g/ml$ 투여 시 관행 재배 배추출물 112% vs. 친환경 재배 배 추출물은 234%; p<0.05). 아울러 세포성장 단백질인 CDK-2, CDK-4의 경우도 친환경 배 추출물 처리 시 현저하게 증가하는 것으로 나타났으며 세포성장 억제 단백질인 p21WAF1/Cip1 및 p27 Kip1의 경우는 억제시키는 것으로 나타났다.
Sprague-Dawley 랫트(실험용 쥐)에서 간을 적출하여 Collagen coating된 세포 배양 접시에 간세포 배양을 하여 친환경 재배 배 추출물과 일반 관행 재배 배 추출물의 간세포 기능성을 분석하였다. 3일간 적응 시킨 후 관행 재배 배 추출물과 친환경 재배 배 추출물을 농도 별(동결 건조된 $5\;{\mu}g/ml$, $20\;{\mu}g/ml$, $40\;{\mu}g/ml$) 처리하여 간세포의 에너지원인 ATP assay를 실시한 결과 관행 재배 배 추출물의 경우는 대조군과 유의한 차이는 인정이 되지 않았으나 친환경 재배 배 추출물의 경우 농도 의존적으로 정상군에 비해 180%까지 증가하는 것으로 나타났다. 한편 세포 성장의 경우도 DNA의 특유 염기 구성성분중의 하나인 thymine의 전구체인 $[^3H]$-thymidine을 간세포에 처리하여 DNA 합성을 알아본 결과 친환경 재배 배 추출물 을 농도별로 처리하였을 때 관행재배 배 추출물에 비해 간세포의 세포 성장율이 증가하는 것으로 나타났다($40\;{\mu}g/ml$ 투여 시 관행 재배 배추출물 112% vs. 친환경 재배 배 추출물은 234%; p<0.05). 아울러 세포성장 단백질인 CDK-2, CDK-4의 경우도 친환경 배 추출물 처리 시 현저하게 증가하는 것으로 나타났으며 세포성장 억제 단백질인 p21WAF1/Cip1 및 p27 Kip1의 경우는 억제시키는 것으로 나타났다.
In the present study, we compared the functional analysis of pear extracts cultured in conventional and environment-friendly conditions in primary cultured rat hepatocytes. ATP synthesis significantly increased by the treatment with environment friendly cultured pear powder but not by conventional g...
In the present study, we compared the functional analysis of pear extracts cultured in conventional and environment-friendly conditions in primary cultured rat hepatocytes. ATP synthesis significantly increased by the treatment with environment friendly cultured pear powder but not by conventional group. In addition, cell proliferation using $[^3H]$-thymidine incorporation was also stimulated by environment-friendly cultured pear extract compared to conventional group. Moreover, the expressions of CDK-2 and CDK-4 were increased but p21WAF1/Cip1 and p27 Kip1 decreased by environment-friendly cultured pear extract but not by conventional group. In conclusion, environment-friendly cultured pear powder has stimulatory effect on cell proliferation compared to conventional group in primary cultured rat hepatocytes.
In the present study, we compared the functional analysis of pear extracts cultured in conventional and environment-friendly conditions in primary cultured rat hepatocytes. ATP synthesis significantly increased by the treatment with environment friendly cultured pear powder but not by conventional group. In addition, cell proliferation using $[^3H]$-thymidine incorporation was also stimulated by environment-friendly cultured pear extract compared to conventional group. Moreover, the expressions of CDK-2 and CDK-4 were increased but p21WAF1/Cip1 and p27 Kip1 decreased by environment-friendly cultured pear extract but not by conventional group. In conclusion, environment-friendly cultured pear powder has stimulatory effect on cell proliferation compared to conventional group in primary cultured rat hepatocytes.
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문제 정의
주기조절 단백질의 발현 효과. Thevananther 등 저)은 세포 외의 ATP 처리 시간세포의 성장을 증가시켰다고 하여 본 실험에서 친환경 재배 배 추출물처리 시 나타났던 ATP 증가 현, 상이 세포성장과 관련이 되는지를 알아보았다.간세포 성장에 미치는 효과를 알아보기 위하여 관행재배 및 친환경 재배 배추출물을 처리한 결과 5ug/ml투여했을 경우 아무것도 처리하지 않는 간세포 성장을 기준으로 관행재재 배 주줄물은 103%, 친환경 재배 배 추출물은 125%, 10ug/ml 투여했을경우 관행재배 배추출물은 110%, 친환경 재배 배 추출물은 174%, 20투여했을 경우 관행재배 배 추출물 107%, 친환경 재배 배 추출물은 220%, 40 ug/ml씩 투여했을 경우 관행 재배 배 추출물은 112%였는데 비해 친환경 재배 배 추출물은 234%까지 간세포 성장을 증가시켰다(Fig.
현재까지, 국내적으로는 물론 국제적으로 친환경 농산물의 생물학적 평가지표에 대한 연구는 극히 미미한 실정에 있다. 따라서 본 연구는 친환경(키틴 분해 농산물) 배와 일반 관행재배 사이의 간세포 성장 및 이와 관련된 단백질의 발현에 대해서 비교 분석하여 친환경 농산물의 우월성을 알아보고자 하였다.
제안 방법
ATP hygine monitoring kits(Promega, USA) 를구매하여 제조회사의 지시사항에 따라 실험을 행하였다. 100 B negative control을 tube에 취한 후 100μl extractant을 첨가한 후 바로 luminometer(LS-50B, Perkin-Elmer, Boston, MA)로 luminescence를 측정하였다. Negative control의 값은 50RLU 이하, positive control의 값은 20, 000 RLU 이상인 경우에 실험을 실시하였다.
세포를 혈정이 없는 배지로 희석하여 대략 200-2,000 cells/mZ 되도록 한다. 1ml의 현탁된 세포와 4 ml의 0.4% trypan blue 용액을 혼합하여 5분간 정치한 후 hemocytometer를 사용하여 염색되지 않은 생세포 수와 염색된 사세포의 수를 측정하여 생존율을 계산하였다. Trypan blue 에 염색된 세포는 죽은 세포로 간주하며 trypan blue 저항성을 나타내는 세포를 살아있는 세포로 간주하였다.
ATP assay. ATP hygine monitoring kits(Promega, USA) 를구매하여 제조회사의 지시사항에 따라 실험을 행하였다. 100 B negative control을 tube에 취한 후 100μl extractant을 첨가한 후 바로 luminometer(LS-50B, Perkin-Elmer, Boston, MA)로 luminescence를 측정하였다.
균질화된 세포를 tube에 옮긴 후, 15,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상층액을 새로운 tube에 저장하였다. Bradford 단백질 정량법을 이용하여 각각 60 ug의 sample들을 8% SDS-PAGE 전기영동을 시킨 후, polyvinylidine difluoride membrane에 transfer하였다. Membranee 5% skim milk에 1 시간 동안 blocking을 시켰고, 각각의 항체(anti-CDK-2.
Sprague-Dawley 랫트(실험용 쥐)에서 간을 적출하여 Collagen coating된 세포 배양 접시에 간세포배양을 하여 친환경 재배배 추출물과 일반 관행 재배 배추출물의 간세포 기능성을 분석하였다. 3일간 적응시킨 후 관행 재배 배 추출물과 친환경 재배 배 추출물을 농도별(동결 건조된 5 ug/ml, 20 ug/ml, 40 ug/ml) 처리하여 간세포의 에너지원인 ATP assay를 실시한 결과 관행 재배 배추출물의 경우는 대조군과 유의한 차이는 인정이 되지 않았으나 친환경 재배 배추출물의 경우 농도 의존적으로 정상군에 비해 180%까지 증가하는 것으로 나타났다.
미치는 영향.간세포의 생존율에 미치는 영향을 알아보기 위하여 친환경 재배추출물 및 관행 재배 배 추출물을 4 시간 동안 농도별(5, 10, 20, 40ug/ml)로 처리하여 trypan blue exclusion test를 실시하였다. 실험 결과 양군 모두에 서 대조군과 유의성 있는 차이는 인정되지 않는 것으로 나타났다(Table 1).
본 실험에서 사용한 친환경 재배배는 키틴 분해 미생물제제로 재배한 무 농약 배로서 조호현씨(영암군 덕진면)로부터 구입하였으며 관행 재배 배의 경우는 일반농약을 처리하여 키운 배를 이용하였다. 배를 세절하여 믹서에 갈고난 부분을 동결 건조기를 이용하여 powder 부분만 을 추출하였다. [3H]-thymidinee Dupont/NEN (Boston, MA, USA)으로부터 구입하였다.
이후 5% TCA를 5분간 2번 세척을 하였다. 산에 불용성인 부분을 실온에서 2N NaOH를 처리하여 Liquid scintillation counting] 의하여 방사성을 측정하였다. 실험 결과는 대조군(어떠한 시료도 첨가하지 않은 군)의 %로 보정하였다.
27). 이러한 친환경 재배 배추출물에 의한 배의 간 세포 성장이 세포성장 주기에 관여하는 어떠한 단백질의 발현과 관련되는지를 알아보기 위하여 CDK-2 및 CDK-4의 발현을 살펴보았다. 관행재배 배 추출물(10 ug/ml, 40ug/ml, 4시간) 처리 시 CDK-2 및 CDK-4의 발현은 대조군과 유의한 차이는 인정되지 않았으나 친환경 재배 배추출물(10ug/ml, 40 ug/ml, 4시간) 처리 시 대 조군에 비해 현저한 발현 증가 작용을 보였다 (Fig.
본 실험 결과는 이러한 배의 성분들 중에는 세포독성을 나타내는 성분을 갖고 있지 않기 때문으로 판단된다. 한편 친환경 재배추출물 및 관행 재배배 추출물에 의한 간세포 ATP 합성효과를 알아보았다. Fig.
대상 데이터
재료. Dulbecco's Modified Ease's Medium(D-MEM)/Ham, s nutrient mixture F-12(D-MEM/F-12)와 Class IV collagenase는 Life Technologies(Grand Island, NY, USA)로부터 구입하였다. 본 실험에서 사용한 친환경 재배배는 키틴 분해 미생물제제로 재배한 무 농약 배로서 조호현씨(영암군 덕진면)로부터 구입하였으며 관행 재배 배의 경우는 일반농약을 처리하여 키운 배를 이용하였다.
배를 세절하여 믹서에 갈고난 부분을 동결 건조기를 이용하여 powder 부분만 을 추출하였다. [3H]-thymidinee Dupont/NEN (Boston, MA, USA)으로부터 구입하였다.
Hepatocyte의 초대 배양. 간세포는 수컷 200-250 g의 Sprague-Dawley 랫트(Charles River Laboratories)# 이용하여 분리하였다. Liu 등⑹에 의해 발표된 두 단계의 Collagenase 관류 방법이 이용되었다.
실험 결과 양군 모두에 서 대조군과 유의성 있는 차이는 인정되지 않는 것으로 나타났다(Table 1). 본 실험에서 사용한 친환경 재배 배의 경우는 관행 농약 대신 키틴 분해 미생물 첨가키틴 퇴비 사용을 통하여 재배한 배를 사용하였다18). 이는 토양길항 미생물과 유기자재를 적절하게 이용한 방법이 토마토 및 다양한 농산물에 있어서 효율적인 친환경 농법의 대안으로 제시되고 있는 실정을19) 감안할 때 전혀 세포 독성이 없는 것으로 사료된다.
Dulbecco's Modified Ease's Medium(D-MEM)/Ham, s nutrient mixture F-12(D-MEM/F-12)와 Class IV collagenase는 Life Technologies(Grand Island, NY, USA)로부터 구입하였다. 본 실험에서 사용한 친환경 재배배는 키틴 분해 미생물제제로 재배한 무 농약 배로서 조호현씨(영암군 덕진면)로부터 구입하였으며 관행 재배 배의 경우는 일반농약을 처리하여 키운 배를 이용하였다. 배를 세절하여 믹서에 갈고난 부분을 동결 건조기를 이용하여 powder 부분만 을 추출하였다.
데이터처리
통계처리. 실험 결과의 통계처리는 Student's t-test 및 Analysis of Variance(ANOVA)로 하였으며, p<0.05를 유의한 차이의 한계로 하였고, 실험 결과의 표현은 means ± S.E로 하였다.
이론/모형
간세포는 수컷 200-250 g의 Sprague-Dawley 랫트(Charles River Laboratories)# 이용하여 분리하였다. Liu 등⑹에 의해 발표된 두 단계의 Collagenase 관류 방법이 이용되었다. 간단히 기술하면 isoflurane/O2 마취를 시도한후 복 정중선을 따라 개복을 실시한다.
간 세포들이 50-60% 성장하여 subconflent를 형성하였을 때, 배지를 교환하였다. [3H]-thymidine incorporation 실험은 Brete 등17)에 의해 기술된 대로 실시하였다. 세포들에 1 μCi의 [3H]-thymidineg-투여 후 2시간 후에 시료를 처리하여 24시간 배양시킨 후 실험에 사용하였다.
세포 수는 5 X 105 정도의 세포로 배양시킨다. 세포의 생존율은 Trypan blue exclusion 방법을 이용하여 실시하였으며 생존율이 90%가 넘는 경우에만 실험에 사용하였다.
성능/효과
3일간 적응시킨 후 관행 재배 배 추출물과 친환경 재배 배 추출물을 농도별(동결 건조된 5 ug/ml, 20 ug/ml, 40 ug/ml) 처리하여 간세포의 에너지원인 ATP assay를 실시한 결과 관행 재배 배추출물의 경우는 대조군과 유의한 차이는 인정이 되지 않았으나 친환경 재배 배추출물의 경우 농도 의존적으로 정상군에 비해 180%까지 증가하는 것으로 나타났다. 한편 세포 성장의 경우도 DNA의 특유염기 구성성분 중의 하나인 thymine의 전구체인[W-thymidine을 간세포에 처리하여 DNA 합성을 알아본 결과 친환경 재배 배 추출물 을 농도별로 처리하였을 때 관행재배 배추출물에 비해 간세포의 세포 성장율이 증가하는 것으로 나타났다(40 ug/ml 투여시 관행 재배 배추출물 112% vs.
한편 친환경 재배추출물 및 관행 재배배 추출물에 의한 간세포 ATP 합성효과를 알아보았다. Fig. 1 에서 보이듯이 관행재배 배를 농도별로 처리하여 ATP 생성율을 측정한 결과 대조군과 별 차이 없었으나 친환경 재배 배추출물에서는 180%까지 증가한 것으로 나타났다(Fig. 1; p<0.05 vs. 대조군).지금까지 ATP는 세포에서 에너지원으로만 알려져 왔다 21).
Thevananther 등 저)은 세포 외의 ATP 처리 시간세포의 성장을 증가시켰다고 하여 본 실험에서 친환경 재배 배 추출물처리 시 나타났던 ATP 증가 현, 상이 세포성장과 관련이 되는지를 알아보았다.간세포 성장에 미치는 효과를 알아보기 위하여 관행재배 및 친환경 재배 배추출물을 처리한 결과 5ug/ml투여했을 경우 아무것도 처리하지 않는 간세포 성장을 기준으로 관행재재 배 주줄물은 103%, 친환경 재배 배 추출물은 125%, 10ug/ml 투여했을경우 관행재배 배추출물은 110%, 친환경 재배 배 추출물은 174%, 20투여했을 경우 관행재배 배 추출물 107%, 친환경 재배 배 추출물은 220%, 40 ug/ml씩 투여했을 경우 관행 재배 배 추출물은 112%였는데 비해 친환경 재배 배 추출물은 234%까지 간세포 성장을 증가시켰다(Fig. 2).이러한 결과들은 친환경 재배 배 추출물처리 시간 세포 ATP 생성이 세포 성장을 증가시킨다는 것을 시사해주고 있다.
이러한 친환경 재배 배추출물에 의한 배의 간 세포 성장이 세포성장 주기에 관여하는 어떠한 단백질의 발현과 관련되는지를 알아보기 위하여 CDK-2 및 CDK-4의 발현을 살펴보았다. 관행재배 배 추출물(10 ug/ml, 40ug/ml, 4시간) 처리 시 CDK-2 및 CDK-4의 발현은 대조군과 유의한 차이는 인정되지 않았으나 친환경 재배 배추출물(10ug/ml, 40 ug/ml, 4시간) 처리 시 대 조군에 비해 현저한 발현 증가 작용을 보였다 (Fig. 3). 나아가 무농약 배처리 시 p21WAFl/Cipl 및 p27 Kiple 감소하는 것으로 나타났다.
간세포의 생존율에 미치는 영향을 알아보기 위하여 친환경 재배추출물 및 관행 재배 배 추출물을 4 시간 동안 농도별(5, 10, 20, 40ug/ml)로 처리하여 trypan blue exclusion test를 실시하였다. 실험 결과 양군 모두에 서 대조군과 유의성 있는 차이는 인정되지 않는 것으로 나타났다(Table 1). 본 실험에서 사용한 친환경 재배 배의 경우는 관행 농약 대신 키틴 분해 미생물 첨가키틴 퇴비 사용을 통하여 재배한 배를 사용하였다18).
05). 아울러 세포성장단백질인 CDK-2, CDK4의 경우도 친환경 배추출물 처리시 현저하게 증가하는 것으로 나타났으며 세포 성장 억제 단백질인 p21WAFl/Cipl 및p27 Kipl의 경우는 억제시키는 것으로 나타났다.
3일간 적응시킨 후 관행 재배 배 추출물과 친환경 재배 배 추출물을 농도별(동결 건조된 5 ug/ml, 20 ug/ml, 40 ug/ml) 처리하여 간세포의 에너지원인 ATP assay를 실시한 결과 관행 재배 배추출물의 경우는 대조군과 유의한 차이는 인정이 되지 않았으나 친환경 재배 배추출물의 경우 농도 의존적으로 정상군에 비해 180%까지 증가하는 것으로 나타났다. 한편 세포 성장의 경우도 DNA의 특유염기 구성성분 중의 하나인 thymine의 전구체인[W-thymidine을 간세포에 처리하여 DNA 합성을 알아본 결과 친환경 재배 배 추출물 을 농도별로 처리하였을 때 관행재배 배추출물에 비해 간세포의 세포 성장율이 증가하는 것으로 나타났다(40 ug/ml 투여시 관행 재배 배추출물 112% vs. 친환경 재배 배추출물은 234%; p<0.05). 아울러 세포성장단백질인 CDK-2, CDK4의 경우도 친환경 배추출물 처리시 현저하게 증가하는 것으로 나타났으며 세포 성장 억제 단백질인 p21WAFl/Cipl 및p27 Kipl의 경우는 억제시키는 것으로 나타났다.
후속연구
세포 성장주기에 억제적으로 작용하는 세포성장 단백질로는 cyclin kinase inhibitors (CKI) 를들 수 있다 12). p21WAFl/Cipl 및p27 Kiple CKI의 CIP/KIP family 중의 하나로서 G1에서 S기로의 이동에 활성형인 cyclin-CDK 복합체의 조절에 억제적으로 작용하여 세포 성장주기에 관여 한다배에 대한 간세포의 성장연구 및 이와 관련된 세포 성장조절 단백질의 발현 정도에 대한 연구는 간 기능의 중요성 및 농산물의 우수성을 부여할 수 있을 것으로 판단된다. 현재까지, 국내적으로는 물론 국제적으로 친환경 농산물의 생물학적 평가지표에 대한 연구는 극히 미미한 실정에 있다.
이러한 결과들은 친환경 재배 배 추출물처리 시간 세포 ATP 생성이 세포 성장을 증가시킨다는 것을 시사해주고 있다.본 실험 결과로서는 친환경 재배 추출물의 어떠한 성분이 간세포의 ATP 생성 및 세포성장을 증가시키는지를 확인할 수가 없었다. 이에 대한 부분은 여러 가지 가능성이 있겠지만 농약 또는 키틴분해 미생물에 의해 생성된 토양의 변화 등에 의한 중금속 같은 미량원소의 차이의 경우도 가능성을 볼 수 있다.
예를 들어 selenium 같은 미량원소는 환경친화적인 조건인적은 농도에서는 포유동물 및 인간의 세포에 유익 하나 농도가 높아지면 해로운 작용을 나타내고25) 친환경 제제물질 사용 시 수은과 같은 세포 내 독성물질을 제거할 수 있다고 보고26)되어 그 가능성이 있을 수 있음을 말해주고 있다. 하지만 이것은 어디까지나 가능성에 대한 부분으로 향후 친환경 재배 배의 물질 분석을 통한 간세포 성장 촉진 효과를 나타내는 물질 규명이 필요하리라 생각된다. 세포의 성장에 관련된 단백질로는 cyclin 과 cyclin-dependent kinase(CDK)들이 세포 성장주기를 족진 시키는 역할을 담당하고 있으며 세포 성장주기를 억제적으로 작용하는 p21W.
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